半枝蓮總黃酮對ApoE基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化及磷脂轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響

祝娉婷，孫　云，劉兆國，劉玉萍，卜　平

(1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州　225001; 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京　210023)

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半枝蓮總黃酮對ApoE基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化及磷脂轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響

祝娉婷1，孫云1，劉兆國2，劉玉萍2，卜平1

(1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州225001; 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023)

摘要:目的探討半枝蓮總黃酮(TFSB)對高脂飼養(yǎng)ApoE基因缺陷(ApoE(－/－))小鼠在動脈粥樣硬化(AS)病變形成早期抑制AS的作用及其分子機制。方法11周齡♂ApoE(－/－)小鼠40只，隨機分為模型組、TFSB低、中、高劑量組、辛伐他汀組，每組8只。取C57BL/6J小鼠8只作為正常對照組。均給予高脂飼養(yǎng)4周后給藥，8周后全部處死，HE染色觀察主動脈形態(tài)學(xué)變化，血液流變儀測血漿黏度、全血黏度(低切、高切)，溫氏法測紅細胞比容。全自動生化分析儀檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C表達水平，ELISA法檢測血清磷脂轉(zhuǎn)運蛋白(PLTP)及維生素E(VE)的表達水平。Western blot法檢測各組小鼠肝臟PLTP蛋白表達水平及法尼酯衍生物X受體(FXR)表達水平。結(jié)果模型組造模成功; TFSB各劑量組對模型小鼠主動脈AS形態(tài)學(xué)有改善作用，可明顯降低AS模型小鼠血清TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平，與模型組比較，差異均具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01) ; TFSB各劑量組可明顯降低AS模型鼠的紅細胞比容、血漿黏度及全血黏度(低切、高切)，且與模型組相比，差異均有顯著性(P＜0.01) ; TFSB各劑量組血清PLTP表達水平較模型組明顯減少，差異均有顯著性(P＜0.01)，且PLTP與VE水平呈負相關(guān)(r=－0.675，P＜0.01) ;與模型組相比，TFSB中、高劑量組能夠明顯抑制肝臟PLTP及FXR蛋白表達水平(P＜0.01)。結(jié)論TFSB可能通過調(diào)節(jié)ApoE(－/－)小鼠FXR水平，從而調(diào)節(jié)PLTP水平、升高VE水平、調(diào)節(jié)血脂、改善血液流變學(xué)及減少小鼠的AS損傷，進而發(fā)揮抗AS的作用。

關(guān)鍵詞:AS; TFSB; ApoE(－/－)小鼠;血脂; PLTP; FXR

磷脂轉(zhuǎn)運蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)屬于脂質(zhì)轉(zhuǎn)移/脂多糖結(jié)合蛋白家族LTP/LBP，可以介導(dǎo)磷脂在脂蛋白間的交換，參與高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)亞類的組成，影響HDL代謝［1］。流行病學(xué)及動物體內(nèi)研究均表明，PLTP的高表達已成為冠心病的獨立危險因子，因而抑制PLTP的表達已成為抗動脈粥樣硬化(atheroscleros is，AS)的主要手段［2］。我們在前期臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血清中PLTP表達水平較正常人明顯升高［3］，為了進一步研究PLTP的功能以及觀察藥物能否通過PLTP途徑抑制AS的發(fā)生發(fā)展，我們建立了ApoE－/－小鼠AS模型，觀察半枝蓮活性成分半枝蓮總黃酮(total flavonoids of scutel-laria barbata，TFSB)對高脂飼養(yǎng)的ApoE－/－小鼠早期AS病變形成的影響，旨在研究和揭示TFSB抗AS的作用機制，為探討中藥抗AS的研究提供新的思路和實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物♂ApoE－/－小鼠(品系C57BL/6J)，40只，清潔級，11周齡，體質(zhì)量(22.3±2.7) g，由北京市維通利華實驗動物中心提供。

1.2藥品、試劑及儀器TFSB(由揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實驗室提供，總黃酮含量為24.12%) ;辛伐他汀(40 mg/片，5片/盒，杭州默沙東制藥有限公司，批號: 100260) ; PLTP ELISA試劑盒(USCNLIFE公司，貨號080527) ; VE ELISA試劑盒(USCNLIFE公司，貨號081012) ; PLTP一抗為兔抗小鼠單克隆抗體(USCNLIFE公司，貨號HZ55321) ; PLTP二抗為人抗兔多克隆抗體(BioVision公司，貨號3595－100) ;免疫組化染色SABC試劑盒(武漢博士德公司，貨號: SA1073) ;內(nèi)參蛋白GAPDH一抗為兔抗小鼠多克隆抗體(武漢博士德公司，貨號: BA2913)，二抗為抗兔多克隆抗體(武漢博士德公司，貨號: BM1623)。BX51系統(tǒng)顯微鏡(Olympus公司) ; JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達科技發(fā)展有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及給藥♂ApoE－/－小鼠40只，給予普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫保持在22～24℃，相對濕度為50%，光照時間為7∶00～19∶00。1周后，將小鼠隨機分成5組:模型組、TFSB低、中、高劑量組和辛伐他汀組，每組8只。另取11周齡正常C57BL/6J小鼠8只作為正常對照組。模型組以高脂飼料喂飼12周，各給藥組給予高脂飼料4周后，開始灌胃給藥，每日1次。按照體表系數(shù)折算人和小鼠的用藥量，換算得給藥劑量:辛伐他汀組3.3 mg·kg－1·d－1;根據(jù)課題組前期實驗結(jié)果，TFSB低、中、高有效給藥劑量分別為100、200、400 mg·kg－1·d－1。正常對照組、模型組每天給予等容量的0.5%CMC-Na。連續(xù)給藥8周，末次給藥后24 h處死。

1.3.2指標(biāo)檢測模型組以高脂飼料連續(xù)喂飼12周后，禁食12 h，眼眶取血0.5 mL，靜置1 h后3 000 r·min－1離心10 min，取血清待用;處死動物，眼眶取血，肝素抗凝，采用LBY-N6型血液流變儀測全血黏度(低切、高切)、血漿黏度，用溫氏法測紅細胞比容。無菌條件下取心臟主動脈根部，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片，蘇木精－伊紅(hematoxylin-eosni，HE)染色觀察AS程度。采用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白－膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDLC)、HDL-C的表達水平。采用ELISA方法檢測血清PLTP及VE的表達水平，操作步驟嚴格按照說明書進行。提取肝組織中PLTP及FXR總蛋白，配制上樣蛋白樣品，經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)于PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，以TBST 1∶200稀釋的兔抗鼠一抗4℃孵育過夜，二抗孵育后PBS清洗，DAB顯色，用Image-Pro Plus軟件掃描作積分吸光度值(integral absorbance，IA)分析。以目的蛋白PLTP或FXR與內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶的IA比值評定PLTP的表達水平。

2　結(jié)果

2.1半枝蓮總黃酮對ApoE－/－小鼠形態(tài)學(xué)及血液流變學(xué)的影響HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組主動脈平滑肌層較薄，內(nèi)膜光滑且連續(xù)、結(jié)構(gòu)完整、內(nèi)皮細胞完整，彈性膜無斷裂，無動脈粥樣硬化病灶。而模型組的主動脈管壁內(nèi)膜則呈明顯增厚，可見丘狀斑塊。平滑肌纖維數(shù)量增多，內(nèi)膜含有較多泡沫細胞。TFSB組主動脈內(nèi)壁內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)完好，管壁三層結(jié)構(gòu)分層清楚，偶見泡沫細胞，其形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善。模型組紅細胞比容、血漿黏度、全血黏度(低切、高切)明顯高于正常對照組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗差異有顯著性(P＜0.01) ; TFSB低、中、高劑量組均可明顯降低紅細胞比容、血漿黏度及全血黏度(低切、高切)，與模型組相比，差異均有顯著性(P＜0.01) ; TFSB中劑量及高劑量效果優(yōu)于陽性對照藥辛伐他汀組。見Tab 1。

2.2半枝蓮總黃酮對ApoE－/－小鼠血脂的影響

經(jīng)One-way ANOVA分析，模型組的TC、LDL-C、TG表達水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，與正常對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.01)，提示造模成功。TFSB各劑量組的TG、TC水平明顯降低，與模型組相比，差異具有顯著性(P＜0.01) ; TFSB各劑量組的LDL-C水平明顯降低，與模型組相比，差異具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01) ; TFSB各劑量組的HDL-C水平明顯升高，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。TFSB高劑量組降低TC、TG、LDL-C的作用及升高HDL-C的作用均優(yōu)于陽性對照藥辛伐他汀。見Tab 2。

2.3半枝蓮總黃酮對ApoE－/－小鼠血清PLTP及VE水平的影響經(jīng)One-way ANOVA分析，模型組PLTP的水平均明顯高于正常對照組，VE水平明顯低于正常對照組，差異均具有顯著性(P＜0.01)。TFSB中、高劑量組的PLTP表達水平較模型組明顯降低(P ＜0.01)，VE水平較模型組明顯升高(P＜0.01)，差異亦具有顯著性，且作用優(yōu)于辛伐他汀組。經(jīng)Linear Regression相關(guān)性分析，PLTP水平與VE水平呈負相關(guān)(r=－0.675，P＜0.01)。見Tab 3。

Tab 1 Effects of TFSB on hemarheology in AS model mice(珋±s，n=8)

Tab 1 Effects of TFSB on hemarheology in AS model mice(珋±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs SIM

Group　Hematocrit value/%　Plasma viscosity/mPa·s　High whole bloodLow whole blood viscosity/mPa·sviscosity/mPa·s Control　35.30±2.92　1.34±0.19　2.83±0.61　11.77±0.56 Model　45.30±2.60＊＊　2.91±0.45＊＊　4.33±0.16＊＊　18.55±0.53＊＊SIM　41.37±1.44##　1.94±0.23##　3.93±0.20##　17.87±0.68#L-TFSB　38.20±1.31##▲▲　1.70±0.10##▲　3.75±0.12##▲　17.36±0.35##M-TFSB　36.36±1.12##▲▲　1.46±0.09##▲▲　3.62±0.09##▲▲　16.80±0.28##▲▲H-TFSB　34.62±1.32##▲▲　1.34±0.09##▲▲　3.36±0.09##▲▲　15.97±0.30##▲▲

Tab 2 Changes of lipids of mice in different groups（±s，n=8)

Tab 2 Changes of lipids of mice in different groups（±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs SIM

Control　1.41±0.19　0.68±0.27　0.62±0.19　7.48±1.65 Model　27.71±3.34＊＊　2.24±0.30＊＊　12.54±2.34＊＊　3.08±0.74＊＊SIM　17.52±1.77##　1.45±0.28##　10.71±2.14#　3.66±0.67#L-TFSB　22.50±2.76##▲▲　1.61±0.20##　9.47±2.23#　4.51±0.28##▲▲M-TFSB　17.12±2.28##　1.24±0.20##　9.19±2.19#　7.08±1.73##▲▲H-TFSB　10.12±3.39##▲▲　1.18±0.19##▲　5.36±1.84##▲▲　7.32±1.70##▲▲

Tab 3 Effect of TFSB on expression of PLTP and VE in different groups(±s，n=8)

Tab 3 Effect of TFSB on expression of PLTP and VE in different groups(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs SIM

Control　7.69±0.96　18.50±1.01 Model　20.06±3.83＊＊　8.91±0.99＊＊SIM　18.24±2.17##　11.90±0.79##L-TFSB　13.11±3.11##▲▲　13.78±1.66##▲M-TFSB　11.45±2.42▲▲　14.50±0.48##▲▲H-TFSB　9.90±1.74##▲▲　15.48±0.67##▲▲

2.4半枝蓮總黃酮對ApoE－/－小鼠肝臟PLTP表達的影響各組小鼠肝組織中PLTP均有不同程度的表達，經(jīng)One-way ANOVA分析，以模型組表達為最高，與正常組相比，差異有顯著性(P＜0.01) ; TFSB中、高劑量組能抑制小鼠肝組織PLTP的蛋白表達水平，與模型組相比，差異有顯著性(P＜0.01)，且高劑量組抑制肝組織PLTP蛋白表達的作用強于辛伐他汀(P＜0.01)。見Fig 1。

2.5半枝蓮總黃酮對ApoE－/－小鼠肝臟FXR表達的影響各組小鼠肝組織中FXR均有不同程度的表達，經(jīng)One-way ANOVA分析，模型組FXR表達最高，與正常組相比，差異有顯著性(P＜0.01) ;藥物干預(yù)組小鼠肝組織FXR蛋白表達水平均明顯下降，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，TFSB各濃度組能抑制小鼠肝組織FXR的蛋白表達水平，其中，中濃度及高濃度TFSB的作用效果與模型組相比，差異有顯著性(P＜0.01)，且抑制肝組織FXR蛋白表達的作用強于辛伐他汀(P＜0.05)。見Fig 2。

3　討論

AS是冠心病、腦卒中等心血管疾病的基礎(chǔ)病變，決定疾病的預(yù)后與轉(zhuǎn)歸。AS的形成原因非常復(fù)雜，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的表達調(diào)控在脂蛋白代謝和AS中的作用成為國內(nèi)外研究新的熱點。PLTP是一種重要的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，參與重構(gòu)HDL并調(diào)節(jié)HDL顆粒的大小和亞類組成，影響HDL的功能，從而發(fā)揮影響AS發(fā)生發(fā)展的作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，PLTP在人類組織如卵巢、胸腺、胎盤、肺、肝臟和小腸中高表達［5－8］，同時在動脈硬化病變組織和巨噬細胞中也高表達［9－10］。已有研究表明，冠心病患者血清PLTP活性增加［11］。本課題組前期研究也顯示，與正常人群相比，冠心病患者的血清PLTP表達水平也明顯升高［3］。由于全身PLTP表達增高是AS動物模型的一個危險因素，因而PLTP過度表達則會誘發(fā)AS［12－13］。因此，降低血漿PLTP的水平對于AS的治療可能是有益的。

Fig 1 Effects of TFSB on expression of PLTP in liver of mice

中藥抗AS有著多靶點、作用持久、副作用小的獨特優(yōu)勢。目前，中藥抗AS常用黃酮類化合物，主要包括黃酮及黃酮醇類、二氫黃酮及二氫黃酮醇類、黃烷醇類、異黃酮及二氫異黃酮、雙黃酮類等，該類成分能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂、保護內(nèi)皮細胞［14］、抗炎、抗血小板凝集［15］及抗氧化低密度脂蛋白［16］等作用，但對其研究較少涉及到酶、受體、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等信號機制。本課題組前期研究已經(jīng)證實TFSB具有調(diào)節(jié)血脂、抗炎及抗氧化等抗AS的作用，但其作用機制如何，尚不清楚。因此，本研究基于建立的AS［J］小鼠模型，探討半枝蓮活性成分是否通過脂蛋白途徑發(fā)揮抗AS的作用及其作用機制。

我們選擇了ApoE－/－小鼠作為模型動物，由于ApoE是清除乳糜微粒和極低密度脂蛋白受體的配體，因此缺乏ApoE會導(dǎo)致血液循環(huán)中富含膽固醇的物質(zhì)累積，易引起AS病灶形成［17］。在本實驗中，11周齡的ApoE－/－小鼠在高脂飲食喂飼12周后，HE染色光學(xué)顯微鏡下可見主動脈管壁內(nèi)膜增厚，可見隆起丘狀斑塊。彈性膜有明顯斷裂現(xiàn)象，血管平滑肌纖維數(shù)量增多，細胞質(zhì)中可見大量脂質(zhì)，內(nèi)膜含較多的泡沫細胞。與正常對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，表明造模成功。TFSB干預(yù)ApoE－/－小鼠8周后，能夠明顯降低模型小鼠的TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，表明TFSB有減輕AS病變程度、調(diào)節(jié)血脂的作用。TFSB能夠明顯降低紅細胞比容、血漿黏度、全血黏度(低切、高切)，表明TFSB對ApoE－/－小鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)的異常變化具有明顯的改善作用。由于VE可延緩或抑制LDL的氧化、抑制平滑肌細胞增殖、抑制血小板黏連、抑制黏著分子的表達和功能，具有預(yù)防AS的作用，而PLTP參與VE代謝，具有轉(zhuǎn)運VE的活性，能夠維持組織和血漿VE的表達水平。因此，本研究同時研究了TFSB對ApoE－/－小鼠血清PLTP和VE的影響以及血清PLTP與VE水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，模型組小鼠血清VE水平較正常對照組明顯降低，TFSB能明顯升高小鼠血清VE水平，血清PLTP水平與VE水平呈負相關(guān)，這與部分研究結(jié)果一致［12］。已有研究表明，法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)在AS疾病的過程中起重要作用，AS血脂的改變與FXR活化有關(guān)［18－20］。而PLTP又是FXR的靶基因之一，F(xiàn)XR可上調(diào)PLTP轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)PLTP的表達［21－22］。因此，我們進一步研究了不同濃度TFSB對于PLTP的調(diào)控作用機制，結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟FXR及PLTP的蛋白表達水平均明顯升高，而不同劑量的TFSB能明顯降低小鼠肝臟FXR 及PLTP的蛋白表達水平，提示TFSB可能參與調(diào)控PLTP信號通路，通過調(diào)節(jié)PLTP的上游蛋白FXR的表達，下調(diào)PLTP的表達，調(diào)節(jié)血清脂質(zhì)、降低LDL過氧化，提高VE的表達水平而發(fā)揮抗AS的作用。

盡管PLTP在AS中的分子機制還有待于進一步探索，但可以肯定的是，PLTP在AS疾病的過程中起著重要作用，PLTP有望成為治療AS藥物的新型靶點。選擇性調(diào)控PLTP靶基因的新藥正等待我們?nèi)ヌ剿骱桶l(fā)現(xiàn)。

Fig 2 Effects of TFSB on expression of FXR inliver of ApoE－/－mice

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Effects of the total fla vonoids of scutellaria barbataon on atherosclerosis and expression of PLTP in ApoE gene deficiency mice

ZHU Ping-ting1，SUN Yun1，LIU Zhao-guo2，LIU Yu-ping2，BU Ping1
(1.Medical School of Yangzhou University，Yangzhou Jiangsu 225001，China; 2.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

Abstract:AimTo observe the effects of the total flavonoids of scutellaria barbataon (TFSB) on high-fat feeding ApoE gene deficiency mice in early atherosclerosis (AS ) and itsunderlying mechanisms.Methodsbook=838,ebook=10340 ApoE(－/－)male mice were divided into five groups: model group，SIM group and L-TFSB，M-TFSB，HTFSB group，5 C57BL/6J mice were selected as normal control group.All mice in experimental group were fed with high-lipid diet for 4 weeks and all mice were killed after 8 weeks.H＆E staining was used to observe morphology of aorta.Blood rheometer was used to examine plasm viscosity and whole blood viscosity.Fully automatic biochemical analyser was used to detect the serum levels of TG，TC，LDL-C and HDL-C.The expression levels of PLTP and VE in serum were measured by ELISA.The expression levels of PLTP and FXR in liver were examined by Western blot.Results The model was established successfully.TFSB groups could improve the aorta AS morphology of model mice and significantly reduce the serum levels of TG，TC and LDL-C，while increase the level of HDL-C (P ＜0.05 or P＜0.01).TFSB groups could decrease the hematocrit value，plasma viscosity and whole blood viscosity of AS model mice significantly and had statistical significance when compared with model group (P＜0.01).The expression levels of PLTP of serum were reduced significantly when compared with model group (P＜0.01).We also found that the expression of PLTP was in negative correlation with VE (r=－0.675，P＜0.01).M-TFSB and H-TFSB group could decrease the expressions of PLTP and FXR of liver when compared with model group (P＜0.01).ConclusionTFSB may exert its anti-AS effect partly through inhibiting the levels of FXR and PLTP of ApoE(－/－)mice，increasing the level of VE，regulating blood lipids，improving blood rheology and reducing the damage of AS in mice.

Key words:AS; TFSB; ApoE gene deficiency mice; lipids; PLTP; FXR

作者簡介:祝娉婷(1984－)，女，博士，講師，研究方向:中醫(yī)藥抗動脈粥樣硬化，E-mail: yzzpt@ sina.com;卜平(1955－)，男，博士，教授，研究方向:中醫(yī)藥抗動脈粥樣硬化，通訊作者，E-mail: boping@ yzu.edu.cn

基金項目:教育部博士點基金資助項目(No 20123250120003) ;江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(No BK20140493) ;江蘇省高校面上項目(No 13KJB360015) ;江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(No LZ13249)

收稿日期:2015－02－28，修回日期:2015－03－27

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0833－06中國圖書分類號: R-332; R284.1; R394.2; R543.502

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.019