微波輔助提取杜仲葉總黃酮工藝優(yōu)化

劉桂萍，崔博籍，孫久陽，高香蓮

（沈陽化工大學 制藥與生物工程學院，沈陽 110142）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）是杜仲屬植物，是我國特有的一種雌雄異株的落葉喬木，自成一科一屬。近20年的研究表明，杜仲葉與杜仲樹皮化學成分，尤其是有效成分基本一致，甚至某些重要有效成分（如總黃酮）的含量還高于杜仲樹皮。杜仲葉中含木質(zhì)素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮、多糖和微量元素等多種活性成分[1-4]。研究表明，在生物體內(nèi)黃酮類化合物具有明顯的抗菌、抗氧化、降血脂、抗衰老、抗癌防癌及調(diào)節(jié)免疫功能[5-8]。隨著環(huán)境的不斷改善，杜仲作為綠化樹種也得到了廣泛栽培。因此，如何有效利用杜仲資源、從大自然中獲取天然黃酮類化合物就成為研究熱點。

杜仲葉總黃酮的提取主要為水提或醇提法，考慮到該法提取時間長，提取率較低等缺點，采用微波輔助或超聲波輔助水提、醇提的方式提取[9-13]。因為微波可直接作用于分子，使分子的熱運動加劇，從而引起溫度升高。微波的這種熱效應使其穿透到介質(zhì)內(nèi)部，可以快速破壞細胞壁，使中草藥中的有效成分更快的分離提取出來[14-16]。為此，本研究以杜仲葉干粉末為原料，用微波輔助水提法提取杜仲葉中總黃酮化合物，探討微波作用對杜仲葉中總黃酮化合物提取效率的影響，確定其最佳提取工藝條件，以期為更好地開發(fā)和利用杜仲葉資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

FA-1004電子天平：上海精科天平廠；UV1100紫外/可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；TD5A臺式低速離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；40目標準檢驗篩：浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；G80F20CN2L-B8（R0）微波爐：廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杜仲葉中總黃酮的提取

將采集的杜仲葉放在避光處陰干，粉碎，過40目篩子，稱取篩下物粉末1.0 g于燒杯中，按照一定料液比加入溶劑蒸餾水，放入微波爐中在一定功率條件下提取一定時間，提取兩次，離心取上清液，合并提取液定容至100 mL，備用。

1.3.2 蘆丁標準曲線的制作及總黃酮含量測定[12]

準確稱取3.0 mg干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標準品，溶解于體積分數(shù)為30%的乙醇溶液中，用50 mL容量瓶定容，配制成質(zhì)量濃度為60 μg/mL的蘆丁標準溶液。分別精密吸取蘆丁標準溶液0、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于試管中，加體積分數(shù)為30%的乙醇溶液補足至10.00 mL，加5%NaNO2溶液0.75 mL，搖勻，靜置5 min，再加10%Al（NO3）3溶液0.75 mL，搖勻，靜置5 min，再加4%NaOH 6.00 mL，搖勻，靜置5 min，各管再用體積分數(shù)為30%的乙醇溶液稀釋至20 mL，搖勻，靜置10 min，測定波長510 nm處的吸光度值，同時做4 組平行試驗。另取10 mL 30%乙醇溶液，同法操作為空白對照。以蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，以波長510 nm處的吸光度值（A）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，得到蘆丁標準曲線的回歸方程為A=19C+0.008 1（相關系數(shù)為R2=0.998 9）。

樣品中總黃酮含量測定方法同上。總黃酮提取率計算公式如下：

式中：X為總黃酮提取率，%；C為根據(jù)標準曲線計算所得的總黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液的換算總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 提取工藝優(yōu)化正交試驗設計

比如在教學《The environment》一課時，我先將其中重點單詞和短語的教學過程錄制下來，讓學生們在課前進行觀看學習，對教學中“environmentalist”“preservation”“poisonous”“pol lution”等需要掌握的詞匯有大致的了解，然后在課堂中將更多的時間放在學生的英語閱讀能力和表達能力的訓練上，使學生不僅能記住英語知識，還能夠靈活地運用英語知識。

根據(jù)單因素試驗所得結(jié)果，選取微波功率、提取時間、料液比、提取次數(shù)4個因素為正交試驗的影響因素，以總黃酮提取率作為評價指標，設計4因素3水平的L9（34）正交試驗。微波法提取總黃酮正交試驗因素與水平見表1。

表1 提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 微波提取時間對總黃酮提取率的影響

在微波功率480 W、料液比1∶20（g∶mL）條件下提取2次，考察微波提取時間（1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min、3.0 min）對杜仲葉中總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，隨著微波時間的延長，總黃酮提取率先增大，達到2 min時總黃酮提取率最大，隨后再延長時間總黃酮含量減小。這是由于杜仲葉中總黃酮溶出需要一定時間，溶解度到達飽和時，有效成分不再溶出，再延長時間，總黃酮成分發(fā)生分解，也有可能是時間過長導致的溫度升高使蛋白質(zhì)變性影響總黃酮的溶出。由此確定最佳的微波提取時間為2 min。

圖1 微波提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of microwave time on total flavonoids yield

2.2 料液比對總黃酮提取率的影響

在微波功率480 W條件下提取2 min，浸提兩次，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）對杜仲葉中總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids yield

由圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，增加溶劑的量有助于總黃酮的溶出，當料液比達到1∶20（g∶mL）時，總黃酮提取率最大，此后總黃酮提取率隨著溶劑用量的增大反而下降。其原因可能是溶劑對微波能的吸收增加，使得滲透到細胞內(nèi)的溶劑氣化不充分，物料溫度低，細胞結(jié)構破壞不夠，因而提取率下降[5]。綜合成本考慮，料液比選擇1∶20（g∶mL）較為適宜。

2.3 微波功率對總黃酮提取率的影響

在料液比為1∶20（g∶mL）提取2 min，浸提兩次，考察微波功率（160 W、320 W、480 W、640 W、800 W）對杜仲葉中總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，總黃酮提取率隨著微波功率增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在微波功率在160～320 W之間時，總黃酮提取率呈增大趨勢，且增加幅度大，這是因為功率大，分子運動速率快，物質(zhì)滲透、擴散和溶解速度加快，使總黃酮溶出較多。當微波功率＞320 W時，總黃酮提取率值呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是微波功率過高，會導致提取液溫度過高，造成杜仲葉中總黃酮降解所致。由此確定最佳微波功率為320 W。

圖3 微波功率對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave power on total flavonoids yield

2.4 微波提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響

在微波功率為320 W，料液比為1∶20（g∶mL）條件下提取2 min，考察提取次數(shù)1、2、3、4、5對杜仲葉中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on total flavonoids yield

由圖4可以看出，隨著提取次數(shù)的增加總黃酮提取率逐漸增加。當提取次數(shù)由2次增加到3次時，總黃酮提取率變化最為明顯。當提取次數(shù)＞3次時，總黃酮提取增加趨勢逐漸平緩，表明樣品中總黃酮基本已經(jīng)提取出來。由此確定最佳提取次數(shù)為3次。

2.5 提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗基礎上，以總黃酮提取率作為評價指標，微波功率、提取時間、料液比、提取次數(shù)為考察因素進行正交試驗，結(jié)果與分析見表2，其方差分析見表3。

由表2可以看出，影響總黃酮提取率的4個因素中，影響大小順序依次為B＞C＞D＞A，即料液比＞微波功率＞提取次數(shù)＞提取時間。微波輔助提取杜仲葉中總黃酮最佳工藝參數(shù)為A3B3C2D2，即料液比1∶25（g∶mL），微波功率320 W，提取時間2.5 min，提取3次。按照最佳工藝條件進行驗證試驗，測得總黃酮平均提取率為8.7%。

表2 提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3正交試驗方差分析表明，料液比（B）、微波提取功率（C）兩個因素對杜仲葉中總黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05），而微波時間（A）及提取次數(shù)（D）對結(jié)果無顯著影響（P＞0.05）。

2.6 微波輔助水提法與常規(guī)水提法和超聲波輔助水提法的比較

按照常規(guī)浸提方法和超聲波輔助水提法[12]，以水為溶劑提取杜仲葉中總黃酮，得到常規(guī)提取法最優(yōu)條件為料液比1∶30（g∶mL），提取溫度70 ℃，提取時間90 min，提取次數(shù)3次，該條件下總黃酮提取率為7.49%；超聲波輔助提取最優(yōu)條件為料液比1∶35（g∶mL），超聲波功率80 W，提取溫度50 ℃，提取時間20 min，提取2次，該條件下總黃酮的提取率為8.45%。常規(guī)浸提方法和超聲波輔助水提法均低于微波輔助提取法的總黃酮提取率（8.7%），表明微波輔助提取法在效果和能耗上略好于超聲波輔助提取法而明顯優(yōu)于常規(guī)提取法，且大大縮短了提取時間，減少了能耗的同時提高了效率。

3 結(jié)論

微波輔助水提取杜仲葉中總黃酮工藝最佳參數(shù)為料液比1∶25（g∶mL），微波功率320 W，提取時間2.5 min，提取3次，在此條件下其總黃酮提取率可達8.7%。影響杜仲葉總黃酮提取效果各因素的主次順序為料液比＞微波功率＞提取次數(shù)＞提取時間，方差分析表明，提取杜仲葉中總黃酮工藝中應關鍵控制料液比和微波功率。與常規(guī)提取法相比，微波輔助提取法能耗低效率高。所以采用微波輔助提取法提取杜仲葉中黃酮總化合物是可行的。

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