紅景天苷對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

賴文芳，張小琴，洪海棉，謝秀利，洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院、2.中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州　350122)

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紅景天苷對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

賴文芳1，2，張小琴1，洪海棉1，謝秀利1，洪桂祝1

(福建中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院、2.中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122)

摘要:目的探討紅景天苷(salidroside，Sal)對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法健康成年♂SD大鼠36只，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham)、模型對照組(MCAO組)、紅景天苷給藥組(MCAO+ Sal組)。通過線栓法制作大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型，Longa評分法對大鼠神經(jīng)功能損傷評分，焦油紫染色法對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)尼氏(Nissl)小體染色，RT-qPCR技術(shù)檢測大鼠缺血側(cè)腦組織Neun、Nogo-A與NgR mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測大鼠缺血側(cè)腦組織Bcl-2、Neun、BDNF、NGF、Nogo-A與NgR蛋白的表達(dá)。結(jié)果與MCAO組比較，紅景天苷能明顯降低神經(jīng)功能損傷，增加Nissl陽性細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)Bcl-2、Neun、NGF、BDNF的蛋白表達(dá)，降低Nogo-A及其受體NgR 的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)論紅景天苷能夠降低MCAO模型大鼠神經(jīng)功能損傷，增加Nissl陽性細(xì)胞數(shù)目，提高Neun的表達(dá)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，此作用是通過促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2及神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF的蛋白表達(dá)，下調(diào)軸突生長抑制因子Nogo-A及其受體NgR的蛋白表達(dá)所實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞:紅景天苷;局灶性腦缺血/再灌注;軸突生長抑制因子;神經(jīng)生長因子;神經(jīng)保護(hù);細(xì)胞凋亡

腦卒中，俗稱腦中風(fēng)，是腦血管疾病最嚴(yán)重的并發(fā)癥。過去的30年，全球共有將近200個治療腦卒中藥物進(jìn)入臨床試驗，只有組織型纖維蛋白溶活劑(tPA)獲得美國FDA的臨床應(yīng)用批件。然而，由于tPA只能用于腦血栓病人的缺點，該藥物僅對3%～5%的腦中風(fēng)病人有治療的效果［1－2］。專家們普遍認(rèn)為，選擇具有神經(jīng)保護(hù)作用的候選藥物進(jìn)行研發(fā)，可提高腦卒中藥物研發(fā)成功的機(jī)會［3－4］。

紅景天是景天科紅景天屬植物高山紅景天(Rhodiold rosea L.)的干燥根莖，其性寒、味甘澀，根據(jù)中國藥典2010版，紅景天的功能與主治為“益氣活血，通脈平喘。用于氣虛血瘀，胸痹心痛，中風(fēng)偏癱，倦怠氣喘”。紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天的主要有效成分，在局灶性腦缺血/再灌注大鼠模型中，紅景天苷可減少大鼠局灶性腦缺血/再灌注(MCAO)大腦的梗死體積和降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評分［5－6］，但其確切機(jī)制還不清楚。本研究旨在觀察紅景天苷對MCAO模型大鼠腦組織內(nèi)抗凋亡基因Bcl-2、神經(jīng)元特異核蛋白抗原(neuronal nuclei/neuron-specific protein，NeuN)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)及軸突生長抑制因子(Nogo-A)及其受體NgR mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討紅景天苷對MCAO模型大鼠神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。

1　材料

1.1實驗動物健康成年♂，SD大鼠36只，SPF級，體質(zhì)量260－300g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號: 2007000509960，許可證號: SCXK(滬) 2007－0005，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2主要儀器與試劑凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，型號: ChemiDoc XRS+ )，PCR儀(Bio-Rad，型號: C1000)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，型號:7900HT)，高速臺式冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher，型號: Primo R)。Bcl-2多克隆抗體(Santa Cruz，sc-492)，Neun單克隆抗體(Cell Sigaling，#12943)，NGF多克隆抗體(Santa Cruz，sc-365944)，BDNF多克隆抗體(Santa Cruz，sc-546)，Nogo-A多克隆抗體(Santa Cruz，sc-25660)，NgR多克隆抗體(Santa Cruz，sc-168752)，β-actin抗體(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號: H015)，RNeasyMini Kit(QIAGEN，貨號:74106)，RT試劑盒(Fermentas，貨號: K1622)，熒光定量PCR Master Mix(Applied Biosystems，貨號: R11022)，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，參照Gen Bank中大鼠Neun、Nogo-A、NgR、GAPDH mRNA序列，Neun引物上游序列5'-GGGTTTTGGGTTTGTAACTTTTGAA-3';下游序列5'-AGACTGCTCCTACCACAGGGTTTAG-3'，PCR擴(kuò)增片段長度為188 bp。Nogo-A引物上游序列5'-GGAGAACAACTTGGACGGCTATG-3';下游序列5'-GCATCTCACGCTTGACCCAG-3'，PCR擴(kuò)增片段長度為128 bp。NgR引物上游序列5'-GATGATGCTCTTAGTGGACCTGTG-3';下游序列5'-CGATACTCAAAAGTCACACGGTTCA-3'，PCR擴(kuò)增片段長度為129 bp。GAPDH引物上游序列5'-CAACGGGAAACCCATCACCA-3';下游序列5'-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3'，PCR擴(kuò)增片段長度為96 bp。紅景天苷由北京大學(xué)提供，純度為98%。尼氏(Nissl)染色液(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號: C0117)。

2　實驗方法

2.1MCAO動物模型制作大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml·kg－1體質(zhì)量)麻醉動物。將甲聚硅氧烷涂層的尼龍單絲從左頸總動脈插入到大腦中動脈的起始端。栓塞后2 h，將尼龍單絲拔出。假手術(shù)動物不栓塞中腦動脈。在操作過程中，連續(xù)監(jiān)測動物的溫度，并把溫度保持37℃。參照Longa評定法，進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度的評價，3～4級為模型制作成功，可用于實驗。

2.2實驗分組與處理實驗大鼠分為假手術(shù)組(sham)，把成模的動物隨機(jī)分為模型對照組(MCAO)和紅景天苷給藥組(MCAO+ Sal)，每組12只。MCAO+ Sal組在栓塞2 h后立即腹腔注射紅景天苷(50 mg·kg－1)，連續(xù)給藥6 d，于末次給藥4 h后，每組實驗動物斷頭取腦，用于實驗。

2.3評價神經(jīng)功能損傷參照Longa評定法，每天對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度的評價: 0級，無缺陷; 1級，不能伸展對側(cè)前肢;2級，對側(cè)前肢屈曲;3級，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;4級，嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈;5級，對側(cè)癱瘓。

2.4Nissl染色腦組織以福爾馬林液固定，充分水洗后，以石蠟包埋，切片厚度為10 μm;將切片脫蠟后至50%酒精內(nèi)，放入37℃溫箱12 h;切片由酒精中取出，放入0.06%焦油紫液，將切片放置56℃溫箱內(nèi)染色1 h;用蒸餾水洗去浮色，放入70%酒精分化，至顯微鏡下觀察時見背景無色，細(xì)胞及尼氏小體有明顯的輪廓為度;以無水酒精急速脫水5 s，入氯仿5 s，二甲苯透明，香膠封固;尼氏小體呈紫色。

2.5熒光實時定量PCR檢測大鼠腦組織Neun、Nogo-A、NgR mRNA表達(dá)按照QIAGEN RNeasyMini Kit試劑盒提取總RNA，用RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，建立qPCR體系為20 μl，反應(yīng)條件為50℃2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，退火60℃30 s，40個循環(huán)。

以GAPDH為內(nèi)參，校正每個樣品的Ct值(每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，得ΔCt值。以2－ΔΔCt法計算各組間mRNA的表達(dá)量。ΔΔCt=各組(Ct目的基因－CtGAPDH)－對照組(Ct目的基因－CtGAPDH)，2－ΔΔCt=各組基因表達(dá)量/對照組基因表達(dá)量。

2.6Western blot檢測大鼠腦組織Bcl-2、Neun、NGF、BDNF、Nogo-A、NgR的蛋白表達(dá)提取總蛋白，采用SDS-PAGE垂直板全濕法電泳，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液封閉2 h后加入稀釋的一抗(Bcl-2多克隆抗體1∶600，Neun單克隆抗體1∶500，NGF多克隆抗體1∶1 000，BDNF多克隆抗體1∶1 000，Nogo-A多克隆抗體1∶800，NgR多克隆抗體1∶1 000，β-actin單克隆抗體1∶3 000 )，4℃下孵育過夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1 000稀釋HRP標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育2 h后TBS洗膜。之后加ECL顯色劑經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測，分析目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對量，并統(tǒng)計各組之間的差異。

2.7統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，除了神經(jīng)損傷評分分析(非參數(shù)檢驗，Mann-Whitney test)，其余各組數(shù)據(jù)間的差別用ANOVA方法分析。

3　結(jié)果

3.1紅景天苷對MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷的影響與MCAO組比較，MCAO+ Sal組在d 4開始能夠有效降低神經(jīng)功能損傷(n=12)，且差異具有顯著性(Fig 1)。

3.2紅景天苷對MCAO大鼠腦組織Nissl陽性細(xì)胞數(shù)目及bcl-2蛋白表達(dá)的影響Nissl染色顯示紅景天苷給藥d 6后，能夠增加Nissl陽性細(xì)胞數(shù)目，即完整神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目(Fig 2) ; Western blot結(jié)果表明紅景天苷能夠上調(diào)bcl-2的蛋白水平(Fig 3)，這些結(jié)果提示著紅景天苷能夠抑制細(xì)胞凋亡。

3.3紅景天苷對MCAO大鼠腦組織Neun mRNA及蛋白表達(dá)的影響與sham組比較，MCAO組Neun mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低;與MCAO組比較，紅景天苷給藥d 6后，能夠提高Neun mRNA及蛋白表達(dá)，且差異具有顯著性(Fig 4)。

3.4紅景天苷對MCAO大鼠腦組織NGF、BDNF的蛋白表達(dá)的影響與sham組比較，MCAO組大鼠腦組織NGF、BDNF的蛋白達(dá)明顯降低;與MCAO組比較，紅景天苷給藥d 6后，能夠提高大鼠腦組織NGF、BDNF的蛋白表達(dá)，且差異具有顯著性(Fig 5)。

Fig 1 Effects of salidroside treatment on neurologicalscore in MCAO rats(n=12)

Fig 2 Nissl-stained cells in ischemic brain(±s，n=6)

Fig 3 Effects of salidroside treatment on Bcl-2 protein in ischemic brain(n=3)

Fig 4 Effects of salidroside treatment on Neun mRNA (A) and protein (B) in ischemic brain(n=3)

3.5紅景天苷對MCAO大鼠腦組織Nogo-A及其受體NgR mRNA及蛋白表達(dá)的影響與sham組比較，MCAO組大鼠腦組織Nogo-A及其受體NgR mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高;與MCAO組比較，紅景天苷給藥d 6后，能夠降低大鼠腦組織Nogo-A及其受體NgR mRNA及蛋白表達(dá)且差異具有顯著性(Fig 6，7)。

4　討論

本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠促進(jìn)MCAO模型大鼠Bcl-2、Neun、NGF、BDNF的蛋白表達(dá)水平。Bcl-2是細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)因子，在細(xì)胞受到外界刺激時能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。NeuN是一種穩(wěn)定而敏感的成熟神經(jīng)細(xì)胞特異抗原的標(biāo)記物，是神經(jīng)組織特異的蛋白，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化和功能，在局灶性腦缺血的研究中應(yīng)用較多［7］。同時，神經(jīng)細(xì)胞的存活及維持其正常功能依賴于神經(jīng)營養(yǎng)因子，而NGF，BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員［8］，NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，具有神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對中樞及周圍神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用; BDNF是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用，并能防止神經(jīng)細(xì)胞受損傷死亡、改善神經(jīng)細(xì)胞的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)細(xì)胞再生及分化等生物效應(yīng)，也是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞維持生存及正常生理功能所必需。

Fig 5 Effects of salidroside treatment on BDNF(A)，NGF(B) in ischemic brain(n=3)

Fig 6 Effects of salidroside treatment on Nogo-A mRNA (A)and protein (B) in ischemic brain(n=3)

Fig 7　Effects of salidroside treatment on NgR mRNA (A) and protein (B) in ischemic brain(n=3)

腦內(nèi)促進(jìn)與抑制神經(jīng)生長因子共同調(diào)控著軸突的生長。Nogo-A是目前已知主要的軸突生長抑制因子，具有最強(qiáng)的抑制神經(jīng)生長的作用，而Nogo-A受體NgR介導(dǎo)了這一作用［9］。近年來，人們對Nogo-A及其受體NgR的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了大量研究，有了更為深入的了解。有研究表明［10］，調(diào)控Nogo-A及其受體NgR可影響腦缺血的發(fā)展和結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能夠抑制Nogo-A及其受體NgR的基因和蛋白表達(dá)，改善軸突生長的微環(huán)境。

綜上所述，紅景天苷能夠降低MCAO模型大鼠神經(jīng)功能損傷，增加Nissl陽性細(xì)胞數(shù)目，提高Neun的表達(dá)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，此作用是通過促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2及神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF的表達(dá)，下調(diào)軸突生長抑制因子Nogo-A及其受體NgR的表達(dá)所實現(xiàn)。

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Neuroprotective effects of salidroside against focal celebral ischemia/reperfusion injury in rats

LAI Wen-fang1，2，ZHANG Xiao-qin1，HONG Hai-mian1，XIE Xiu-li1，HONG Gui-zhu1
(1.College of Pharmacy，2.Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China)

Abstract:AimTo investigate the effect of Salidroside on the focal celebral ischemia/reperfusion injury in rats and its underlying mechanism.Methods Adult male Sprague-Dawley rats，weighing 260-300 g，were randomly divided into three groups: sham，MCAO，MCAO+ salidroside(Sal) groups.The rats were subjected to local celebral ischemia reperfusion with suture-occluded method.The rats of MCAO+ Sal group were treated intraperitoneally with salidroside (50 mg ·kg(－1)) for 6 days.Neurological deficit testing was performed with Longa’s Scale.The mRNA expressions of Neun，Nogo-A，and NgR were detected by RT-qPCR in ischemic brain.The protein expressions of Neun，NGF，BDNF，Nogo -A and NgR were determined bybook=780,ebook=45Western blot.Results Compared with MCAO group，salidroside significantly improved the neurological deficit，promoted the expressions of Bcl-2，Neun，NGF，BDNF，and inhibited the expressions of Nogo-A，NgR.ConclusionSalidroside can reduce neurological deficit，increase the number of Nissl’s Body and the expression of Neun，and protect rats against focal celebral ischemia/reperfusion injury，which may be accomplished by increasing the expressions of Bcl-2，NGF，BDNF，and inhibiting the expressions of Nogo-A，NgR.

Key words:salidroside; focal celebral ischemia reperfusion; axonal growth inhibitors; nerve growth factor; neuroprotection; apoptosis

作者簡介:賴文芳(1985－)，女，博士生，助理研究員，研究方向:藥理學(xué)，E-mail:13559102126@163.com;洪桂祝(1966－)，女，博士，教授，研究方向:心腦血管藥效藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: guizhuhong@ yahoo.co.uk

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助課題(No 81473382) ;福建省科技廳重點項目(No 2014Y4004) ;福建省自然科學(xué)基金項目(No 2015J01328 ) ;福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題(No X2013010)

收稿日期:2015－02－08，修回日期:2015－03－07

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0775－06中國圖書分類號: R-332; R284.1; R322.81; R743.310.531

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.008