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    山東省側(cè)柏枝枯病病原菌鑒定及其致病性測定

    2022-08-03 10:58:04劉在哲亓玉昆張玉嬌付翠翠劉保友王清海
    林業(yè)科學研究 2022年4期
    關鍵詞:枯病側(cè)柏分生孢子

    劉在哲,亓玉昆,呂 娟,張玉嬌,張 偉,劉 云,付翠翠,劉 慇,劉保友,王清海*

    (1.濟南市林場,山東 濟南 250014;2.山東省林業(yè)科學研究院,山東 濟南 250014;3.濟南市園林和林業(yè)科學研究院,山東 濟南 250103;4.山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院,山東 煙臺 265500)

    側(cè)柏(Platycladus orientalis (L.) Franco),屬柏科(Cupressaceae)側(cè)柏屬(Platycladus)常綠喬木,耐干旱貧瘠,適應范圍廣,是我國荒山造林的先鋒樹種,也是重要的園林綠化樹種,除新疆、青海外,全國均有分布。側(cè)柏種植在防風固沙、調(diào)節(jié)生態(tài)氣候等方面具有重要意義。側(cè)柏是高齡樹種,一些歷史風景名勝地現(xiàn)存的古柏更是中華民族五千年歷史文明的見證及珍貴歷史文化遺存,具有極其重要的自然景觀價值和歷史價值。

    側(cè)柏葉枯病是一種重要的側(cè)柏葉部病害,在我國江蘇、安徽、陜西等地大面積發(fā)生,在江蘇盱眙縣側(cè)柏被害率達100%,病情指數(shù)高達50.0以上,危害嚴重時,側(cè)柏干枯死亡,已成為我國側(cè)柏最重要的病害之一[1]。目前的研究表明,Alternaria pruni McAlpine[2]、A.alternata (Fr.) Keissler、Pestalotiopsis gracilis (Kleb.) Steyaert、Chloroscypha platycladus Y.S.Dai[3]、Monochaetia sp.[4]和Keithia thujina Durand[5]均可以引起側(cè)柏葉枯病。由于生長地理位置及生境差異,病原有所不同。2020年作者發(fā)現(xiàn)在濟南市林場、千佛山風景區(qū)等側(cè)柏林中,側(cè)柏鱗葉出現(xiàn)枯黃脫落現(xiàn)象,病株率達90%以上,危害嚴重的側(cè)柏整株枯死。濟南市側(cè)柏面積8.25萬hm2,側(cè)柏枝枯病主要發(fā)生于枝葉部,造成側(cè)柏樹勢衰弱,可能誘發(fā)雙條杉天牛、小蠹蟲等次期性害蟲的危害,造成側(cè)柏林成片干枯,影響綠化效果,造成嚴重的生態(tài)和經(jīng)濟損失。為有效控制危害,明確病原種類是十分必要的。因此,本研究通過形態(tài)特征、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析以及致病性測定,明確在濟南市引起側(cè)柏枝枯的致病因子,以期為該病害的發(fā)生、流行規(guī)律及其防治提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    感病的側(cè)柏枝條及鱗葉,從山東省濟南市佛慧山(36°37′37″ N,117°2′44″ E)、仰山(36°36′26″ N,117°1′43″ E)、螞蚱鞍子山(36°37′21″ N,117°44′46″ E)、廻龍山(36°37′25″ N,117°4′26″ E)側(cè)柏林采集。

    1.2 方法

    1.2.1 側(cè)柏病組織疑似病原菌分離及分離菌單孢培養(yǎng) 采用組織分離法。先用70%乙醇將樣品表面消毒,然后在側(cè)柏細枝、鱗葉病健交界處利用無菌解剖刀取5 mm2的組織塊,依次用3%次氯酸鈉浸泡1 min,無菌水沖洗3次。將處理好的組織塊置于PDA平板上,每個平皿放置5塊,25 ℃培養(yǎng)3 d。將生長的菌落純化轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上,25 ℃下培養(yǎng),采取孢子稀釋分離法獲取單菌落。分離獲得的菌株均保存于山東省林業(yè)科學研究院森林保護研究所。

    1.2.2 分離菌致病性測定 分離菌株致病性測定采用室內(nèi)離體接種法及室外活體接種法。室內(nèi)離體接種法,選擇健康的側(cè)柏細枝條,自來水沖洗干凈,晾干后,用70%酒精表面消毒,備用。將分離獲得的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d,在菌落邊緣用打孔器制作菌餅(?=5 mm),轉(zhuǎn)移至低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(SNA)平板上,菌餅菌絲貼在平板上,在菌餅周圍放置2根無菌松針,紫外燈照射條件下培養(yǎng)10 d誘導產(chǎn)孢。將孢子配置成106孢子·mL?1孢子懸浮液,備用。先用無菌的挑針(?=0.5 mm)輕微刺傷鱗葉,在傷口處滴200 μL孢子懸浮液,以無菌水為對照。將處理后的枝條置于含有少量無菌水的無菌燒杯中,用保鮮膜封閉,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,觀察。每組試驗各做5次平行處理,重復2次。

    室外活體接種,選用健康無病生長一致的播種2年生盆栽側(cè)柏苗進行活體接種。鱗葉用挑針刺傷,干基部用無菌手術刀做“T”傷口,在傷口處滴200 μL 孢子懸浮液,并放上無菌水浸濕的脫脂棉,用剪好的封口膜包扎,以接種無菌水為對照。為了防止水分蒸發(fā)過快,每一株側(cè)柏用黑色塑料袋包裹,2 d后除去黑色塑料袋,每天進行觀察;每組試驗各做5次平行處理,重復2次。

    1.2.3 病原鑒定

    1.2.3.1 形態(tài)特征觀察 將分離獲得的單孢菌株在PDA培養(yǎng)基平板活化培養(yǎng)5 d,在菌落邊緣利用打孔器制作菌餅(?=5 mm),將菌餅置于PDA、MEA平板中央,每個平板置1塊菌餅,25 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培養(yǎng),觀察記錄菌落特征。

    1.2.3.2 分子生物學鑒定 DNA的提取采用改進的CTAB法。擴增的目的基因分別為核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)、翻譯延伸因子?1α(TEF1-α)、β-微管蛋白(TUB2)。引物序列及擴增反應條件參數(shù)見表1。擴增反應體系為25 μL,其中2 μL DNA 模板、8.5 μL ddH2O、12.5 μL Taq 酶 mix、各1 μL上下游引物。PCR擴增產(chǎn)物由上海派森諾生物科技有限公司進行雙向測序。

    表1 PCR 擴增所用引物及反應程序Table 1 Primers used in this study,with sequence and PCR conditions

    將獲得的ITS、TEF1-α和TUB2序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫,并利用Blast進行比對。選取38株Neofusicoccum sp.菌株作為參考菌株,以Botryosphaeria dothidea (CBS 115 476)、Dothiorella iberica (CBS 115 041) 和D.sarmentorum (IMI63581b) 作為外圍菌株(表2)。利用 Fasta alignment joiner 軟件(https://usersbirc.au.dk/~palle/php/fabox/alignment_joiner.php#)通過首尾相連的方法,將 ITS、TEF1-α和TUB2基因串聯(lián)。利用MEGA 7.0 軟件,采用最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹,循環(huán)1 000次,并以自展支持率(Bootstrap)校對檢測。

    表2 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的參考菌株序列Table 2 Strains and sequences of the genus Neofusicoccum used in this study

    2 結(jié)果與分析

    2.1 側(cè)柏枝枯病癥狀

    危害葉片,多由葉片前端或中部枯黃、變褐枯死。危害細枝,呈段斑狀變褐(圖1a,b)。在枯死的鱗葉和細枝上產(chǎn)生黑色的顆粒物(圖1d)。樹冠內(nèi)部和下部發(fā)生嚴重。嚴重時,葉片大量脫落,枝條枯死,在主干或枝干上萌發(fā)出一叢叢的小枝葉,形成所謂“樹胡子”。連續(xù)數(shù)年受害,最終全株枯死(圖1c)。

    圖1 側(cè)柏枝枯病癥狀(a)~(c)林間癥狀;(d)在側(cè)柏鱗葉和枝條上產(chǎn)生的子實體;(e)分生孢子器縱切面Fig.1 Shoot blight disease symptom on Platycladus orientalis; (a)~(c) symptom in the field; (d) fruiting bodies produced on leaves and shoots (e) longitudinal section of pycnidium Bars=20 μm

    2.2 分離菌株致病性

    從4個地點共采集樣品20份,分離獲得菌株87株。根據(jù)菌落形態(tài)特征分為3種類型,其中鏈格孢屬真菌27株(31.0%),細菌菌株4株(4.6%),其余為1種真菌共56株(64.4%),菌落形態(tài)特征一致,分生孢子形態(tài)與側(cè)柏鱗葉和枝條上子實體分生孢子形態(tài)相似(圖1e)。

    選擇代表性菌株CBL-02、CBL-03和CBCB-02菌株室內(nèi)離體接種7 d后,在鱗葉、枝條接種部位,均可以引起相同癥狀,致使側(cè)柏鱗葉變色,形成黑褐色病斑(圖2a),枝條接種點黑褐色(圖2d)。顯微觀察,在鱗葉、枝條接種部位均有黑色子實體產(chǎn)生(圖2b~d)。而空白對照未出現(xiàn)相應癥狀(圖2f)。室外活體接種30 d后,在接種部位側(cè)柏鱗葉變黃、枯死(圖2e)。接種60 d,枝條、鱗葉干枯脫落,側(cè)柏整株死亡(圖2g),與田間觀察癥狀一致。從接種發(fā)病部位重新分離,獲得的菌株與接種菌株形態(tài)特征一致。表明,分離菌株為側(cè)柏枝枯病的病原菌。

    圖2 致病性試驗(a)~(c)側(cè)柏葉片接種CBCB-02菌株7 d后癥狀及子實體; (d)側(cè)柏枝條接種CBCB-02菌株7d后癥狀及子實體;(e)2年生側(cè)柏苗接種CBCB-02菌株30 d癥狀;(f)對照;(g)2年生側(cè)柏苗接種CBCB-02菌株60 d癥狀;左邊為對照,右邊為處理。Fig.2 Pathogenicity test; (a)~(c) symptoms on Platycladus orientalis leaves inoculated with isolate CBCB-02 for 7 d; (d) symptoms on inoculation sites of P.orientalis shoot; (e) symptoms on seedlings (2-years) inoculated with isolate CBCB-02 for 30 d; (f) inoculated with sterile distilled water; (g) symptoms on seedlings (2-years)inoculated with isolate CBCB-02 for 60 d,L:control,R:treated

    2.3 側(cè)柏枝枯病病原菌鑒定

    在PDA培養(yǎng)基上,初期白色,稀疏,向四周擴散,培養(yǎng)5 d后,菌落達到平板邊緣(?=70 mm),菌絲開始呈現(xiàn)白色絮狀,菌絲致密,中期顏色逐漸變成灰色(圖3a),后期呈現(xiàn)深灰綠色,背面黑褐色,邊緣完整(圖3b)。在MEA培養(yǎng)基上,初期白色,絮狀向四周擴散生長,后漸變?yōu)榛野咨E囵B(yǎng)3 d,菌落達到平板邊緣(?=70 mm),菌落邊緣完整(圖3d),后期灰色、灰褐色,背面深灰綠色(圖3e)。沒有觀察到有性特征。分生孢子器于7 d內(nèi)產(chǎn)生于松針上,單生或聚生,外面包被白色菌絲,暗褐色至黑色(圖3c)。分生孢子單孢透明、梭形、橢圓形、卵球形,頂端鈍圓,基部平截,有時兩端變窄。無隔膜,表面光滑,大小為 20.6±2.4 μm×7.6±1.2 μm(L/W=2.7,n=50)(圖3f)。

    圖3 側(cè)柏枝枯病菌形態(tài)特征 (a)~(b)菌落形態(tài)(PDA培養(yǎng)7 d,14 d);(c)誘導培養(yǎng)基中著生在松針上的分生孢子座;(d)~(e)菌落形態(tài)(MEA 培養(yǎng) 3 d,7 d);(f)分生孢子Fig.3 Neofusicoccum occulatum (a)~(b) cultural character (cultured on PDA for 7 d,14 d),(c) conidiomata formed on pine needles in culture,(d)~(e) cultural character (cultured on MEA for 3 d,7 d),(f) conidia,Bars=50 μm

    2.4 側(cè)柏枝枯病病原菌多基因序列分析

    CBL-02、CBL-03、CBCB-02菌株與38株Neofusicoccum spp.參考菌株進行比對,以Botryosphaeria dothidea CBS115476、Dothiorella iberica CBS115041、D.sarmentorum IMI63581B為外圍菌株,基于 ITS、TEF1-α、TUB2基因序列數(shù)據(jù),運用最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建進化樹。CBL-02,CBL-03和CBCB-02菌株與Neofusicoccum occulatum聚在一個進化分枝上,自展支持率為 89%(圖4)。結(jié)合分離菌株形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀以及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析,本試驗獲得的菌株為N.occulatum Sakalidis,M.L.,Burgess,T.I.。

    圖4 利用最大似然法基于側(cè)柏葉枯病菌ITS、TEF-1α和TUB2的基因數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。自展支持率標于節(jié)點處,以Botryosphaeria dothidea CBS115476、Dothiorella sarmentorum、D.iberica為外圍菌株,標尺指示 0.005 步變化。Fig.4 Phylogenetic tree of all isolates tested with allied taxa calculated with sequence data of concatenated ITS,TEF-1α and TUB2 using maximum likelihood method (1,000 bootstrap replicates; bootstrap values indicated at nodes.Botryosphaeria dothidea,Dothiorella sarmentorum and D.iberica represent the out group.The scale bar indicates the number of expected changes per site.

    3 討論

    N.occulatum是Sakalidis 2011年[6]首次在澳大利亞的桉樹(Eucalyptus spp.),瓦勒邁杉(Wollemia nobilis W.G.Jones,K.D.Hill & J.M.Allen)上分離獲得。已有研究表明,N.occulatum已在非洲(烏干達)、大洋洲(澳大利亞、美國夏威夷)、南美洲(烏拉圭)、亞洲(泰國)等5個國家有分布,可以危害南洋杉(Araucaria cunninghamii Sweet),鄧恩桉(Eucalyptus dunnii Maiden),大桉(E.grandis W.Mill ex Maiden),巨桉雜交種(E.grandis hybrid),粗皮桉(E.pellita F.V.Muell.),桉樹(Eucalyptus sp.),尾葉桉和赤桉雜交種(Eucalyptus urophylla S.T.Blake x E.camaldulensis Dehnh.),瓦勒邁杉(W.nobilis),銀樺(Grevillea sp.),Blepharocalyx salicifolius (Kunth) O.Berg,藍莓(Vaccinium spp.),葡萄(Vitis vinifera L.),束花石斛(Dendrobium chrysanthum Wall.ex Lindl.)等寄主植物[7-9]。本研究結(jié)果表明N.occulatum已在我國有分布,這是國內(nèi)有關N.occulatum的首次報道。目前,對N.occulatum的研究僅局限分類研究,其生物學、生態(tài)學、流行學、種群遺傳結(jié)構(gòu)和有效的防治措施尚需進一步系統(tǒng)研究。

    據(jù)已有的文獻報道,新殼梭孢屬真菌(Neofusicoccum sp.)可以危害美國扁柏(Chamaecyparis lawsoniana (A.Murray bis)Parlatore)、日本扁柏(Ch.Obtuse (Siebold et Zuccarini) Enelicher)、日本花柏(Ch.pisifera(Siebold et Zuccarini) Enelicher)、 柏 木(Cupressus funebris Endl.)、地中海柏木(Cu.sempervirens L.)、歐洲刺柏(Juniperus communis L.)、北美香柏(Thuja occidentalis L.)、北美喬柏(T.plicata Donn ex D.Don)、羅漢柏(Thujopsis dolabrata (Thunberg ex L.f.)Sieb.et Zucc.)、 巨 杉 (Sequoiadendron giganteum (Lindl.) J.Buchholz)[10],尚未見危害側(cè)柏的報道,是側(cè)柏上發(fā)生的一種新病害。

    4 結(jié)論

    本研究通過組織分離、單孢純化,致病性測定,表明獲得的單孢菌株CBL-02,CBL-03和CBCB-02均可以引起側(cè)柏枝枯病。通過形態(tài)學以及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析,證實分離獲得菌株為N.occulatum。

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