益氣溫陽活血方含藥血清對肥大心肌細(xì)胞β3-腎上腺素能受體的影響研究*

王里，顧廣富，羅建華，楊冬花

（1.貴州省人民醫(yī)院 干部醫(yī)療科，貴州 貴陽550002；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽550025）

心力衰竭時(shí)交感神經(jīng)系統(tǒng)激活，機(jī)體分泌大量去甲腎上腺素（NE），誘導(dǎo)心肌細(xì)胞β-腎上腺素能受體表達(dá)變化，參與心肌重塑的病理生理過程[1]，抑制交感神經(jīng)興奮，已成為治療心力衰竭的重要作用靶點(diǎn)。筆者研究發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽活血方可降低心力衰竭大鼠內(nèi)皮素-1、一氧化氮、一氧化氮合酶的水平，阻斷鈣調(diào)磷酸神經(jīng)激酶信號(hào)通路活化，抑制心肌重塑[2-3]，但是否能通過抑制交感神經(jīng)興奮防止心肌肥大，目前尚不清楚。本研究通過觀察益氣溫陽活血方對肥大心肌細(xì)胞NE、β3-腎上腺素能受體（β3-AR）表達(dá)的影響，為進(jìn)一步臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠30只，體重（250±10）g，雌雄各半；Wistar乳鼠40只，新生2 d左右，雌雄不拘，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。

1.1.2 益氣溫陽活血方組成 人參30 g，黃芪30 g，桂枝9 g，丹參30 g，益母草30 g，紅花6 g，白術(shù)15g，澤瀉9 g，茯苓15 g，葶藶子9 g，炙甘草6 g，共11味中藥，藥材購自貴州省人民醫(yī)院中藥房，生藥按比例取好，加水浸泡60min，第1遍煮沸40min，濾渣取汁，再加水煮沸15min，濾渣取汁，合并2次煎液，在水浴中濃縮煎液至含生藥4 g/ml，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 卡維地洛（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：H20000100），Trizol（Invitroge公司），Rnasin（Promega公司），M-MLV（Promega公司），引物由上海生物工程公司合成，胎牛血清（GIBCO公司），AngⅡ（Sigma公司），1640培養(yǎng)基、胰酶（Sigma公司），NE（RB公 司），MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2（Santa Cruz公司），大鼠Anti-β3-AR抗體（Abcam公司），制膠、電泳及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），PCR儀（Eppendorf公司），酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 30只Wistar大鼠分為3組：①中藥組10只，予益氣溫陽活血方（8m l/kg）灌胃治療；②卡維地洛組10只予卡維地洛[50mg/kg+蒸餾水（8ml/kg）]灌胃治療；③空白血清組10只予蒸餾水（8ml/kg）灌胃。3組動(dòng)物給藥2次/d，共8周。末次灌胃后1 h頸動(dòng)脈采血處死動(dòng)物，分離血清。將血清經(jīng)微孔濾膜滅活、濾菌后與DMEM培養(yǎng)基配成10%濃度。

1.2.2 肥大心肌細(xì)胞模型 取新生乳鼠心室肌，用0.25%胰蛋白酶消化分離，經(jīng)差速純化2 h，接種于10%血清DMEM培養(yǎng)液中。取上述細(xì)胞加入AngⅡ（終濃度10-7mol/L）作用48 h誘導(dǎo)心肌肥大。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 ①正常組，正常心肌細(xì)胞加空白血清培養(yǎng)；②模型組，肥大心肌細(xì)胞加空白血清培養(yǎng)；③益氣溫陽活血方組，肥大心肌細(xì)胞加入益氣溫陽活血方含藥血清培養(yǎng)；④卡維地洛組，肥大心肌細(xì)胞加卡維地洛含藥血清培養(yǎng)。

1.2.43H-亮氨酸摻入量的測定 按上述分組加入不同干預(yù)藥物同時(shí)，在每孔中再加3H-亮氨酸（終濃度為1.85×1011Bq/L），24 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS液漂洗，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞于玻璃纖維素膜上，三氯乙酸固定。濾膜烘干后置于閃爍瓶中，加入閃爍液，用β-液體閃爍儀測定放射強(qiáng)度。

1.2.5 檢 測 細(xì) 胞 上 清 NE、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP2含量 72 h后終止細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出，用PBS洗培養(yǎng)物1次，棄去PBS，以ELISA法檢測，操作過程參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 肥大心肌細(xì)胞β3-AR mRNA的表達(dá)β3-AR（444 bp）上游引物5'-AGTGGGACTCCTCGT AATG-3'，下游引物5'-CGCTTAGCTACGACGAAC-3'，GAPDH（187 bp）：上游引物5'-GACAACGGCTCC GGCATGTG-3'，下游引物5'-TGAGGATGCCTCTCTT GC-3'。按Trizol試劑說明書提取細(xì)胞上清總RNA，參照第一鏈cDNA合成，試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、照相，利用UVP凝膠掃描儀測定條帶的吸光度（A）值，以目的基因與GAPDH條帶的吸光度（A）值的比值代表其表達(dá)的相對量。

1.2.7 肥大心肌細(xì)胞β3-AR蛋白質(zhì)的表達(dá) 取細(xì)胞上清提取胞漿蛋白，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)舛染鶠?∶1 000，二抗?jié)舛葹?∶2 000，化學(xué)發(fā)光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描，檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的相對量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（one-way，ANVOA），方差齊時(shí)，均數(shù)的兩兩比較用LSD法，方差不齊時(shí)，均數(shù)的兩兩比較用Tamhane's法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量的測定

模型組心肌細(xì)胞MMP-2含量與正常組、益氣溫陽活血方組、卡維地洛組比較明顯升高（P=0.000、0.000和0.001）；模型組MMP-9含量與正常組、益氣溫陽活血方組、卡維地洛組比較明顯升高（P=0.000）。模型組TIMP-1含量與正常組、益氣溫陽活血方組、卡維地洛組比較明顯降低（P=0.000）；模型組TIMP-2含量與正常組、益氣溫陽活血方組、卡維地洛組比較明顯降低（P=0.006、0.009和0.017）。益氣溫陽活血方組、卡維地洛組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 心肌細(xì)胞3H-亮氨酸摻入量、NE含量、β3-AR m RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平檢測

模型組心肌細(xì)胞3H-亮氨酸摻入量與正常組、益氣溫陽活血方組、卡維地洛組比較明顯升高（P=0.000）；模型組NE含量與正常組、益氣溫陽活血方組、卡維地洛組比較明顯升高（P=0.000）；模型組β3-AR mRNA與正常組、益氣溫陽活血方組、卡維地洛組比較明顯升高（P=0.002、0.010和0.007）；模型組β3-AR蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與正常組、益氣溫陽活血方組、卡維地洛組比較均明顯升高（P=0.000）。益氣溫陽活血方組、卡維地洛組心肌細(xì)胞3H-亮氨酸摻入量、NE含量、β3-AR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表1 各組MM-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量比較 （n=10，pg/m l，±s）

表1 各組MM-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量比較 （n=10，pg/m l，±s）

注：1）與模型組比較，P<0.05；2）與正常組比較，P<0.05

組別 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2正常組 51.50±14.151） 119.61±15.011） 76.53±14.951） 55.50±14.981）模型組 76.42±15.562） 159.38±19.292） 45.85±17.292） 37.42±13.852）益氣溫陽活血方組 52.77±13.391） 124.93±16.901） 75.28±16.411） 54.77±15.531）卡維地洛組 53.06±11.211） 128.52±18.171） 79.34±15.391） 53.06±11.211）

表2 各組3H-亮氨酸摻入量、NE含量、β3-AR m RNA和蛋白質(zhì)水平比較 （n=10，±s）

表2 各組3H-亮氨酸摻入量、NE含量、β3-AR m RNA和蛋白質(zhì)水平比較 （n=10，±s）

注：1）與模型組比較，P<0.05；2）與正常組比較，P<0.05

組別 3H-亮氨酸摻入量/cpm NE/（ng/ml） β3-ARmRNA β3-AR蛋白質(zhì)正常組 1 038.41±190.831） 9.33±2.621） 0.72±0.081） 2.75±0.591）模型組 1 896.94±266.792） 26.72±4.152） 0.84±0.092） 4.65±1.102）益氣溫陽活血方組 1 085.01±229.541） 10.94±2.241） 0.74±0.061） 2.88±0.641）卡維地洛組 1 111.18±216.061） 9.92±2.071） 0.74±0.081） 2.97±0.601）

心肌細(xì)胞β3-AR mRNA表達(dá)的瓊脂糖電泳圖和聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)電泳圖見圖1、2。

圖1 β3-AR m RNA的表達(dá)

圖2 β3-AR蛋白質(zhì)的表達(dá)

3 討論

心肌肥大，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、重量及蛋白質(zhì)合成速率增加，以及基質(zhì)細(xì)胞增生[4]。初期的心肌肥大，可以通過代償機(jī)制改善心臟功能，而長時(shí)間心肌肥大導(dǎo)致心肌重塑引起心力衰竭，進(jìn)而成為心血管疾病發(fā)病率和病死率升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。細(xì)胞內(nèi)促肥大因子與肥大抑制因子間的相互作用決定了細(xì)胞是否向著肥大方向發(fā)展。金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs）是一組鋅離子和鈣離子依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，廣泛參與體內(nèi)血管及心肌重塑、炎癥損傷、修復(fù)器官發(fā)育等病理生理過程，金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）是MMPs的內(nèi)源性特異抑制劑，MMPs/TIMPs失衡，在心肌重塑中起著重要作用[6]。

交感神經(jīng)系統(tǒng)是心血管系統(tǒng)神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的核心，腎上腺素能受體可識(shí)別并與NE特異性結(jié)合，將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，在心力衰竭中起重要作用[7]。β3-AR是近年新發(fā)現(xiàn)的β-腎上腺素能受體，參與心臟和血管的生理性調(diào)控，其興奮時(shí)不同于β1-AR、β2-AR對兒茶酚胺的正性肌力作用，主要表現(xiàn)為負(fù)性變力作用，特別在心力衰竭晚期，持續(xù)高表達(dá)的β3-AR導(dǎo)致心肌能量代謝障礙[8]、大量炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[9]、心肌細(xì)胞凋亡[10]以及通過調(diào)節(jié)鈣離子流產(chǎn)生持續(xù)的負(fù)性肌力作用，進(jìn)一步加重心室重塑，惡化心功能[11]。心力衰竭時(shí)對β3-AR進(jìn)行干預(yù)不僅可以拮抗負(fù)性肌力作用，還能改善心肌細(xì)胞能量代謝，延緩細(xì)胞凋亡，提高心功能，可能成為心力衰竭治療的新選擇[12]。

本研究結(jié)果顯示，以血管緊張素Ⅱ刺激乳鼠心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率增加，MMP-2、MMP-9含量明顯升高，而TIMP-1、TIMP-2含量則明顯降低，而且在心肌肥大形成的過程中，同時(shí)伴有交感神經(jīng)持續(xù)激活，以心肌細(xì)胞NE的分泌增加和β3-AR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高為主要表現(xiàn)。

卡維地洛是一種具有多種附加作用的第3代β 受體阻滯藥，非選擇性阻滯β 受體及選擇性地阻滯α1受體，為治療心力衰竭的首選β 受體阻滯劑。研究發(fā)現(xiàn)，異丙腎上腺素（ISO）灌流離體大鼠心臟，卡維地洛與特異性的β3-AR抑制劑SR59230A在改善心力衰竭大鼠心功能指標(biāo)的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]，卡維地洛還能使大鼠衰竭心室、β3-AR mRNA表達(dá)明顯降低，減輕心室重塑[14]。

中藥治療慢性心力衰竭在控制癥狀、改善心功能等方面療效顯著，但缺乏客觀的、量化的、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，特別是在分子水平和細(xì)胞水平研究較少，不利于科研和藥物評(píng)價(jià)。益氣溫陽活血方是一組針對心力衰竭病機(jī)的臨床有效方劑，方中主要成分為人參、黃芪、丹參、益母草、白術(shù)、茯苓、桂枝等。本研究表明，益氣溫陽活血方能降低肥大心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率、MMP-2、MMP-9以及NE含量，同時(shí)升高TIMP-1、TIMP-2含量，抑制β3-AR和蛋白質(zhì)的表達(dá)。由此推測，益氣溫陽活血方抑制心肌肥大的機(jī)制，可能是通過抑制交感神經(jīng)興奮，減少NE分泌，阻斷心力衰竭時(shí)過分激活的β3-AR，降低心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成速率以及MMP-2、MMP-9含量，升高TIMP-1、TIMP-2含量，逆轉(zhuǎn)心肌肥大，具有與非選擇性β 受體阻滯劑——卡維地洛相同的防治心肌肥大作用，值得臨床進(jìn)一步推廣。

[1]張晗,毛浩萍,柴麗娟,等.應(yīng)激對兒茶酚胺影響和中藥干預(yù)的研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥,2012,29(6):614-616.

[2]楊冬花,李家邦.益氣溫陽活血方對慢性心衰大鼠心室重構(gòu)鈣調(diào)磷酸神經(jīng)酶信號(hào)通路的影響研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(21):3078-3082.

[3]楊冬花,李家邦.益氣溫陽活血方對早期心力衰竭大鼠血管內(nèi)皮功能的影響研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜,2011,21(13):1454-1457.

[4]KRAUSER DG,DEVEREUX RB.Ventricular hypertrophy and hypertension:prognostic elements and implications for management[J].Herz,2006,31(4):305-316.

[5]楊光宇,王洪新,趙素玲,等.黃芪甲苷對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的抑制作用[J].中藥藥理與臨床,2013,29(3):28-31.

[6]李科,劉俊明.基質(zhì)金屬蛋白酶-2,-9與冠心病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國介入心臟病學(xué)雜志,2011,19(2):108-111.

[7]付德明,呂吉元.β 腎上腺素能受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變在心力衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用[J].中華高血壓雜志,2009,17(5):399-400.

[8]高艷輝,高海波,狄寧寧,等.β3受體阻斷劑對心力衰竭大鼠心肌解偶聯(lián)蛋白2和能量代謝變化的影響[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2013,29(4):376-384.

[9]郭靜,孔慧,李為民.心力衰竭β3腎上腺素能受體相關(guān)炎癥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2012,31(3):257-259.

[10]鄭方方,高海波,孔一慧,等.心力衰竭β3腎上腺素能受體與細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2013,34(3):382-384.

[11]孔一慧,劉玉冰,張莉,等.心力衰竭大鼠心肌β3-腎上腺素受體表達(dá)及其對鈣離子相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的作用[J].中國老年學(xué)雜志,2010,30(15):2141-2144.

[12]黃嵐,王江.心力衰竭發(fā)病機(jī)制的研究現(xiàn)狀[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2013,7(11):4656-4659.

[13]武雯濤,韓清華.卡維地洛治療心力衰竭受體機(jī)制的研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008,24(6):818-822.

[14]趙強(qiáng),蔣作鋒,吳同果,等.卡維地洛對慢性心力衰竭β3腎上腺素能受體表達(dá)的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,29(18):1522-1525.