舒洛地特對糖尿病大血管病變大鼠血管內(nèi)皮生長因子的干預作用*

靳瑾，李英，薛以貴，王敏哲

（1.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊830011；2.烏魯木齊民族干部學院，新疆 昌吉831200）

目前，糖尿病大血管并發(fā)癥認為是2型糖尿病 致死、致殘的主要原因。高血糖、胰島素抵抗可通過氧化應激損傷和亞臨床的細胞炎癥反應導致一系列的血管內(nèi)皮損傷，在此過程中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）強烈而特異地促使內(nèi)皮細胞分裂、增生、移行，增加血管通透性，導致血管內(nèi)皮功能損傷[1]。藥理學提示小分子量肝素與血管內(nèi)皮有較強的親和性，增強血管內(nèi)皮細胞的抗血栓特性。資料證實，舒洛地特軟膠囊屬低分子肝素類藥物，對糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等微血管病變有一定改善作用[2]，但目前其對糖尿病大血管病變的研究相對較少。本研究擬通過觀察舒洛地特軟膠囊對糖尿病大鼠大血管的保護作用，探討其對VEGF的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性3周齡SD大鼠70只（新疆醫(yī)科大學動物中心提拱），體重150～200g。

1.1.2 試劑與設(shè)備 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ美國Sigma公司），維生素D3（上海通用藥業(yè)股份有限公司），大鼠VEGF的ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司），舒洛地特軟膠囊（意大利阿爾法韋士曼制藥公司），免疫組織化學染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗VEGF抗體（武漢博士德生物工程有限公司），胰島素放射免疫試劑盒（北京原子高科核技術(shù)應用股份有限公司），El-800型全自動酶標分析儀（美國PE公司），熒光顯微鏡Olympus BX40（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 制模 SD大鼠70只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組8只，正常干預組8只，剩余54只大鼠禁食12 h后，腹腔注射50mg/kg STZ溶液（使用前用滅菌的0.1mmol/L、pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成2%溶液），正常對照組只注射等量的緩沖液。72 h后用拜安捷Ⅱ血糖儀測尾靜脈血糖，空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）>7.0 mmol/L和餐后血糖>11.1mmol/L為模型建立。成模大鼠給予維生素D3注射液（按總劑量50萬u/kg分3 d灌胃）[3]。每2周測血糖，血糖達標并且存活良好的大鼠為糖尿病合并大血管病變模型制模成功，最終有34只大鼠制模成功，隨即分為糖尿病對照組（n=18）、糖尿病干預組（n=16）。在上述基礎(chǔ)上飼高脂高膽固醇飼料8周。

1.2.2 干預 在8周的實驗過程中，正常及糖尿病干預組均給予舒洛地特混懸液灌胃，劑量為80 slu/（kg·d），并用蒸餾水20mg/（kg·d）灌胃作為對照，所有大鼠均給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)。

1.2.3 標本留取 8周末內(nèi)眥靜脈取血、EDTA抗凝離心后備檢胰島素、血脂。取血完畢后處死大鼠，取胸主動脈下段約1 cm，生理鹽水沖洗后立即以4%中性甲醛緩沖液固定，制成石蠟切片。

1.2.4 實驗方法 用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察胸主動脈病理改變。胸主動脈石蠟切片用免疫組織化學法測定VEGF表達（SP法，磷酸鹽緩沖液代替陰性對照一抗）。所有切片在熒光顯微鏡下進行觀察，并采集100倍及200倍圖像，胸主動脈內(nèi)VEGF陽性表達為細胞內(nèi)棕褐色、棕黃色或淺黃色顆粒。采用Image-Pro Plus 6.0軟件半定量測量血管內(nèi)陽性細胞積分光密度（IOD）值及面積并計算MOD值。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，嚴格按試劑盒說明書進行操作，測定血漿VEGF，并用酶標儀在450 nm波長處測定吸光值，計算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗，多個均數(shù)間兩兩比較用LSD-q檢驗；多變量間相關(guān)性用Spearson相關(guān)分析；多種危險因素用多元線性逐步回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

糖尿病大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、體重下降、毛發(fā)干枯等癥狀。見附表。

2.2 各組大鼠生化指標比較

4組大鼠FBG、空腹血清胰島素（FINS）、血漿中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、VEGF水平見附表。糖尿病組較正常組大鼠的FPG增加（P<0.05）；糖尿病對照組大鼠LDL、TG顯著高于正常組（P<0.05）；糖尿病干預組與糖尿病對照組比較TC、LDL、TG明顯降低（P<0.05）；兩干預組的HDL變化不明顯。

2.3 病理學觀察

顯微鏡下觀察顯示，正常對照組、正常干預組主動脈光鏡下未見病理改變，提示舒洛地特軟膠囊在正常狀態(tài)下未對血管產(chǎn)生損害；糖尿病對照組大鼠主動脈管壁增厚，平滑肌細胞增生且排列不規(guī)則，內(nèi)皮及內(nèi)皮下層有水腫變性，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，局部管壁向管腔內(nèi)突出，形成纖維增生性動脈硬化斑塊；糖尿病干預組主動脈管壁也增厚，平滑肌細胞增生較糖尿病對照組減輕，內(nèi)皮及內(nèi)皮下層水腫變性不明顯，未見明顯纖維斑塊。見圖1。

附表 4組生化代謝指標比較 （±s）

附表 4組生化代謝指標比較 （±s）

組別 體重/g FPG/（mmol/L） TC/（mmol/L） TG/（mmol/L） LDL/（mmol/L） HDL/（mmol/L）正常對照組（n=8） 329.00±55.55 5.56±1.15 4.06±0.85 0.36±0.09 1.50±0.30 0.49±0.19正常干預組（n=8） 361.45±32.70 4.33±1.08 2.26±0.39 0.47±0.08 0.81±0.17 0.66±0.19糖尿病對照組（n=18） 275.59±46.501） 15.57±7.651） 13.74±10.711） 1.70±1.101） 5.52±5.041） 2.17±2.821）糖尿病干預組（n=16） 257.64±53.00 11.14±4.192） 4.12±1.422） 0.81±0.342） 1.78±0.382） 0.84±0.342）F值 0.587 7.320 8.074 8.235 7.126 5.671 P值 0.612 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

續(xù)附表

2.4 各組血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達水平比較

圖1 各組大鼠主動脈組織HE染色 （×400）

免疫組織化學結(jié)果顯示，正常干預組動脈VEGF蛋白表達活性增加，舒洛地特軟膠囊干預后VEGF蛋白表達明顯減少[（14.80±9.13）vs（1.54±0.76），P<0.01]。正常對照組和正常干預組VEGF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與ELISA結(jié)果一致。見圖2。

圖2 各組大鼠免疫組織化學染色 （×400）

3 討論

內(nèi)皮細胞功能紊亂在糖尿病大血管病變的發(fā)生中起重要作用，內(nèi)皮功能障礙促進血管異常生長，導致糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)生。高糖環(huán)境中各種代謝紊亂是誘發(fā)內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能異常的主要原因[4]。在血管病變的過程中VEGF促進內(nèi)皮損傷[5]。有報道表明，糖尿病時由于糖代謝紊亂、血液動力學和血液流變學變化，蛋白質(zhì)的非酶糖化和糖化血紅蛋白的增多等因素，可刺激VEGF分泌增多。VEGF是一種內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂原，作為一種具有自分泌和旁分泌機制的生長因子，能特異地作用于血管內(nèi)皮細胞，目前研究多在促進視網(wǎng)膜的微血管病變[6-7]，大血管病變研究少見，本研究提示，糖尿病對照組中血漿、組織VEGF的表達較正常組顯著增加，提示VEGF可能參與糖尿病大血管病變[8]。

糖胺聚糖（glycosaminoglyeans，GAG）是由各種硫酸二糖直鏈組成的天然多糖衍生物，與核心蛋白通過共價鍵連接形成復合大分子物質(zhì)蛋白聚糖，廣泛分布于人體及動物內(nèi)的各個器官。GAG作為體內(nèi)蛋白聚糖的糖鏈成分，是ECM和細胞膜的主要組成成分，可以維持膜的選擇通透性[9-10]。

舒洛地特作為一種特異性的血管壁糖胺聚糖（glycosaminoglyeans，GAG），是人們從動物小腸提取、分離、沉淀出來由80%的硫酸艾杜糖葡糖胺聚糖（1GS）和20%的硫酸皮膚素（Ds）組成[11-12]。動物實驗及臨床藥理學研究證實，舒洛地特可以為內(nèi)皮細胞提供有效的GAG[13-14]。為進一步探討舒洛地特在糖尿病大血管病變中的保護機制，筆者通過本實驗的對比研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病干預組血管病變程度輕，血漿及組織VEGF表達下調(diào)，提示舒洛地特可能通過抑制VEGF的過表達實現(xiàn)其對血管的保護。有關(guān)舒洛地特對大血管病變的保護機制尚未完全清楚，仍需進一步研究。

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