不同基因型橡膠樹花藥體胚發(fā)生能力的差異分析

顧曉川，彭素娜，戴雪梅，周權(quán)男，孫小龍，桂明春，黃華孫，華玉偉，黃天帶＊，張源源

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 ?？?571101；2.云南熱帶作物科學研究所，云南 景洪 572818）

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，其主要來源于橡膠樹（Hevea brasiliensis （Willd.ex A.Juss.） Muell.Arg.）。目前，橡膠樹生產(chǎn)上所應(yīng)用的種苗主要為芽接苗，即實生苗作為砧木嫁接優(yōu)良品種的接穗所培育的種苗。因砧木來源于自然授粉的種子，遺傳基礎(chǔ)不一致，導(dǎo)致芽接苗植株間產(chǎn)量、生長勢等存在顯著差異；而橡膠樹體胚苗是由體細胞胚直接發(fā)育而來的種苗，具有自主發(fā)育的主根、無需嫁接在砧木上的幼態(tài)化無性系（又稱橡膠樹自根幼態(tài)無性系），較目前生產(chǎn)上應(yīng)用的種苗-芽接樹，產(chǎn)量高10%～30%，生長快10%～20%，是天然橡膠產(chǎn)業(yè)新一代種植材料[1-4]。

自1978年王澤云等成功移植成活橡膠樹花藥體胚苗開始[5]，法國、馬來西亞、印度尼西亞、斯里蘭卡、印度等國投入大量的人力、物力、財力對橡膠樹的體胚苗生產(chǎn)進行了廣泛的研究，取得了一定的進展，但體胚誘導(dǎo)率和植株再生頻率較低，生產(chǎn)成本較高，無法滿足生產(chǎn)需求，成為制約體胚苗工廠化生產(chǎn)的瓶頸[6-8]。橡膠樹雄蕊具有數(shù)量大、便于采集、容易表面滅菌處理、易于誘導(dǎo)愈傷組織等優(yōu)點，是研發(fā)橡膠樹體胚發(fā)生體系應(yīng)用最多的外植體。研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹雄蕊誘導(dǎo)的愈傷組織和體胚主要來源于花藥壁體細胞[9-13]，其愈傷組織和體胚再生植株的倍性同母本一致。以花藥誘導(dǎo)的體胚作為外植體，誘導(dǎo)次生體胚循環(huán)增殖，可實現(xiàn)一次花藥體胚發(fā)生進一步誘導(dǎo)多次體胚發(fā)生，且次生體胚植株再生頻率高達86%以上，成為體胚大量增殖的新途徑[14-16]。但目前仍有許多品種的花藥難以誘導(dǎo)體胚形成，即使能夠誘導(dǎo)體胚的品種，也僅有少數(shù)品種的花藥外植體體胚誘導(dǎo)率能達到50%[17-23]，制約了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

植物體胚發(fā)生能力顯著性的受遺傳變異影響，存在細胞核因子遺傳及核質(zhì)互作遺傳影響現(xiàn)象，且存在遺傳背景與培養(yǎng)基互作影響現(xiàn)象，通過分析體胚發(fā)生時的轉(zhuǎn)錄組表明，體胚發(fā)生能力差異懸殊的基因型間存在顯著的差異基因表達。在珍珠粟再生能力遺傳研究中發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織數(shù)量更大比例表現(xiàn)為核質(zhì)互作遺傳影響，而再生頻率主要表現(xiàn)為細胞核遺傳影響[24]。在板栗體胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，遺傳背景與培養(yǎng)基對體胚發(fā)生效率存在著顯著的互作影響，當用美國板栗體胚發(fā)生標準流程時，中國板栗不能誘導(dǎo)形成胚性組織，在‘中國板栗與美國板栗雜交后代’中，雜交F1代、F1代與美國板栗回交BC1代也不能誘導(dǎo)形成胚性組織，而BC1代與美國板栗回交BC2代、BC2代與美國板栗回交形成BC3代的自交BC3F3代能夠誘導(dǎo)形成胚性組織，推斷雜交后代中中國板栗基因的占比可能存在一個體胚發(fā)生閾值，超過該閾值的雜交后代不能誘導(dǎo)形成胚性組織；但當用歐洲板栗體胚發(fā)生標準流程時，中國板栗能夠誘導(dǎo)形成胚性組織，而美國板栗以及中國板栗與美國板栗的雜交后代F1、BC1、BC2、BC3F3均不能誘導(dǎo)形成胚性組織，系統(tǒng)發(fā)育研究表明栗屬起源于亞洲，首先向西遷移至歐洲，然后遷移至北美，因此，作者推斷中國板栗與歐洲板栗的親緣關(guān)系更近，所以，用歐洲板栗體胚發(fā)生流程能夠誘導(dǎo)中國板栗形成胚性組織[25]。通過對不同體胚發(fā)生能力棉花基因型的轉(zhuǎn)錄組進行對比分析，表明不同基因型的胚性愈傷組織是高度同質(zhì)的，而不同基因型的非胚性愈傷組織是高度異質(zhì)的[26]。通過分析棉花高效胚胎發(fā)生基因型和頑拗胚胎發(fā)生基因型的早期體胚發(fā)生轉(zhuǎn)錄組，表明高效胚胎發(fā)生基因型的差異表達基因在脂肪酸、色氨酸和丙酮酸代謝中顯著富集，而頑拗胚胎發(fā)生基因型的差異表達基因則在 DNA 構(gòu)象變化中顯著富集[27]。

橡膠樹品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，為通過遺傳背景分組優(yōu)化不同基因型體胚發(fā)生體系提供了條件。本研究將重點探討橡膠樹體胚發(fā)生能力在不同基因型之間的差異，利用前期試驗中在多個品種體胚誘導(dǎo)率都較高的兩種培養(yǎng)基，對32個橡膠樹品種花藥外植體的體胚發(fā)生進行研究，以期明確橡膠樹不同品種花藥體胚發(fā)生能力與遺傳背景的相關(guān)性，為通過基因型分組優(yōu)化不同品種的體胚發(fā)生體系提供依據(jù)，為突破橡膠樹優(yōu)良品種體胚苗大量增殖的瓶頸提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以國家橡膠樹種質(zhì)資源圃（海南省儋州市寶島新村）保存的32個橡膠樹品種為材料（表1）。于春季3月份采集黃中帶綠、未開放的雄花（花粉發(fā)育處于單核靠邊期），用75%乙醇表面滅菌60 s后，立即用0.1% HgCl2處理10 min，最后用無菌水沖洗5次，每次3 min[14]。表面滅菌后的雄花用于后續(xù)愈傷組織誘導(dǎo)和體胚發(fā)生研究。

1.2 培養(yǎng)基成分

改良MS培養(yǎng)基用于愈傷組織誘導(dǎo)和體胚發(fā)育，其中，大量元素、微量元素、鐵鹽所需的藥品和蔗糖購自廣州化學試劑廠；有機營養(yǎng)、植物激素和生長調(diào)節(jié)劑采購于上海生物工程技術(shù)有限公司和Sigma-Aldrich公司；植物凝膠采購于Sigma-Aldrich公司。

花藥愈傷組織誘導(dǎo)采用平底試管為培養(yǎng)容器。體胚分化階段采用培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)容器。

1.3 試驗方法

1.3.1 系譜分析 參考《中國橡膠樹育種五十年》并參考相關(guān)文獻[28-30]信息，整理參試品種親本并進行系譜分析。

1.3.2 花藥愈傷組織和體胚誘導(dǎo) 首先將雄蕊從雄花中剝出，然后接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（M培養(yǎng)基和S培養(yǎng)基），每個品種每處理接種數(shù)量超過120?；ㄋ?，重復(fù)3次，26 ℃～28 ℃暗室中培養(yǎng)40 d～60 d。形成愈傷組織后，將花藥愈傷組織接種到體胚發(fā)生培養(yǎng)基上（E培養(yǎng)基），于24～26 ℃暗室中培養(yǎng)40～60 d。M培養(yǎng)基為改良 MS 添加 4.6 μmol?L?1ZT，4.1 μmol?L?1Picloram，4.5 μmol?L?12,4-D。S 培養(yǎng)基為改良MS 添加 2.3 μmol?L?1KT，2.1 μmol?L?1Picloram，2.3 μmol?L?12,4-D。E 培養(yǎng)基為改良 MS 添加 2.2 μmol?L?16-BA，14.0 μmol?L?1KT，1.4 μmol?L?1GA3，0.1 μmol?L?1NAA，3.8 μmol?L?1ABA[15]。以上培養(yǎng)基均添加 204.5 mmol?L?1蔗糖，2.2 g?L?1Phytagel，滅菌前調(diào)整pH至5.8。

1.4 統(tǒng)計分析

愈傷組織形成率=形成愈傷組織的雄蕊數(shù)/接種雄蕊總數(shù)×100%。

體細胞胚形成率=形成體細胞胚的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)×100%。

子葉形體細胞胚形成率=形成子葉形體細胞胚的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)×100%。

試驗結(jié)果采用SPSS的Ducan法進行差異性分析。

1.5 體胚苗倍性鑒定

體胚苗倍性鑒定用Sysmex Cy-Flow?Cube8流式細胞儀進行。鑒定方法參考儀器附送試劑使用方法（http://www.sysmex-partec.com），即取200 mg新鮮葉片置于塑料培養(yǎng)皿中，添加0.5 mL裂解緩沖液，用刀片快速切碎，30 μm孔徑濾網(wǎng)過濾，添加1.6 mL DAPI染色體液，室溫靜置30 s后上機檢測。每株體胚苗隨機取1片葉片進行檢測。流式數(shù)據(jù)使用機器自帶軟件作圖。以已知二倍體和三倍體植株葉片混合檢測作圖為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 系譜分析

根據(jù)親本來源，對國家橡膠樹種質(zhì)資源圃保存的32個橡膠樹品種進行系譜分析，試驗所用32個橡膠樹品種分別屬于初生代無性系、次生代無性系、三生代無性系和四生代無性系（圖1）。PR107、GT1、PB86、Tjirl、海墾1、天任31-45、合口3-11這7個品種為初生代無性系，其余25個品種中的23個與以上7個初生代無性系中的1～3個存在親緣關(guān)系，表明我國橡膠樹栽培品種親本來源狹窄。此外，圖1系譜中，含初生代無性系遺傳背景的后代中，以含PR107親本的后代最多，共有14個，以PR107為父本的品種有GT1、93-114、RRIM513、PB86、RRIM600、海墾1共6個母本組。

圖1 橡膠樹系譜和花藥體胚發(fā)生能力差異分析Fig.1 Pedigree analysis of rubber tree and analysis of differences in anther embryogenic ability

2.2 花藥愈傷組織和體細胞胚誘導(dǎo)

橡膠樹花藥愈傷組織、體細胞胚和體胚苗的誘導(dǎo)過程見圖2。參試32個品種均能誘導(dǎo)出愈傷組織，多數(shù)品種在M培養(yǎng)基和S培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率接近，其中，31個品種的愈傷組織形成率均達50%以上（表1），表明所試愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基在橡膠樹花藥愈傷組織誘導(dǎo)中具有廣譜性。

圖2 橡膠樹花藥體胚苗的誘導(dǎo)過程圖Fig.2 The Induction process of anther somatic embryo plantlet of rubber tree

愈傷組織轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)體胚發(fā)生的E培養(yǎng)基后，來自M培養(yǎng)基和S培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織在大多數(shù)品種上體細胞胚誘導(dǎo)率較接近，只有個別品種存在顯著性差異。23個品種能夠誘導(dǎo)形成體細胞胚，且有14個品種能夠誘導(dǎo)形成子葉形體細胞胚和體胚苗，其中，熱研73397、熱研88-13、熱墾525和徐育3這4個品種的體細胞胚誘導(dǎo)率在50%以上，說明所試體胚發(fā)生培養(yǎng)基在橡膠樹體胚發(fā)生中具有通用性，但仍有14個品種的體細胞胚誘導(dǎo)率在10%以下，且有9個品種未能誘導(dǎo)出體細胞胚（表1）。

表1 不同橡膠樹品種花藥愈傷組織、體胚、子葉形體胚誘導(dǎo)率Table 1 Induction rate of anther callus,somatic embryo,cotyledon somatic embryo of different rubber tree cultivars

2.3 體胚誘導(dǎo)率與系譜關(guān)系

根據(jù)品種體胚誘導(dǎo)能力，將體胚誘導(dǎo)率<10%的品種定義為難誘導(dǎo)品種，體胚誘導(dǎo)率在≥10%且≤20%的品種定義為可誘導(dǎo)品種，體胚誘導(dǎo)率>20%的品種定義為易誘導(dǎo)品種（圖1）。7個初生代無性系中，GT1、PR107、天任31-45、Tjirl屬于難誘導(dǎo)品種，合口3-11屬于可誘導(dǎo)品種，PB86和海墾1屬易誘導(dǎo)品種。12個次生代無性系中，云研77-2、云研77-4、云研73-46、保亭1-285、93-114、RRIM513、IAN873屬于難誘導(dǎo)品種，RRIM600、文昌217屬于可誘導(dǎo)品種，大豐95、海墾2[5,17]、徐育141-2屬于易誘導(dǎo)品種。10個三生代無性系中，湛試32713、熱研217、保亭3412屬于難誘導(dǎo)品種，大豐117、文昌11屬于可誘導(dǎo)品種，PB235、徐育3、熱研917（熱研7-20-59）、熱研73397、熱研88-13屬于易誘導(dǎo)品種。4個四生代無性系中，熱墾628屬于可誘導(dǎo)品種，熱墾525、熱研879、熱研918（熱研8-333）屬于易誘導(dǎo)品種。分析發(fā)現(xiàn)，已知體胚誘導(dǎo)率的初生代、次生代、三生代和四生代無性系中難誘導(dǎo)體胚發(fā)生品種占比分別為57.1%、58.3%、30.0%、0.0%。

親本誘導(dǎo)能力決定其子代品種體胚誘導(dǎo)能力。

2個親本屬于難誘導(dǎo)品種，其雜交后代多數(shù)為難誘導(dǎo)品種，如 GT1×PR107、93-114×PR107、RRIM513×PR107這3個雜交組合的后代有7個，6個為難誘導(dǎo)品種，只有1個為可誘導(dǎo)品種；1個親本為難誘導(dǎo)品種，另1個為易或可誘導(dǎo)品種，其雜交后代多數(shù)屬于易或可誘導(dǎo)品種，如PB86×PR107、Tjir1×PB86、海墾 1×PR107、天任 31-45×合口 3-11、RRIM600×PR107、IAN873×PB235、熱研88-13×熱研217這7個雜交組合的后代有12個，其中，7個品種屬于易誘導(dǎo)品種，4個品種為可誘導(dǎo)品種，只有1個品種為難誘導(dǎo)品種。

具有相同親本的橡膠樹品種體細胞胚誘導(dǎo)率差異顯著，且存在超親現(xiàn)象。RRIM600×PR107子代熱研73397、熱研917和文昌11三個品種中，熱研73397的體胚誘導(dǎo)率和子葉形體胚誘導(dǎo)率分別為95.0±5%、23.1±8.2%，顯著性高于熱研917（47.6±19%、0.6±1%）、文昌 11（11.5±2.2%、0.6±1%）和雙親；海墾1×PR107子代徐育141-2和文昌217中，徐育141-2的體胚誘導(dǎo)率和子葉形體胚誘導(dǎo)率（48.1±34.2%、13.3±10.4%）顯著性高于文昌217（17.6±1.2%、0）和雙親；RRIM513×PR107子代熱研217和大豐117中，熱研217的體胚誘導(dǎo)率為零，而大豐117在M培養(yǎng)基上體胚誘導(dǎo)率達到15.6±0.7%，且顯著性高于雙親；GT1×PR107子代云研77-2、云研77-4、云研73-46和保亭1-285四個品種中，只有云研73-46在所試培養(yǎng)基上能夠誘導(dǎo)得到體胚。

2.4 體胚苗倍性鑒定

流式細胞儀倍性檢測結(jié)果（圖3和表2）表明：混合已知二倍體和三倍體植株葉片DNA相對含量在200和300位置均有波峰作為對照（圖3A），二倍體的DNA相對含量為200（圖3B），三倍體植株為300（圖3C），流式細胞儀倍性檢測可以準確鑒定出橡膠樹體胚苗的倍性。

圖3 流式細胞倍性檢測Fig.3 Flow cytometric analysis

橡膠樹不同基因型體胚苗倍性鑒定統(tǒng)計結(jié)果見表2，從15個品種共552株體胚苗倍性鑒定結(jié)果看，不同基因型體胚苗同其母本倍性一致，證明多基因型花藥體胚苗來源于體細胞。

表2 橡膠樹不同基因型體胚苗倍性檢測結(jié)果Table 2 Ploidy test results of somatic embryo plants of different genotypes of rubber tree

3 討論

3.1 本研究橡膠樹品種體胚誘導(dǎo)能力與已報道研究結(jié)果一致，部分品種體胚誘導(dǎo)率顯著性高于已有研究報道。

目前，未有深入開展橡膠樹多基因型體胚發(fā)生能力研究的報道，在檢索的少量研究報道中，橡膠樹品種熱研879花藥體細胞胚誘導(dǎo)率為10%～14%，RRIM600為11%～49%，熱墾525為51%左右，熱研73397為21%左右，都屬于易或可誘導(dǎo)體細胞胚品種；云研77-2、云研77-4、云研73-46、GT1和PR107花藥體細胞胚誘導(dǎo)率都在10%以下，甚至為0，都屬于難誘導(dǎo)體細胞胚品種，與本研究結(jié)果一致[17-23]。本研究的32個橡膠樹品種中，有18個品種的體細胞胚誘導(dǎo)率在10%以上，有14個品種能夠誘導(dǎo)得到子葉形體細胞胚，其中，熱研73397的體細胞胚誘導(dǎo)率最高達95%，熱研879的最高達32%以上，顯著高于前人的研究結(jié)果。

3.2 基因型是決定植物體細胞胚發(fā)生能力的關(guān)鍵因素，并且這種能力可遺傳。

Hodges等發(fā)現(xiàn)，在相同的培養(yǎng)條件下，玉米A188自交系的體細胞再生能力顯著高于其他品系，以其作為親本與無再生能力的自交系進行雜交，雜交后代具有再生能力；另外以兩個再生能力差的自交系進行雜交，雜交后代再生能力也差，表現(xiàn)出不同基因型玉米的體細胞再生能力有較大差異且可遺傳[31]。Parrott等發(fā)現(xiàn)，基因型對大豆體細胞胚發(fā)生能力有很大影響，有良好再生能力的品系在其系譜中都有一個或兩個高再生能力的祖先親本，且高再生能力基因型與低再生能力基因型的雜交F1代表現(xiàn)出中等再生能力，表明大豆體細胞再生能力可遺傳[32]。Niskanen等發(fā)現(xiàn)，父本和母本的基因型對歐洲赤松體細胞胚發(fā)生都有影響，在胚性組織起始誘導(dǎo)階段，母本的影響大于父本，在胚性組織長期繼代增殖階段，父本的影響相對母本增加[33]。在遺傳變異對甜根子草胚性愈傷組織誘導(dǎo)和再生能力研究中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)能力受遺傳變異顯著影響，而胚性愈傷組織的再生頻率不受遺傳變異影響，愈傷組織誘導(dǎo)能力與胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力及再生頻率密切相關(guān)，表明不同基因型的胚性愈傷組織誘導(dǎo)和再生頻率能夠基于愈傷組織誘導(dǎo)能力進行預(yù)測[34]。在橡膠樹體細胞胚發(fā)生方面，前人開展了部分品種的花藥體細胞胚發(fā)生研究，發(fā)現(xiàn)不同品種間的體細胞胚發(fā)生能力存在顯著差異[17-23]。本研究通過對32個橡膠樹品種的花藥愈傷組織和體細胞胚誘導(dǎo)情況進行分析，發(fā)現(xiàn)橡膠樹愈傷組織誘導(dǎo)能力不存在明顯的基因型影響，而體細胞胚發(fā)生能力存在明顯的基因型影響；對于橡膠樹不同品種來說，子代的體細胞胚形成率與親本體細胞胚發(fā)生能力相關(guān)，父本和母本均影響子代體細胞胚發(fā)生能力，至少含一個易于誘導(dǎo)或可誘導(dǎo)親本，子代才易于或可誘導(dǎo)體胚，表明橡膠樹體細胞胚發(fā)生能力可遺傳。另外本研究發(fā)現(xiàn)，已知體胚誘導(dǎo)率的初生代、次生代、三生代和四生代無性系中難誘導(dǎo)體胚發(fā)生品種占比依次減少，推測隨著易誘導(dǎo)親本與難誘導(dǎo)親本的雜交，后代中易誘導(dǎo)體胚發(fā)生品種有逐漸增多的趨勢。

3.3 植物體細胞再生能力遺傳復(fù)雜，表現(xiàn)為由多基因控制；可通過改進培養(yǎng)條件、連續(xù)再生馴化和過表達再生基因等途徑提高體細胞再生能力、減少基因型依賴。

Gawel等將能產(chǎn)生體細胞胚的棉花品種與不能產(chǎn)生體細胞胚的品種進行雜交，分析了后代的體細胞胚發(fā)生能力，統(tǒng)計結(jié)果表明棉花體細胞胚發(fā)生是由多基因參與控制的[35]。葉興國等選用13個小麥親本基因型及其F1代進行花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)小麥花藥培養(yǎng)力的遺傳控制非常復(fù)雜，表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳[36]。何平等用同一種培養(yǎng)基培養(yǎng)秈粳雜交F1代群體110個株系的花藥，結(jié)果表明水稻花藥培養(yǎng)力是由多基因控制的[37]。張曉玲等對來源于美國、墨西哥和中國的144份不同玉米自交系幼胚胚性愈傷組織的再生能力相關(guān)性狀進行研究，結(jié)果表明玉米幼胚培養(yǎng)性狀的遺傳變異受多基因調(diào)控[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，具有相同親本的橡膠樹品種體細胞胚誘導(dǎo)率差異顯著，且存在超親現(xiàn)象，表明橡膠樹體細胞胚發(fā)生能力的遺傳控制復(fù)雜，推測橡膠樹體細胞胚發(fā)生也是由多基因參與控制的。

Hargreaves等改進了胚性細胞系的啟動和早期增殖方法，在20個控制授粉的輻射松合子胚培養(yǎng)中得到成功應(yīng)用，顯著好于以前結(jié)果，表明有可能通過改進培養(yǎng)條件，打破遺傳背景的影響[39]。李健英等經(jīng)過連續(xù)再生馴化（SRA）的方法提高了棉花再生和轉(zhuǎn)化效率，并在非胚性愈傷組織時期外施DNA甲基化抑制劑促進了體細胞胚發(fā)生[40]。王軻等通過在小麥中過表達再生基因TaWOX5，顯著提高了小麥組織培養(yǎng)再生植株和轉(zhuǎn)化效率，促進了質(zhì)量較差愈傷組織的分化，基本克服了基因型依賴，而且未出現(xiàn)過表達WUS2和BBM等再生基因時出現(xiàn)的影響愈傷組織分化和根系生長或?qū)е禄沃仓甑谋锥耍瑫r該基因在大麥、小黑麥、黑麥、玉米中的再生和轉(zhuǎn)化作用也得到了驗證[41]。本研究中多個橡膠樹品種的體細胞胚誘導(dǎo)率顯著高于前人的研究結(jié)果，推斷得益于培養(yǎng)基改進。

3.4 結(jié)合體胚誘導(dǎo)率，通過基因型分組優(yōu)化橡膠樹品種體胚發(fā)生條件和在育種上應(yīng)用

在目前栽培的主要橡膠樹品種中，含PB86、RRIM600、熱研88-13和海墾1等親本的后代基本為容易或可誘導(dǎo)體胚的品種類型；含GT1、天任31-45、93-114和RRIM513等親本的后代體胚誘導(dǎo)率較低；含PR107親本的后代體胚誘導(dǎo)難易均有，當其后代親本中不含易或可誘導(dǎo)親本遺傳基礎(chǔ)時，后代體胚誘導(dǎo)率低，如母本中含GT1、93-114和RRIM513等親本的PR107后代體胚誘導(dǎo)率低，當其后代親本中含有易或可誘導(dǎo)親本時，后代體胚誘導(dǎo)率高，如母本中含PB86、RRIM600和海墾1等親本的PR107后代基本為容易或可誘導(dǎo)體胚的品種類型。本研究結(jié)果為今后橡膠樹體胚發(fā)生培養(yǎng)體系的優(yōu)化指明了方向，可以按親本進行分組，進一步優(yōu)化體胚培養(yǎng)條件，如含PB86、RRIM600、熱研88-13和海墾1等遺傳基礎(chǔ)的后代可在現(xiàn)有培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化，得到適宜培養(yǎng)條件，如含GT1、天任31-45、93-114和RRIM513等遺傳基礎(chǔ)的后代需在現(xiàn)有培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上進行大幅度的調(diào)整和優(yōu)化，如從外植體選擇與處理、基本培養(yǎng)基篩選、新藥品探索、連續(xù)再生馴化、過表達再生基因等更多方向開展試驗。同時本研究結(jié)果可以為橡膠樹的傳統(tǒng)雜交育種提供參考，以性狀優(yōu)良且體胚誘導(dǎo)率高的橡膠樹品種為親本配置雜交組合，獲得高體胚誘導(dǎo)率的優(yōu)良子代幾率大，也為高產(chǎn)高抗無性系優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因育種研究提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過對32個橡膠樹品種的遺傳關(guān)系和體胚發(fā)生能力進行比較分析，發(fā)現(xiàn)體胚誘導(dǎo)率存在顯著的基因型差異，且這種差異可遺傳。依據(jù)體胚誘導(dǎo)率和遺傳關(guān)系，將親本的誘導(dǎo)率同子代的誘導(dǎo)率結(jié)合進行分析并分組，為通過基因型分組優(yōu)化橡膠樹多品種體胚發(fā)生提供了依據(jù)。結(jié)果表明，親本PB86、RRIM600、熱研88-13和海墾1及其后代可按本研究所采用的培養(yǎng)條件進行小幅度優(yōu)化，得到更適合的培養(yǎng)條件；親本GT1、天任31-45、93-114和RRIM513及其后代需要在現(xiàn)有培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上進行大幅度的優(yōu)化，以明確其培養(yǎng)條件。本研究中多個橡膠樹品種的體細胞胚誘導(dǎo)率顯著高于前人的研究結(jié)果。另外，本研究通過對15個品種的體胚苗進行倍性鑒定，證明不同基因型花藥體胚苗均來源于體細胞。