北京海坨山典型林分土壤固氮菌群落特征研究

史 策，聶立水＊，魏一凡，祝 琳，楊 昊，張潤(rùn)哲，聶浩亮，王 江，薄慧娟

（1.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083；2.河北農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，河北 石家莊 050051；3.成都市青白江區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 成都 610300；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西 晉中 030000）

固氮菌是森林生態(tài)系統(tǒng)中重要的功能菌群，它通過(guò)固氮酶的作用把大氣中分子態(tài)氮還原為植物可利用態(tài)氮[1-2]，為植物生長(zhǎng)提供氮素營(yíng)養(yǎng)。固氮菌在森林生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)，尤其是土壤氮循環(huán)中具有重要作用，其群落多樣性及結(jié)構(gòu)組成是土壤氮素固定及維持氮循環(huán)平衡的重要指標(biāo)[3-4]。研究森林土壤固氮菌群落多樣性及組成可對(duì)提高土壤氮素水平和森林土壤氮循環(huán)機(jī)理提供新認(rèn)識(shí)，可為森林植被恢復(fù)和森林經(jīng)營(yíng)提供科學(xué)依據(jù)。

已有研究表明固氮菌群落與植被類(lèi)型、土壤特性等因素有互作效應(yīng)[5-7]。植物群落通過(guò)凋落物和根系分泌物等影響固氮菌的種類(lèi)和豐度，而固氮菌通過(guò)改變土壤環(huán)境、土壤養(yǎng)分礦化等方式影響植物群落[8]。Templer 研究表明不同樹(shù)種土壤氮保留能力顯著差異[9]，并且在不同植被類(lèi)型下土壤固氮菌群落存在顯著差異[10]。土壤中的碳、氮含量及碳氮比顯著影響土壤固氮菌的活性及分布[5,7,11-13]。相較傳統(tǒng)研究方法，高通量測(cè)序技術(shù)由于其精確性而被廣泛應(yīng)用于微生物的研究中[14-15]，對(duì)于高通量測(cè)序檢測(cè)土壤固氮菌通常選用nifH作為分子標(biāo)記基因，因其是編碼鐵蛋白組分的基因且高度保守，在固氮微生物中都可以檢測(cè)到[16]。

北半球溫帶森林在調(diào)節(jié)全球碳平衡和減緩全球氣候變化進(jìn)程中扮演著重要角色[17-19]，華北地區(qū)是我國(guó)暖溫帶落葉闊葉林的重要分布區(qū)域，北京松山自然保護(hù)區(qū)是華北地區(qū)內(nèi)保持完好，植被類(lèi)型典型且豐富的自然保護(hù)區(qū)之一[20]，油松林（Pinus tabuliformis Carriere.）是保護(hù)區(qū)最具代表性的植被類(lèi)型，區(qū)內(nèi)還分布有核桃楸（Juglans mandshurica Maxim.）、山楊（Populus davidiana Dode.）、白樺（Betula platyphylla Suk.）、蒙古櫟（Quercus mongolica Fisch.）等常見(jiàn)暖溫帶落葉闊葉林[21]。目前已有對(duì)該地區(qū)不同林分類(lèi)型下土壤細(xì)菌和真菌的研究報(bào)道[22]，然而對(duì)不同林分下土壤固氮微生物群落特征及其與土壤理化性質(zhì)之間相互關(guān)系的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)4種典型林分（油松林、針闊混交林、蒙古櫟林、核桃楸林）下土壤為研究對(duì)象，以固氮酶鐵蛋白nifH 基因?yàn)榉肿影袠?biāo)[23-24]，采用Illumina MiSeq技術(shù)分析不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌的群落特征，探討該地區(qū)固氮菌群落的多樣性和結(jié)構(gòu)組成及與其土壤特性的關(guān)系，為了解土壤氮循環(huán)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為發(fā)揮暖溫帶森林土壤潛力和森林植被恢復(fù)重建等提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于北京市延慶區(qū)松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（115°43′44″～115°50′22″ E，40°29′9″～40°33′35″ N）。該區(qū)域位處燕山山脈海坨山南麓，海拔628～2 198 m，屬暖溫帶大陸性氣候，年平均氣溫8.9 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)2 836 h，年蒸發(fā)量1 772 mm，年降水量493 mm[20]。保護(hù)區(qū)內(nèi)成土母巖多為花崗巖，主要土壤類(lèi)型為山地棕壤、山地褐土和山地草甸土。保護(hù)區(qū)內(nèi)植被類(lèi)型豐富，包括草甸、灌木、喬木等，森林覆蓋率高達(dá)87.6%。保護(hù)區(qū)內(nèi)主要喬木為：白樺林、油松林、山楊林、核桃楸林、針闊混交林等。

2 研究方法

2.1 樣地設(shè)置

依據(jù)研究區(qū)內(nèi)油松林、針闊混交林、蒙古櫟林和核桃楸林4種典型林分類(lèi)型分布情況，在每種林型下設(shè)面積為20 m×20 m 3塊標(biāo)準(zhǔn)地，共12塊。分別對(duì)所選樣地進(jìn)行相關(guān)因子調(diào)查，樣地基本概況見(jiàn)表1。樣地中土壤類(lèi)型均為山地棕壤，石礫較少，多為壤土、碎屑類(lèi)結(jié)構(gòu)，成土母質(zhì)均為坡積母質(zhì)，林齡均為成熟林，林分起源均為天然林。

表1 樣地基本概況Table 1 General characteristics of forest stands

2.2 野外調(diào)查與采樣

于2019年7月進(jìn)行野外調(diào)查和樣品采集。在不同林型下隨機(jī)設(shè)置3塊20 m×20 m 的標(biāo)準(zhǔn)樣地，按五點(diǎn)法采集0～20 cm土樣，去除土樣內(nèi)凋落物和石礫，混合均勻后用四分法取100 g左右的土，裝入無(wú)菌自封袋中，共計(jì)12份土樣放入便攜式冰箱帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分放入?60 ℃冰箱保存，余下風(fēng)干研磨用作土壤特性分析。

2.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤特性采用常規(guī)分析方法：土壤pH 測(cè)定采用酸度計(jì)法；土壤全氮測(cè)定采用凱氏定氮法；土壤堿解氮測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法；土壤有效磷測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法；土壤速效鉀測(cè)定采用醋酸銨-火焰光度計(jì)法；土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用重鉻酸鉀-外加熱法[25]。

2.4 DNA提取及PCR擴(kuò)增

使用Omega Mag-bind soil DNA kit提取土壤微生物總DNA，合格后樣品保存于?80 ℃冰箱用于PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物選擇nifH-F（5′-AAAGGYG GWATCGGYAARTCCACCAC-3′）和nifH-R（5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3 ′）[26]，對(duì)fungene-nifH區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增3次，擴(kuò)增后的序列委托上海派森諾生物有限公司進(jìn)行測(cè)定。PCR 反應(yīng)體系：5×緩沖液 5 μL；dNTP（2.5 mM）2 μL；正向引物（10 uM）1 μL；反向引物（10 uM）1 μL；DNA 模板 1 μL；超純水 14.75 μL；快速 pfu DNA 聚合酶 0.25 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃ 預(yù)變性 5 min；98 ℃ 變性 30 s，63.7 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min。PCR 反應(yīng)后，取 5 μL 產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)序列質(zhì)量初步篩選出高通量測(cè)序的原始離線(xiàn)數(shù)據(jù)，并把數(shù)據(jù)上傳至NCBI平臺(tái)，序號(hào)為：SUB10898702。QIIME2 DADA2分析進(jìn)行OTU聚類(lèi)。采用CD-HIT方法，根據(jù)97% 的相似性對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)，以獲得每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，利用QIIME分析微生物α和β多樣性，在門(mén)和屬分類(lèi)水平上比較不同林型土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)組成差異。試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel、SPSS24.0和R完成。采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan 法比較不同林型的土壤特性、固氮菌多樣性的差異（p<0.05）。采用 Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)固氮菌多樣性與土壤特性之間的相關(guān)關(guān)系。采用冗余分析（RDA）檢驗(yàn)固氮菌結(jié)構(gòu)組成與土壤特性的關(guān)系。采用 Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)，分析優(yōu)勢(shì)固氮菌和土壤特性的相關(guān)性，運(yùn)用關(guān)聯(lián)熱圖展現(xiàn)微生物群落組成與土壤特性的關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 不同林分類(lèi)型下土壤特性

不同林分類(lèi)型的土壤特性見(jiàn)表2。方差分析和多重比較表明，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮及速效鉀在4種林型之間均有顯著差異，堿解氮含量表現(xiàn)為：針闊混交林 > 油松林 > 核桃楸林 > 蒙古櫟林，有效磷含量表現(xiàn)為：核桃楸林 > 蒙古櫟林 > 針闊混交林 > 油松林。

表2 不同林分類(lèi)型下土壤特性Table 2 Soil properties of forest stands

3.2 不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌多樣性

3.2.1 不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌α多樣性 不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌α多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，Chao1指數(shù)由高到低表現(xiàn)為：油松林 >針闊混交林 > 核桃楸林 > 蒙古櫟林，核桃楸林和蒙古櫟林之間差異不顯著（p＜0.05）。Shannon指數(shù)由高到低表現(xiàn)為：油松林 > 針闊混交林 > 核桃楸林 > 蒙古櫟林，針闊混交林和核桃楸林之間差異不顯著（p＜0.05）。

表3 不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌α多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of soil nitrogen-fixing bacteria of forest stands

3.2.2 不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌β多樣性 為進(jìn)一步明晰樣本間在群落物種組成上的差異性，基于Bray-Curtis距離算法并采用 PCoA 分析衡量4種林型土壤固氮菌群落物種組成的相似度。圖1表明，每種林型的3個(gè)重復(fù)均聚類(lèi)于同一象限，且每種林分集合間距較大，PCo1 和PCo2分別解釋變量方差的41.7%、21.5%，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)63.2%。表明4種林分類(lèi)型下土壤固氮菌群落組間差異遠(yuǎn)大于組內(nèi)差異。

圖1 不同林型下土壤固氮菌群落主坐標(biāo)分析（PCoA）Fig.1 Principal coordinate analysis （PCoA） analysis of soil nitrogen-fixing bacteria of different forest stands

3.3 不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌群落組成及豐度差異物種分析

為解析不同林型下土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的變異規(guī)律，對(duì)聚類(lèi)后的 OTU 代表序列進(jìn)行物種注釋。4種林型土壤樣品中的 OTU 隸屬于 4 門(mén) 6 綱 13目 16 科 29 屬。將相對(duì)豐度低于 1% 以及在該水平上沒(méi)有注釋結(jié)果的歸于 Others。4種林型土壤固氮菌在門(mén)和屬水平上的群落組成見(jiàn)圖2。

在門(mén)分類(lèi)水平上（圖2A），4種林型土壤固氮菌均以變形菌門(mén) （Proteobacteria）為主，其相對(duì)豐度范圍是91.87%～73.89%。變形菌門(mén)的組成比例在針闊混交林土壤中最高（91.87%），在蒙古櫟林中比例最低（73.89%）。同時(shí)在4種林型中還含有酸桿菌門(mén)（Acidobacteria），其相對(duì)豐度范圍是7.91%～0.40%。另外，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）僅存在于油松林和針闊混交林土壤中，含量分別為4.97% 和1.76%。雖然群落組成相似，但是各菌門(mén)含量差異顯著。

圖2 不同林型土壤固氮菌在門(mén)和屬水平上的群落組成Fig.2 The soil nitrogen-fixing bacteria community compositions of different forest stands on phylum（a） and genus（b） level

在屬水平上，取所有樣本中平均相對(duì)豐度前10 位的菌群，結(jié)果表明4種林型下共有菌屬為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium），相對(duì)豐度為39.24%～16.36%、廣泛固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬（Azohydromonas），相對(duì)豐度為38.48%～5.98%、斯克爾曼氏菌屬（Skermanella），相對(duì)豐度為28.24%～4.41%、弗蘭克氏菌屬（Frankia），相對(duì)豐度為7.91%～0.40%、中生根瘤菌屬（Mesorhizobium），相對(duì)豐度為9.69%～0.34%、固氮螺菌屬（Azospirillum），相對(duì)豐度為4.64%～0.17%。地桿菌屬（Geobacter）僅存在于油松林和針闊混交林下土壤中，海細(xì)菌屬（Marinobacterium）僅存在于油松林下土壤中，伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）僅存在于核桃楸林下土壤中。

按照97%序列相似性劃分 OTU，根據(jù) Bray-curtis 指數(shù)計(jì)算距離，得到相似性矩陣，進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)差異分析。由 Venn 圖可見(jiàn)（圖3），4 種林型下共有 OTUs 數(shù)目為53個(gè)。其中，油松林與針闊混交林共有OTUs數(shù)目為124個(gè)，針闊混交林與蒙古櫟林、核桃楸林共有OTUs數(shù)目78個(gè)，同為闊葉林的蒙古櫟林與核桃楸林共有OTUs數(shù)目為181個(gè)。油松林土壤中所含特有OTUs數(shù)量最多為448個(gè)，核桃楸林土壤中特有OTUs最少為71個(gè)。

圖3 不同林型下土壤固氮菌的群落差異分析Fig.3 The variance analysis of soil nitrogen-fixing bacteria community of different forest stands

3.4 不同林型下土壤固氮菌群落與土壤理化因子的關(guān)聯(lián)分析

3.4.1 土壤特性與土壤固氮菌群落多樣性的關(guān)系土壤特性與固氮菌的α 和β 多樣性的相關(guān)性分析如表4 所示。固氮菌α多樣性與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和速效鉀呈極顯著正相關(guān)，堿解氮與Chao1指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，與Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)，土壤有效磷與Chao1指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。β多樣性數(shù)值為相應(yīng)兩個(gè)樣本之間距離（距離矩陣的類(lèi)型依據(jù)算法參數(shù)選擇而定）。固氮菌的 β 多樣性與土壤有機(jī)質(zhì)和全氮呈極顯著負(fù)相關(guān)，這與α多樣性相反，而β 多樣性與土壤速效鉀呈及顯著正相關(guān)。

表4 土壤性質(zhì)和固氮菌群落α和β多樣性的相關(guān)性系數(shù)Table 4 Correlation coefficients between soil properties and α,β diversity of soil nitrogenfixing bacteria community

3.4.2 土壤特性與土壤固氮菌群落組成的關(guān)系采用冗余分析（Redundancy analysis,RDA）探究影響4種不同林型下土壤固氮菌群落組成的環(huán)境因子（圖4）。主成分1（48.85%）和主成分2（16.63%）累計(jì)解釋土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)變異的65.43%。土壤全氮和有機(jī)質(zhì)是影響土壤固氮菌群落組成的主要土壤特性因子。

圖4 不同林型下土壤固氮菌群落與土壤特性的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis（RDA）between soil properties and soil nitrogen-fixing bacteria community of different forest stands based on Bray-Curtis

采用Spearman相關(guān)性系數(shù)分析4種林型土壤特性與土壤固氮菌群落組成的相關(guān)性，豐度前20菌屬的相關(guān)性熱圖（圖5）。其中與土壤速效鉀含量呈顯著相關(guān)的菌屬有9個(gè)，全氮8個(gè)，有機(jī)質(zhì)5個(gè)，堿解氮3個(gè)，pH 2個(gè)。

圖5 土壤固氮菌菌屬與環(huán)境因子的相關(guān)性熱圖Fig.5 Correlation heat maps between the genus of soil nitrogen-fixing bacteria and soil chemical factors.

4 討論

4.1 不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)

不同林分類(lèi)型的群落結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致凋落物的質(zhì)量和根系分泌物存在差異，對(duì)土壤特性造成影響，從而間接影響固氮菌種間的競(jìng)爭(zhēng)力，使整個(gè)固氮菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[27-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌多樣性存在顯著差異，且油松林下土壤固氮菌多樣性最高，這與牛艷芳對(duì)賀蘭山區(qū)和大青山的油松林下土壤固氮菌研究一致[31-32]。固氮菌大部分是異養(yǎng)型微生物，充足的凋落物和豐富的有機(jī)質(zhì)能為固氮菌提供利于它們生長(zhǎng)繁殖的養(yǎng)分[33-34]，本研究中，油松林下凋落物層厚度厚達(dá)7.0 cm，這為固氮菌生長(zhǎng)繁殖提供了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。同為落葉闊葉林的蒙古櫟林與核桃楸林Shannon指數(shù)存在顯著差異，PCoA分析固氮菌β多樣性也明顯區(qū)分出不同林型下土壤固氮菌，這說(shuō)明不同樹(shù)種形成的林分是決定土壤固氮菌多樣性的關(guān)鍵因素。

本研究結(jié)果顯示，不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌群落組成結(jié)構(gòu)存在顯著差異，固氮菌優(yōu)勢(shì)門(mén)、屬各占其總種群的40%以上，不同林型下土壤固氮菌群落組成結(jié)構(gòu)差異主要是由其豐度不同和稀少種不同導(dǎo)致的。不同微生物群落對(duì)環(huán)境變化和適應(yīng)能力存在差別，森林的生物固氮功能也會(huì)對(duì)不同環(huán)境做出差別響應(yīng)，因此造成不同區(qū)域優(yōu)勢(shì)固氮微生物產(chǎn)生差異。本研究區(qū)固氮菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)，呂雪麗發(fā)現(xiàn)亞熱帶季風(fēng)氣候森林土壤固氮菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為酸桿菌門(mén)，溫帶大陸性山地氣候蒙古櫟林下土壤固氮菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為酸桿菌門(mén)和變形菌門(mén)。本研究中固氮菌優(yōu)勢(shì)菌屬為慢生根瘤菌屬、廣泛固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬和斯克爾曼氏菌屬。慢生根瘤菌可以在寄主植物根部膨大生成根瘤，它們可固定大氣氮為寄主植物可利用氮，而有些固氮菌會(huì)在特定條件下以游離狀態(tài)固定大氣氮[35-36]。盡管斯克爾曼氏菌的基因組內(nèi)含nifH 基因，但是目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)斯克爾曼氏菌屬的物種能夠固定N2[37]。

4.2 土壤特性對(duì)土壤固氮菌的影響

在相同的氣候環(huán)境條件下，不同樹(shù)種的根系分泌物不同及凋落物化學(xué)組分和分解速率不同[38-40]，導(dǎo)致輸入到土壤中的有機(jī)養(yǎng)分不同，造成林下土壤特性差異顯著。相關(guān)研究表明，落葉針葉林的凋落物中含有難以分解的木質(zhì)素、丹寧、蠟等高分子有機(jī)物，導(dǎo)致凋落物分解較為緩慢，累積起來(lái)凋落物質(zhì)量較多，厚重的凋落物層覆蓋在土壤表面，從而降低了土壤養(yǎng)分被利用的速率，加速了土壤養(yǎng)分的積累并為固氮菌生長(zhǎng)提供養(yǎng)分[41]。本研究中，蒙古櫟林下土壤pH為5.87，與其它闊葉林相比，蒙古櫟凋落物質(zhì)量較少，且凋落物中N含量較低、C/N較高、木質(zhì)素含量較高[42]等因素導(dǎo)致蒙古櫟林下土壤pH值偏低。沈秋蘭[43]等對(duì)闊葉林改種毛竹后土壤固氮菌多樣性變化的研究表明，不同樹(shù)種下土壤固氮菌豐度和群落多樣性差異顯著，導(dǎo)致這種結(jié)果這不僅是地上植物類(lèi)型的改變，土壤性質(zhì)差異也是原因之一。森林土壤固氮菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的差異主要是不同的土壤條件所造成的，如土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮和有效磷等[11,44-47]。本研究通過(guò)Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)固氮菌多樣性和土壤環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)土壤特性對(duì)不同林型下土壤固氮菌多樣性均有不同程度的影響，其中土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷和速效鉀均與固氮菌多樣性存在相關(guān)關(guān)系，且大部分土壤特性與固氮菌α多樣性呈正相關(guān)。這可能說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，土壤有效養(yǎng)分含量與固氮菌α多樣性呈正比。以往研究表明土壤pH是影響土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子[48]，但本研究中，固氮菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與土壤pH并沒(méi)有相關(guān)性，有可能是因?yàn)樵囼?yàn)區(qū)土壤pH范圍較窄為5.87～6.93。RDA分析顯示，土壤特性對(duì)土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)變化的解釋度為65.43%，土壤全氮和有機(jī)質(zhì)是影響土壤固氮微生物群落組成的主要土壤特性因子。對(duì)于固氮菌來(lái)說(shuō)，固氮過(guò)程會(huì)消耗大量用于生長(zhǎng)的碳、氮等能源物質(zhì)，土壤氮和碳含量不僅是影響土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和功能的重要因素，而且對(duì)調(diào)節(jié)土壤氮循環(huán)起到一定作用[49]。圖5表明，不同種類(lèi)的固氮菌與土壤性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系結(jié)果差異很大，相關(guān)性分析表明慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）與土壤全氮、堿解氮和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系。研究表明慢生根瘤菌是化能自養(yǎng)型細(xì)菌[50]，且慢生根瘤菌具有很強(qiáng)的固定CO2的能力[51]，并在所有土壤中存在。它可以使用還原態(tài)的無(wú)機(jī)物作為能源，例如NH4+、NO2?、S2?、H2S、H2和Fe2+等作為自養(yǎng)生長(zhǎng)的能源。

綜上，林分類(lèi)型、土壤特性、固氮菌三者之間相互影響，存在協(xié)同演變機(jī)制。然而影響土壤固氮菌的因子還有很多，例如凋落物、季節(jié)變化、地理位置、氮沉降等生態(tài)環(huán)境因子[52]，并且微生物群落的分布并非是均勻的[53]，不同樣點(diǎn)間局部植被和環(huán)境的差異可能引發(fā)土壤固氮菌性質(zhì)差異，因此還需要增加重復(fù)樣品采集數(shù)量，多尺度地來(lái)探討其對(duì)土壤固氮菌的影響。在今后研究中，有必要綜合考慮微生物特征及其影響因素，具體分析固氮菌與植物、土壤之間的耦合機(jī)制。

5 結(jié)論

不同林分類(lèi)型下土壤固氮菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)組成存在顯著差異。α多樣性分析顯示油松林下土壤固氮菌多樣性最高，β多樣性顯示4種林分類(lèi)型下土壤固氮菌群落組間差異遠(yuǎn)大于組內(nèi)差異。本研究區(qū)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌屬為慢生根瘤菌屬、廣泛固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬和斯克爾曼氏菌屬。冗余分析顯示土壤特性能解固氮菌群落結(jié)構(gòu)變異的65.43%，土壤全氮和有機(jī)質(zhì)是影響土壤固氮菌群落組成的主要土壤特性因子。林分類(lèi)型、土壤特性和土壤固氮菌具有緊密的聯(lián)系，研究土壤固氮菌的群落多樣性及結(jié)構(gòu)組成必須考慮林分類(lèi)型和土壤性質(zhì)的影響。