乙肝病毒感染后不同臨床類型及HBV DNA載量與外周血T細胞亞群變化的相關性分析

李鈴，敬雪明，朱其榮，李蕓，梅小平

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 感染科，四川 南充637000；2.四川大學華西醫(yī)院，四川 成都610041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個備受關注的健康問題，我國人口中乙型肝炎病毒感染率為60%，乙肝表面抗原陽性率約10%，我國約有1.2億人為乙肝病毒攜帶者，面臨乙肝流行趨勢更為嚴峻局面[1]。乙型肝炎病毒感染與肝硬化、肝癌的發(fā)生相關密切[2-3]，2000年中華醫(yī)學會聯(lián)合修訂的病毒型肝炎防治方案的有關診斷標準指出，乙型肝炎病毒感染后可以形成急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化、肝癌和HBV攜帶者[4]，HBV感染后不同個體可以因免疫狀態(tài)多樣性[5]而形成不同結果。淋巴細胞主要分為3大亞群：CD3+、CD4+、CD8+T細胞。T淋巴細胞是細胞免疫的主要參與者，對清除HBV起主要作用。人體感染HBV后導致體內細胞免疫功能發(fā)生紊亂，外周血T淋巴細胞亞群是反映HBV感染后各臨床類型肝病患者細胞免疫狀態(tài)的重要指標，T淋巴細胞亞群比例失調，HBV清除作用減弱，成為HBV復制不斷變化和病情加重的主要原因。本研究通過檢測外周血T細胞亞群及其百分比和絕對數(shù)，分析HBV感染后不同臨床類型及HBV DNA載量與T細胞亞群變化的相關性，從而探討HBV感染后不同臨床轉歸與宿主細胞免疫功能的內在聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月-2014年4月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院就診的HBV感染者193例。其中男性160例，女性33例；年齡18～65歲，中位年齡35歲，均為本地居民。病例組168例，男性139例，女29例；年齡17～66歲，中位年齡36歲。病例組中急性乙型肝炎23例，其中HBVDNA（-）3例，HBVDNA（+）20例；慢性乙型肝炎31例，其中HBV DNA（-）6例，HBV DNA（+）25例；慢性重型乙型肝炎28例，其中HBV DNA（-）5例，HBV DNA（+）23例；亞急性重型乙型肝炎20例，其中HBVDNA（-）3例，HBVDNA（+）17例；急性重型乙型肝炎20例，其中HBVDNA（-）4例，HBV DNA（+）16例；乙肝肝硬化26例，其中HBV DNA（-）9例，HBVDNA（+）17例；乙肝肝癌20例，其中HBVDNA（-）12例，HBVDNA（+）8例。對照組為25例HBV攜帶者，男性21例，女性4例；年齡18～66歲，中位年齡35歲，其中HBVDNA（-）7例，HBV DNA（+）18例。病例組與對照組在年齡、性別上比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。診斷符合2000年中華醫(yī)學會聯(lián)合修訂的病毒型肝炎防治方案的有關診斷標準[6]。肝癌診斷依據(jù)臨床、血清及影像檢查，并符合中國抗癌協(xié)會肝癌委員會制定的原發(fā)性肝癌診斷標準與分期標準。所有受試者均為知情同意。研究病例排除其他類型肝炎和正在使用核苷（酸）類似物和干擾素等抗病毒藥物或免疫調節(jié)劑治療者，排除合并嚴重的心、腦、腎、肺功能障礙、重癥糖尿病等肝病患者。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 抽取靜脈血9ml，其中用EDTAK真空采血管采集靜脈血5ml混勻，做T細胞檢測用，另兩管用普管各抽取2ml用于相關檢測。

1.2.2 肝功能檢測 由AEROSET全自動生化儀測定。

1.2.3 HBVM 血清標記物（乙肝兩對半）檢測 采用時間分辨免疫熒光分析法，儀器為上海新波生物技術有限公司ANYTEST-2000時間分辨儀。

1.2.4 HBV-DNA定量檢測 采用實時熒光探針定量-聚合酶鏈反應（FQ-PCR）方法，儀器為美國MJ Research公司MJ Opticon Monitor實時熒光定量PCR儀，試劑由美國BD公司生產(chǎn)。

1.2.5 血細胞分析 采用全自動血液分析儀。

1.2.6 外周血T淋巴細胞亞群檢測方法 采用四色熒光標記流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM），常規(guī)采取靜脈外周血，主要儀器：采用美國Beckman Coulter公司的EPICS-XL流式細胞儀。用EDTA-K真空采血管采集靜脈血5ml混勻，采集標本后在2 h內做染色處理，分別加入熒光標記mAh，即鼠抗人CD3+FⅡC、CD4+、CD8+FⅡC、CD25+-PE各10μl，陰性對照管中加入鼠IgG FⅡC和IgG-PE各10μl，混勻置室溫（25℃）避光孵育20min，再加入紅細胞溶解450μl，充分混勻，室溫暗處反應15min，然后上機檢測，流式細胞儀開機后，首先以標準微球和FACScomp自動軟件檢查校準儀器，并自動設定容血/免洗實驗的獲取條件，再進入用淋巴細胞亞群絕對計數(shù)的Muiti-SET自動分析軟件，獲取15 000個白細胞，記錄CD4+/CD25+T細胞的百分率，并自動分析結果。

1.2.7 HBV DNA載量分組 HBVDNA陽性組為HBVDNA>103copies/ml，簡稱HBVDNA（+）組；HBV DNA陰性組HBV DNA≤103copies/ml，簡稱HBV DNA（-）組。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBV感染后各臨床類型組T淋巴細胞及其亞群比較

結果顯示，對照組CD3+、CD4+細胞百分率明顯高于各臨床類型組，隨著病情加重CD3+、CD4+細胞百分率下降更明顯，除急性乙型肝炎組和慢性肝炎組CD4+細胞百分率外與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；對照組CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值明顯低于各臨床類型組，隨著病情加重CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值升高明顯，各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；對照組CD4+/CD8+細胞比值明顯高于各臨床類型組，隨著病情加重CD4+/CD8+細胞比值下降明顯，各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1。

2.2 病毒載量與外周血T細胞亞群變化關系比較

結果顯示，低水平HBV DNA載量組（≤103Copies/ml）CD3+、CD4+細胞百分率明顯高于其他各病毒載量組，隨病毒載量增加CD3+、CD4+細胞百分率逐漸減少，低水平HBVDNA載量組與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；低水平HBV DNA載量組CD8+細胞百分率最低，隨病毒載量增加CD8+細胞百分率升高明顯，低水平HBV DNA載量組與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；低水平HBVDNA載量組CD4+/CD8+及CD4+/

CD25+細胞比值最高，其細胞比值隨病毒載量增加下降明顯，低水平組CD4+/CD25+細胞比值與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01），低水平組CD4+/CD8+細胞比值與各組（103～105組除外）比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。見表2。

2.3 同臨床類型不同乙肝病毒載量與T淋巴細胞及其亞群關系比較

結果顯示，除乙肝肝硬化的CD4+細胞百分率外，同病種肝病的HBVDNA（+）組CD3+、CD4+、CD8+細胞百分率、CD4+/CD8+及CD4+/CD25+細胞比值與HBVDNA（-）組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。見表3。

表1 乙肝病毒感染后不同臨床類型T淋巴細胞及其亞群比較 （%，±s）

表1 乙肝病毒感染后不同臨床類型T淋巴細胞及其亞群比較 （%，±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與對照組比較，P<0.01

組別 例數(shù) CD3+t值 P CD4+t值 P CD8+t值 P CD4+/CD8+ t值 P CD4+/CD25+ t值 P對照組 25 76.2±5.1 47.1±3.9 29.0±2.4 1.51±0.3 4.01±1.3急性乙型肝炎 23 75.3±4.2 0.67>0.05 48.7±4.5 1.31 >0.05 29.8±4.1 0.82 >0.05 1.41±0.5 0.83 >0.05 4.61±1.4 1.53 >0.05慢性肝炎 31 73.1±4.11） 2.46<0.05 49.3±3.81） 2.12 <0.05 29.8±3.2 1.07 >0.05 1.24±0.32） 3.35 <0.01 4.80±1.52） 2.11 <0.05慢性重型肝炎 28 60.5±4.32）12.04<0.01 39.4±3.22） 7.71 <0.01 34.9±3.42） 7.36 <0.01 1.01±0.32） 6.06 <0.01 5.93±2.12） 4.05 <0.01亞急性重型肝炎 20 61.9±3.92）10.66<0.01 38.1±4.12） 7.48 <0.01 34.5±3.22） 6.38 <0.01 1.03±0.22） 6.41 <0.01 5.99±2.12） 3.67 <0.01急性重型肝炎 20 68.9±4.52） 5.09<0.01 40.3±4.42） 5.42 <0.01 35.9±4.62） 6.09 <0.01 1.07±0.22） 5.88 <0.01 6.01±2.32） 3.47 <0.01乙肝肝硬化 26 70.1±3.52） 4.96<0.01 39.9±3.62） 6.84 <0.01 32.4±2.92） 4.57 <0.01 1.01±0.21） 6.97 <0.01 6.19±2.22） 4.33 <0.01乙肝肝癌 20 66.1±4.42） 7.13<001 38.2±3.92） 7.61 <0.01 33.4±3.12） 5.22 <0.01 1.03±0.22） 6.41 <0.01 5.97±1.62） 4.43 <0.01

表2 乙肝病毒載量與外周血T細胞及亞群的關系比較 （%，±s）

表2 乙肝病毒載量與外周血T細胞及亞群的關系比較 （%，±s）

注：）各組與DNA≤103 Copies/ml組比較，P<0.05；2）各組與DNA≤103 Copies/ml組比較，P<0.01

DNA（Copies/m l） n CD3+ t值 P CD4+t值 P CD8+ t值 P CD4+/CD8+ t值 P CD4+/CD25+ t值 P≤103 31 74.8±17.1 55.1±15.0 29.1±9.2 1.9±1.1 8.1±1.5 103～105 56 64.6±18.71） 2.58<0.05 45.8±15.11） 2.76<0.05 32.2±10.1 1.45>0.05 1.5±0.9 1.73 >0.05 7.2±1.31） 2.81 <0.05 105～107 55 58.5±17.12） 4.24<0.01 41.1±14.12） 4.25<0.01 34.2±10.21） 2.38<0.05 1.1±0.82） 3.55 <0.01 6.1±1.22） 6.36 <0.01 107～108 31 57.6±18.32） 3.82<0.01 39.6±12.32） 4.45<0.01 36.8±9.32） 3.28<0.01 1.0±0.62） 4.00 <0.01 5.1±1.12） 8.78 <0.01≥108 20 55.2±17.42） 3.95<0.01 37.1±10.22） 5.10<0.01 41.2±11.62） 3.93<0.01 0.8±0.52） 4.85 <0.01 4.1±0.82） 12.37<0.01

表3 同臨床類型不同乙肝病毒載量與T淋巴細胞及其亞群關系 （%，±s）

表3 同臨床類型不同乙肝病毒載量與T淋巴細胞及其亞群關系 （%，±s）

組別 例數(shù) CD3+ CD4+ CD8+HBV（-） HBV（+） t值? HBV（-） HBV（+） t值? HBV（-） HBV（+） t值? P?對照組 25 80.1±5.1 63.2±5.3 11.49 <0.01 53.2±2.8 41.2±3.1 14.36 <0.01 26.0±1.8 35.5±2.2 16.71<0.01急性乙型肝炎 23 79.1±3.2 63.1±4.8 13.30 <0.01 52.3±4.1 42.2±3.7 8.77 <0.01 26.1±1.3 36.2±2.2 18.96<0.01慢性肝炎 31 70.2±3.1 60.2±4.1 10.83 <0.01 50.3±3.8 45.3±3.5 5.39 <0.01 26.2±1.5 35.2±1.9 20.70<0.01慢性重型肝炎 28 68.3±3.7 58.3±4.0 9.71 <0.01 42.6±3.3 38.6±3.5 4.40 <0.01 30.6±3.4 39.8±2.8 11.05<0.01亞型重型肝炎 20 65.2±3.7 54.2±3.7 9.40 <0.01 40.1±3.0 35.5±3.0 4.85 <0.01 31.0±3.2 40.1±3.1 9.13 <0.01急性重型肝炎 20 71.6±4.1 59.2±3.1 10.79 <0.01 39.2±4.1 34.1±3.1 4.44 <0.01 32.3±3.6 40.9±3.3 7.88 <0.01乙肝肝硬化 26 71.7±3.8 60.2±2.9 12.27 <0.01 38.1±2.9 37.2±2.9 1.12 <0.05 31.4±2.9 41.1±3.9 10.18<0.01乙肝肝癌 20 71.5±3.7 55.2±3.1 15.10 <0.01 42.3±3.1 35.1±2.8 7.71 <0.01 31.7±3.1? 39.9±2.7 8.92 <0.01 t值（急性乙型肝炎∶對） 0.82 0.07 0.88 0.91 0.22 1.10 P>0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 t值（慢性肝炎∶對） 8.52 2.23 3.28 4.64 0.44 0.54 P<0.01 <0.05 <0.01 <0.01 >0.05 >0.05 t值（慢性重型肝炎∶對） 9.54 3.76 12.65 2.87 6.25 9.17 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t值（亞型急性重型肝炎∶對） 11.35 6.69 14.99 6.24 6.24 5.60 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t值（急性重型肝炎∶對） 6.20 3.16 13.03 7.36 7.14 6.29 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t值（乙肝肝硬化∶對） 6.65 2.49 18.92 4.75 8.02 6.35 P<0.01 <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t值（乙肝肝癌∶對） 6.55 6.32 12.23 6.92 7.30 5.89 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 P? P?

續(xù)表3

3 討論

乙型肝炎的發(fā)病機制十分復雜，目前認為宿主免疫系統(tǒng)功能紊亂是其病理損傷及發(fā)病的主要機制或主要原因[3]。國內學者普遍認為，HBV病毒本身并不直接損傷肝細胞，而是通過引起宿主自身的免疫反應間接導致肝細胞的損傷[7]。其中，細胞免疫反應是HBV感染后引起肝細胞損害的主要機制[8]。T細胞及其亞群的抗病毒作用不是獨立的，是調整整個免疫系統(tǒng)構成抗HBV感染的細胞免疫應答網(wǎng)絡。有學者認為，不同個體在HBV感染后的免疫學和臨床轉歸各不相同，這與宿主的人類白細胞抗原（human leukocyte antigens，HLA）等遺傳學背景、HBV自身特性和細胞免疫應答狀況等均有關系。對于慢性乙型肝炎患者，HLA-1限制性的針對HBV各類抗原表位的特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）應答常常不足或十分微弱，肝細胞內HBV不易清除，病情遷延不愈，是形成慢性乙型肝炎的重要機制之一[9]。

T淋巴細胞各亞群水平間的相對穩(wěn)定是機體發(fā)揮正常免疫功能的重要基礎。T淋巴細胞的數(shù)量和各亞群比例是反應機體免疫水平的主要標志，CD3+（總T細胞）和CD4+（輔助T細胞）除在免疫應答中起輔助、誘導作用外，還可分泌淋巴因子，啟動遲發(fā)性超敏反應，誘導巨噬細胞活化，引起肝細胞損傷效應[10]。CD4+細胞還能促進B細胞分化，調節(jié)細胞免疫和體液免疫。CD8+細胞由細胞毒性T淋巴細胞和抑制性T淋巴細胞組成，正常情況下兩者保存一定比例，維持機體免疫功能平衡[11]。

本研究表明，病例組CD3+、CD4+細胞百分率明顯高于各臨床類型組，隨著病情加重，CD3+、CD4+細胞百分率下降更明顯，除急性乙型肝炎組外與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。隨臨床病情加重CD3+、CD4+細胞百分率的明顯下降，表明在慢性HBV感染中，CD4+細胞遭受破壞致生成減少，提示體內特異性抗體生成不足，不能清除游離的乙肝病毒，繼而引發(fā)CD4+細胞清除病毒力下降，這可能與慢性乙型肝炎肝臟炎癥活動度相當有關[12]，也可能與HBV感染后乙型肝炎慢性化有關。對照組CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值明顯低于各臨床類型組，隨著病情加重CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值升高明顯，除急性乙型肝炎組外和慢性肝炎組CD8+細胞百分率外與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01），這說明CD8+細胞百分率升高可能與CD4+細胞減少而形成的負性調節(jié)有關。對照組CD4+/CD8+細胞比值明顯高于各臨床類型組，隨著病情加重CD4+/CD8+細胞比值下降明顯，除急性乙型肝炎組外與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。研究表明，機體參加免疫反應的免疫活性細胞已經(jīng)發(fā)生改變，不同臨床類型隨著病情加重，CD3+、CD4+細胞百分率下降更明顯，表明機體清除病毒的能力在降低，這可以解釋HBV感染后慢性化的原因之一。隨著病情加重CD4+/CD8+細胞比值下降明顯，可能提示由于輔助性T細胞CD3+、CD4+的減少，無法誘導有效的免疫應答以清除病毒。動態(tài)觀察CD4+/CD8+細胞比值的變化可作為評估HBV感染后有無慢性化及判斷炎癥程度的輔助指標之一。

國內外多篇報道，認為T細胞亞群的細胞數(shù)量與功能同HBV復制關系密切[13]。本研究結果顯示，低水平HBVDNA載量組（≤103Copies/ml）CD3+、CD4+細胞百分率明顯高于其他各病毒組，隨病毒載量增加CD3+、CD4+細胞百分率逐漸減少，低水平HBV DNA載量組與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01），說明病毒高復制與CD4+細胞及CTL數(shù)量減少、抑制性T細胞增高有關，與CHANG等[14]的報道一致。本研究也顯示，CD4+及CD25+細胞數(shù)量及百分率與病毒載量有一定的相關性，隨著病毒載量的升高，CD4+及CD25+細胞百分率也減少，低水平組CD4+/CD25+細胞比值與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；乙肝病毒低水平組的患者T細胞百分比低于高水平組，這說明部分患者病毒復制不活躍，細胞免疫功能尚能保持相對穩(wěn)定，而病毒載量相對高者，由于免疫功能相對低下或抑制，肝細胞容易受到攻擊而發(fā)病，由此可見機體T細胞免疫功能的改變不僅與HBV感染有關，也與HBV DNA復制水平關系密切。因此，通過檢查患者T細胞亞群并做動態(tài)觀察，可以為臨床治療提供有益的幫助，對判斷病情和預后有重要參考價值。

本研究表明，在同肝病種內比較，各HBVDNA組（+）CD3+、CD4+細胞百分率、CD4+/CD8+比值明顯低于HBV DNA（-）組，二者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）（乙肝肝硬化的CD4+細胞百分率除外）；各DNA組（+）CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值明顯低于HBV DNA（-）組，二者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。這表明通過抗病毒治療可能改變病毒載量從而調控T細胞水平，進而改變乙肝病的轉歸。

綜上所述，HBV感染者體內存在T細胞亞群失衡和細胞免疫功能紊亂，可能是HBV感染后慢性化的重要原因之一；T細胞免疫功能與HBV DNA水平變化存在一定關系，是乙肝慢性化和成為攜帶者的又一原因。檢測T細胞亞群可能有助于闡明HBV的發(fā)病機制及其預后判斷。

本研究還存在一些不足，如入選病例較少，而且缺少肝臟病理檢查結果與外周血檢查結果的比較，未對T細胞亞群變化是否與年齡相關性進行研究，也未對T細胞亞群變化是否與性別、傳播方式、治療方式、肝組織的HBV DNA載量等有關進行討論；本研究為研究對象的某一時間點不同乙肝臨床類型的HBVDNA載量與T細胞的關系，未能反映其動態(tài)變化的關系，需要作者進一步研究來證實。

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