清腸化濕方對(duì)HT-29細(xì)胞IL-6/JAK2/STAT3的影響

趙青春，沈　洪，程海波，朱　磊，李沐涵

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京　210046;2.江蘇省中醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇南京　210029)

Effect of Qingchang Huashi Recipe on IL-6/JAK2/STAT3 pathway in HT-29 cells>

ZHAO Qing-chun1，SHEN Hong2，CHENG Hai-bo1，ZHU Lei2，LI Mu-han1(1.the First Clinical Medical School，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China;2.Dept of Gastroenterology，Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

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清腸化濕方對(duì)HT-29細(xì)胞IL-6/JAK2/STAT3的影響

趙青春1，沈洪2，程海波1，朱磊2，李沐涵1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210046;2.江蘇省中醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇南京210029)

Effect of Qingchang Huashi Recipe on IL-6/JAK2/STAT3 pathway in HT-29 cells>

ZHAO Qing-chun1，SHEN Hong2，CHENG Hai-bo1，ZHU Lei2，LI Mu-han1
(1.the First Clinical Medical School，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China;2.Dept of Gastroenterology，Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

關(guān)鍵詞:清腸化濕方;潰瘍性結(jié)腸炎; HT-29; IL-6; JAK2; STAT3

Key words:Qingchang Huashi Recipe; ulcerative colitis; HT-29; IL-6; JAK2; STAT3

沈洪(1959－)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向:消化道疾病，通訊作者，E-mail: shenhong999@ 163.com

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種反復(fù)發(fā)作的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未明確，細(xì)胞因子IL-6及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在非可控性腸道炎癥過(guò)程中起關(guān)鍵作用［1］。導(dǎo)師沈洪教授所擬清腸化濕方(QHR)，治療輕、中度UC，取得良好效果［2］。課題組前期研究表明該方能調(diào)控UC大鼠NF-κB/COX-2通路、PPAR-γ/NF-κB及Toll通路，減少I(mǎi)L-1β、TNF-α等促炎因子分泌，促進(jìn)抑炎因子IL-10分泌等。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，以TNF-α、LPS共刺激誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞炎癥模型，觀(guān)察清腸化濕方對(duì)IL-6及其主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一JAK2/STAT3的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料HT-29，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。清腸化濕方(黃連、黃芩、煨木香等購(gòu)自江蘇省醫(yī)藥公司，生產(chǎn)批號(hào)20121201)。柳氨磺胺吡啶(Sulfasalazine，SASP)、McCoy's5a培養(yǎng)基、LPS: Sigma公司;胎牛血清(Gibco公司) ; Recombinant Human TNF-α(Pepro Tech公司)。人IL-6 ELISA試劑盒(EB公司) ;引物由上海生工合成; Real Time PCR試劑盒(TaKaRa公司) ;兔抗p-JAK2、p-STAT3單抗(Cell Signaling Technology公司)。酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、Western blot曝光儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司; Real Time PCR儀(TaKaRa) ; UVP凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)。

1.2清腸化濕方水煎劑制備稱(chēng)取清腸化濕方1付，共87 g，煎煮、蒸發(fā)、減壓濃縮至27 ml母液，4℃保存。

1.3實(shí)驗(yàn)分組取指數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，分?為6組:對(duì)照組:加入不含F(xiàn)BS的McCoy's 5a孵育24 h;模型組:根據(jù)前期研究［3］，予hTNF-α(20 μg·L－1)［4－5］孵育12 h后，再予LPS(1 mg·L－1)［5－6］孵育15 h;實(shí)驗(yàn)組:根據(jù)前期研究［3］，在上述藥物干預(yù)的基礎(chǔ)上，分別加入SASP(2 mmol·L－1)、QHR高、中、低劑量(10、1、0.1 mg·L－1)孵育24 h。

1.4ELISA法檢測(cè)HT-29細(xì)胞上清IL-6水平收集細(xì)胞上清液，轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppnedorf管，離心機(jī)1 600 r·min－1離心5 min，取上清。按ELISA試劑盒步驟檢測(cè)IL-6的水平。

1.5Real Time PCR法檢測(cè)HT-29細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平取HT-29細(xì)胞，TRIzol充分裂解，氯仿萃取，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，溶于DEPC水，－80℃保存。取2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物: JAK2:上游5'-GGAATGGCCTGCCTTACAATG-3';下游5'-TGGCTCTATC TGCTTCACAGAAT-3'; STAT3:上游5'-CACCTTGGATTGAG AGTCAAGAC-3';下游5'-AGGAATCGGCTATATTGCTGGT-3'; GAPDH:上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3';下游5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。Real-time PCR反應(yīng)體系: SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，DEPC水9.5 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min，95℃5 s，57℃30 s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán); 95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s循環(huán)讀取溶解曲線(xiàn)，57℃30 s讀取熒光。結(jié)果以CT值表示。

基因表達(dá)量以各樣基因CT值減去內(nèi)參基因GAPDH CT值表示，相對(duì)表達(dá)量以2－ΔΔCt表示。

1.6Western blot法檢測(cè)HT-29細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)取HT-29細(xì)胞，低溫提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，以30 μg質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)上樣，分離膠SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉。按1∶1 000濃度稀釋一抗，4℃搖床振蕩孵育過(guò)夜，充分洗滌，按1∶3 000濃度稀釋二抗，室溫?fù)u床振蕩孵育2 h，充分洗滌，加ECL顯影液。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、One way-ANOVA分析，計(jì)量資料以±s表示。

2　結(jié)果

2.1HT-29細(xì)胞上清IL-6水平模型組細(xì)胞上清IL-6水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，QHR各劑量組IL-6的水平較模型組降低(P＜0.01)，并呈劑量依賴(lài)性，QHR高劑量組與SASP組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effects of QHR on IL-6 secretion from HT-29 cells(珋±s，n=3)

Tab 1 Effects of QHR on IL-6 secretion from HT-29 cells(珋±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs model

Group　IL-6/ng·L－1Control　13.07±1.43＊＊Model　98.01±2.35 SASP　32.21±1.30＊＊QHR high dose　34.60±2.22＊＊QHR middle dose　58.81±0.63＊＊QHR low dose　82.01±1.04＊＊

2.2HT-29細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組比較，各組JAK2基因表達(dá)差異倍數(shù)未見(jiàn)明顯差異，各組STAT3基因表達(dá)差異倍數(shù)未見(jiàn)明顯差異。

2.3HT-29細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，模型組p-JAK2表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，與模型組相比，各藥物組明顯降低(P＜0.01)，其中QHR各劑量組呈劑量依賴(lài)性。與對(duì)照組相比，模型組p-STAT3表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，與模型組相比，各藥物組明顯降低(P＜0.01)，其中QHR各劑量組呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Effects of QHR on p-JAK2，p-STAT3 protein expression in HT-29 cells(珋±s，n=3)

Tab 2 Effects of QHR on p-JAK2，p-STAT3 protein expression in HT-29 cells(珋±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs model

Group　p-JAK2/β-actin　p-STAT3/β-actin Control　0.09±0.005＊＊　0.1±0.011＊＊Model　0.573±0.006　1.125±0.002 SASP　0.228±0.006＊＊　0.313±0.01＊＊QHR high dose　0.234±0.008＊＊　0.266±0.008＊＊QHR middle dose　0.357±0.007＊＊　0.44±0.006＊＊QHR low dose　0.42±0.005＊＊　0.764±0.003＊＊

3　討論

生理狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞持續(xù)暴露于腸道共生菌并能維持穩(wěn)態(tài)，在炎性因子如TNF-α等作用下，腸上皮功能破壞，免疫反應(yīng)失衡，導(dǎo)致UC發(fā)病。研究表明，在遺傳易感性IBD動(dòng)物模型中Th1細(xì)胞因子和共生菌為誘導(dǎo)慢性炎癥所必須［6］。由于體外原代培養(yǎng)結(jié)腸上皮細(xì)胞的困難，目前，主要使用結(jié)腸癌細(xì)胞株進(jìn)行研究。Abreu等［4］研究亦表明，HT-29細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后可增強(qiáng)對(duì)LPS的反應(yīng)性，LPS信號(hào)能激活胞內(nèi)多條信號(hào)通路，促進(jìn)大量細(xì)胞因子和粘附分子等表達(dá)，引起瀑布式的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［7］。本實(shí)驗(yàn)以前期研究為基礎(chǔ)［3］，以L(fǎng)PS與TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞炎癥，結(jié)果上清中IL-6水平明顯增高，與Jeong等［5］報(bào)道一致。IL-6是一種多向性細(xì)胞因子，由活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌，能刺激巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等合成前列腺素、細(xì)胞因子、血小板激活因子等炎性介質(zhì)。IL-6與受體結(jié)合后優(yōu)先激活JAK和STAT3，STAT3經(jīng)磷酸化活化入核，調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)炎癥。IBD患者及一些動(dòng)物結(jié)腸炎或腸炎模型中，皆觀(guān)察到升高的IL-6［8］，高水平磷酸化的STAT3與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［9］。本實(shí)驗(yàn)表明清腸化濕方能降低LPS與TNF-α誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞IL-6的分泌，下調(diào)p-JAK2、p-STAT3水平，對(duì)JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響，表明清腸化濕方能抑制LPS與TNF-α誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞JAK2、STAT3的活化。清腸化濕方通過(guò)降低IL-6表達(dá)，抑制JAK2、STAT3活化，阻斷炎癥的發(fā)展和持續(xù)，可能是其治療UC作用機(jī)制之一。

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作者簡(jiǎn)介:趙青春(1985－)，女，博士生，主治中醫(yī)師，研究方向:中醫(yī)內(nèi)科消化系統(tǒng)疾病，E-mail: zqctim@163.com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81403344，81373606) ;國(guó)家中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)資助(No 201407001) ;國(guó)家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(No JDZX2012079) ;江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目資助(No BL2014100) ;江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD) ;國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地(脾胃)資助項(xiàng)目

收稿日期:2015－02－15，修回日期:2015－04－26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015) 06－0883－03中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào): R287; R329.25; R392.12; R574.621

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.029