大鼠在體腸吸收杜仲中幾種成分的特征研究

侯靖宇，潘　潔，謝玉敏，陳鵬程，王永林，王愛民

(貴陽醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點實驗室、2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽　550004)

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大鼠在體腸吸收杜仲中幾種成分的特征研究

侯靖宇1，潘潔1，謝玉敏1，陳鵬程1，王永林1，王愛民2

(貴陽醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點實驗室、2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004)

Characteristics of rat’s intestinal absorption of several components from Eucommia ulmoides

HOU Jing-yu1，PAN Jie1，XIE Yu-min1，CHEN Pengcheng1，WANG Yong-lin1，WANG Ai-min2
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，School of Pharmacy，2.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China)

Key words:Eucommia ulmoides; in situ intestinal perfusion model; UPLC-MS/MS; pH value; bile; intestinal absorption

杜仲為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮，其味甘，性溫，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，為國家二級珍稀樹種，是傳統(tǒng)名貴滋補藥材。有補肝腎、強筋骨、安胎等功效，主要用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈?zāi)垦！⑷焉锫┭?、胎動不安等疾病?－3］。

課題組在前期工作中采用Caco-2細胞模型研究杜仲提取物的攝取機制以及不同因素影響下杜仲提取物的攝取特點［2］。本文進一步采用大鼠在體腸循環(huán)灌流模型［4］，以原兒茶酸、松脂醇單葡萄糖苷和松脂醇二葡萄糖苷為考察對象，對杜仲提取物的腸吸收特性進行研究，并探討其在不同因素影響下的腸吸收動力學(xué)特征，為杜仲的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供必要的科學(xué)依據(jù)。

1　材料

1.1儀器與試藥超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司) ; ZH-2渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠) ; Allegra 64R高速離心機(美國Beckman Coulter公司) ; MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司) ; EL204電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司) ; HL-2S蠕動泵(上海青浦滬西儀器廠) ; DK-98-ⅡA恒溫水裕鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

葛根素(內(nèi)標(biāo)，批號:111-0906623，中國藥品生物制品鑒定所) ;原兒茶酸(批號:110306，四川省維克奇生物科技有限公司) ;松脂醇二葡萄糖苷(批號:201206，上海順勃生物工程有限公司) ;松脂醇單葡萄糖苷(批號:201206，江蘇弘惠醫(yī)藥有限公司) ;烏拉坦(上海行知化工廠) ;鹽酸維拉帕米(阿拉丁) ;杜仲提取物(自制，批號: 20130823) ;甲醇、乙腈為色譜純; Krebs-Ringer’s(K-R)營養(yǎng)液(NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g及MgCl20.02 g，加500 mL蒸餾水溶解，0.37 g CaCl2、葡萄糖1.4 g溶于500 mL蒸餾水，兩者混勻即可)。

1.2動物健康SD大鼠(♀♂各半)，體質(zhì)量200～240 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心提供。批號: SCXK(黔) 2014－0003。

2　方法

2.1色譜條件色譜柱: Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱，流動相:0.1%甲酸乙腈(A)－0.1%甲酸水(B)，梯度為0～0.5 min: 5%～10% (A)，0.5～3.5 min: 10%～20% (A)，3.5～4 min: 20%～90% (A)，4～5 min: 90%～5%(A) ;流速: 0.30 mL·min－1;柱溫: 45℃;進樣體積:1 μL。

2.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)，毛細管電壓:3 kV，離子源溫度120℃;噴霧氣與反吹氣: N2，去溶劑氣流速650 L ·h－1，溫度350℃;反吹氣流速50 L·h－1;掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)。原兒茶酸: m/z(－) 152.9→109、松脂醇二葡萄糖苷: m/z(－) 681.3→357.2、松脂醇單葡萄糖苷: m/z(－) 519.3→357.2及葛根素: m/z(+ ) 417→267。

2.3供試藥液的制備取適量杜仲提取物，加入適量K-R營養(yǎng)液，超聲使溶解，10 000 r·min－1離心5 min，取上清液備用，獲得2.0、4.0、8.0 mg·L－1的供試液。

2.4在體腸吸收實驗參照文獻［5－6］，本實驗據(jù)其具體內(nèi)容并進行適當(dāng)修改，對大鼠麻醉后固定進行手術(shù)，取50 mL腸循環(huán)液以5 mL·min－1流速循環(huán)10 min，再以2.5 mL· min－1的速度繼續(xù)回流，立即讀出循環(huán)液體積并取樣1 mL，另向量筒中補加K-R緩沖液1 mL，其后每隔30 min亦按同法讀數(shù)，取樣并補加等體積K-R緩沖液，循環(huán)3 h后中止。取腸灌流樣品溶液100μL，加20μL20.03mg·L－1內(nèi)標(biāo)溶液，400 μL甲醇及100 μL 0.1%的甲酸，渦混1 min，15 000 r ·min－1離心5 min，取上清液進樣UPLC-MS/MS分析。

2.5統(tǒng)計學(xué)分析同參考文獻［6］

3　結(jié)果

3.1不同pH值及濃度的考察對3個成分在不同pH條件及不同濃度下累計吸收常數(shù)(A)進行方差分析比較，pH=6.0時，各成分的3 h累計吸收量相對較高。原兒茶酸在低濃度時A%明顯高于中、高濃度(P＜0.05)，松脂醇單葡萄糖苷在中濃度時A%明顯低于高濃度(P＜0.05) ;提示其在體內(nèi)的吸收機制可能為被動吸收，見Tab 1、2。

3.2膽汁及P-gp抑制劑對3種成分吸收的影響3種成分在結(jié)扎膽管及維拉帕米抑制P-gp條件下的累計吸收常數(shù)(A)經(jīng)方差分析，表明膽汁對3種成分的吸收均具有抑制作用(P＜0.05)，加入P-gp抑制劑后原兒茶酸吸收明顯增加(P＜0.05)，結(jié)果見Tab 3。

3.3不同腸段中3個成分的累計吸收常數(shù)(A)和Ka比較

對3個成分在不同腸段的累計吸收常數(shù)(A)進行方差分析，原兒茶酸在空腸的累積吸收量較回腸大(P＜0.05)。3種成分在不同腸段的吸收趨勢，原兒茶酸:空腸＞回腸＞十二指腸＞結(jié)腸;松脂醇二葡萄糖苷:回腸＞空腸＞十二指腸＞結(jié)腸;松脂醇單葡萄糖苷:十二指腸＞回腸＞空腸＞結(jié)腸。見Tab 4。

Tab 1 A% and Ka of three components in different pH values±s，n=4)

Tab 1 A% and Ka of three components in different pH values±s，n=4)

A%:*P＜0.05 vs pH 7.4

Group pH=7.4pH=6.86pH=6.0pH=5.0 A%　KaA%　KaA%　KaA%　Ka Protocatechuic acid　31.9±2.2 0.10±0.02　38.2±14.1　0.15±0.07　44.6±3.8　0.19±0.08　40.4±4.90.17±0.04 Pinoresinol diglucoside　23.8±3.2 0.06±0.04　20.7±1.8　0.06±0.02　24.2±4.3　0.07±0.02　29.7±3.2*0.11±0.05 Pinoresinol singleglucoside　33.0±3.6 0.12±0.02　23.6±3.3*　0.10±0.05　28.7±7.2　0.09±0.03　31.7±4.4　0.13±0.04

Tab 2 A% and Ka of three components in different concentrations (珋±s，n=4)

Tab 2 A% and Ka of three components in different concentrations (珋±s，n=4)

Ka:*P＜0.05 vs high concentration; A%:△P＜0.05 vs high concentration;#P＜0.05 vs low concentration

2.0 mg·L－14.0 mg·L－18.0 mg·L－1Group　A%　Ka A%　Ka A%　Ka Protocatechuic acid　52.6±6.9　0.21±0.05*　50.1±2.4#　0.26±0.05　45.0±7.3#0.21±0.06 Pinoresinol diglucoside　29.3±5.5　0.10±0.01*　32.3±4.1　0.13±0.02　32.1±1.0　0.13±0.03*Pinoresinol singleglucoside　27.6±3.8　0.11±0.03　51.7±7.8#△　0.23±0.06　49.7±5.1　0.20±0.04*

Tab 3 A% and Ka of three components with ligation of the bile duct and addition of verapamil(珋±s，n=4)

Tab 3 A% and Ka of three components with ligation of the bile duct and addition of verapamil(珋±s，n=4)

Ka:*P＜0.05 vs control group; A%:△P＜0.05 vs control group;

Group ControlBile duct ligatedP-gp inhibitors A%　KaA%　KaA%　Ka Protocatechuic acid　25.1±2.8　0.062±0.031　50.1±2.4△　0.262±0.052*　51.9±2.8△　0.251±0.017*Pinoresinol diglucoside　29.1±4.6　0.059±0.009　32.3±4.1　0.127±0.020　31.1±1.8　0.085±0.010 Pinoresinol singleglucoside　32.3±4.5　0.095±0.034　51.7±7.8△　0.230±0.061*31.1±2.9　0.108±0.012

Tab 4 A% and Ka of three components at various intestinal segments (珋±s，n=4)

Tab 4 A% and Ka of three components at various intestinal segments (珋±s，n=4)

Ka:*P＜0.05 vs colon; A%:#P＜0.05 vs ileum

Group DuodenumJejunumIleumColon A%　KaA%　KaA%　KaA%　Ka Protocatechuic acid　37.6±10.7　0.18±0.06　55.6±3.6#　0.23±0.04*43.4±5.6　0.18±0.01　33.1±4.0 0.13±0.03 Pinoresinol diglucoside　20.3±2.5　0.10±0.01　22.4±9.9　0.08±0.04　31.4±3.5　0.07±0.03　17.6±7.1 0.04±0.02 Pinoresinol singleglucoside　24.0±2.5　0.09±0.01　17.7±8.5　0.05±0.02　23.4±0.5　0.07±0.01　12.5±6.3 0.03±0.02

4　討論

本實驗研究表明，原兒茶酸、松脂醇單葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷在小腸均有吸收，膽汁對3種成分的吸收存在抑制作用，原兒茶酸可能是P-gp的底物。3種成分的吸收速率與藥物濃度有一定的關(guān)系，3種成分的吸收為一級吸收動力學(xué)，提示其吸收機制可能是被動轉(zhuǎn)運過程。

參考文獻:

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［3］彭紅梅，李小姝.杜仲的藥理研究現(xiàn)狀及應(yīng)用展望［J］.中醫(yī)學(xué)報，2013，28(176) :72－3.

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［5］Yu L X，Lipka E，Crison J R，et al.Transport approaches to the biopharmaceutical design of oral drug delivery systems : prediction of intestinal absorption［J］.Adv Drug Deliv Rev，1996，19(3) :359 －76.

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［6］Tang J，Luo L N，Zhang H L，et al.Absorption mechanism of SM-1: a procaspase-3-activated anti-tumor agent［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30(4) :542－6.

作者簡介:侯靖宇(1991－)，女，碩士生，研究方向:藥物生物等效性評價與藥代動力學(xué)，Tel: 0851-6908468，E-mail: 772964576 @ qq.com;王愛民(1962－)，男，教授，研究方向:中藥新藥的研究與開發(fā)，通訊作者，Tel: 0851-6908899，E-mail: gywan100 @ 163.com

基金項目:貴州省科技重大專項項目(黔科合重大專項字［2012］6009號) ;貴州省中藥現(xiàn)代化研究開發(fā)專項(黔科合中藥字［2013］5062號，黔科合重G字［2013］4001號) ;貴州高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計劃(黔教合協(xié)同創(chuàng)新字［2013］04)?

收稿日期:2015－01－25，修回日期:2015－03－25

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0885－03中國圖書分類號: R-332; R282.71; R284.1; R322.45; R333.3關(guān)鍵詞:杜仲提取物;在體腸灌流模型; UPLC-MS/MS; pH 值;膽汁;腸吸收

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.030