肝癌患者外周血CD25及其m RNA表達*

胡萬發(fā)，劉曉蕊，王健

（安徽理工大學1.附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科；2.醫(yī)學院病原學與免疫學教研室，安徽 淮南232001）

肝細胞癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)生和轉(zhuǎn)歸與宿主的細胞免疫功能有關(guān)。外周血富含各類免疫活性細胞，主要為T淋巴細胞，可表達IL-2R等多種受體，在抗腫瘤免疫應答中起重要作用[1]。CD25是IL-2R的α 亞單位，亦稱膜白細胞介素-2受體（membrane interleukin-2 receptor，m IL-2R），是T細胞活化的重要標志，在介導IL-2發(fā)揮生物學效應上起關(guān)鍵作用[2]。為探討其在肝細胞癌的表達水平，本研究選擇59例原發(fā)性肝癌患者進行外周血CD25及其mRNA檢測。報道如下：

1 對象與方法

1.1 臨床資料

2010年1月-2011年5月住院的原發(fā)性肝癌患者59例，其中依病理分型，巨塊型肝癌14例，結(jié)節(jié)型肝癌26例，彌漫型肝癌19例?；颊吣?1例，女18例，平均年齡49.7歲，其中有18患者接受CIK（cytokine-induced killer）細胞治療。另隨機選取體檢正常人群20例為對照組，男12例，女8例，平均年齡38歲。

1.2 試劑與儀器

乙肝病毒標志物（hepatitis B virus marker，HBVM）HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe、anti-HBc診斷試劑購自上海科華生物工程公司；淋巴細胞分離液（上海生化試劑二廠，批號100111）；生物素-鏈霉親和素（biotin-streptavidin，BSA）系統(tǒng)m IL-2R診斷試劑購自上海思創(chuàng)生化電子有限公司；AFP放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號：SI0912022）；Trizol試劑盒（美國Gaithersburg公司）；EXL-808全自動酶標分析儀（美國Bio-Teck公司）；TaKaRa梯度PCR儀TP600（日本TaKaRa公司）；Hema-2000凝膠掃描分析系統(tǒng)（珠海Hema公司）；iCycle熒光實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；MDF-135型CO2培養(yǎng)箱（日本Syno公司）。

1.3 方法

1.3.1 CD25檢測 靜息態(tài)CD25檢測：取肝素抗凝血2ml，以等量無Ca2+、Mg2+的Hanks'液稀釋后，用淋巴細胞分離液常規(guī)分離PBMC，用Hanks'液洗滌3次，用含1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)至（1～3）×109/L，取上述細胞懸液10μl，分別涂布于印有防酸漆圈的玻片孔內(nèi)，自然干燥后用新鮮丙酮固定15～20min，干后于每一標本印圈內(nèi)加抗Tac的單克隆抗體10μl，放入濕盒37℃、5%CO2環(huán)境孵育30min，然后用TBS漂洗，稍干后加生物素化羊抗鼠IgG 10μl于各孔中，同法孵育、漂洗，最終加新鮮配制的顯色液，待顯色明顯時用TBS漂洗，終止顯色，高倍鏡下鏡檢，細胞膜呈棕色者為陽性，不著色者為陰性，共計數(shù)200個細胞，分別計算陽性細胞百分率。誘導態(tài)CD25檢測：取上述細胞懸液0.5ml，加入最終濃度為200μg/ml植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）的1640完全培養(yǎng)液0.5ml，置37℃、5%CO2環(huán)境孵育72 h。取沉淀細胞用1640完全培養(yǎng)液稀釋至（1～3）×109/L，同法涂片、孵育、漂洗、鏡檢，行誘導期m IL-2R檢測。

1.3.2 CD25 mRNA檢測 取PHA孵育前后患者的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），以RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)至（1～2）×106/ml。用Trizol試劑抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA置-86℃冰箱備檢。用SYBR Green I熒光標記法檢測PCR產(chǎn)物，總反應體系為25μl，2μl標準品或模板cDNA，模板cDNA以1∶4稀釋。CD25 mRNA引物設(shè)計參照HIRATA等[3]方法，引物序列：sense（5'→3'）為CAAAGTCCAATGCAG CCAGT，Anti-sense（5'→3'）為TCACCTGTGCATAT GAGCTG，擴增片段長度232 bp。以GAPDH為內(nèi)參標準，每次檢測標準品以10倍梯度稀釋6個梯度（106、105、104、103、102和10 copies/ml） 繪制標準曲線。3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物sense（5'→3'）：AGAAGGCTGGGGCTCATTTA，anti-sense（5'→3'）：為AGGGGCCATCCACAGTCTTC，擴增片段長度為258 bp。擴增參數(shù)：95℃預變性300 s，95℃ 10 s，65℃10 s，40個循環(huán)，最后72℃保溫300 s，4℃保存。為克服系統(tǒng)誤差，設(shè)GAPDH為參照，以lgcDNA/lgGAPDH比值代表其最終mRNA水平。

1.4 CIK細胞制備

參照BONANNO等[4]方法，臺盼藍拒染試驗檢測CIK細胞活度>95%，流式細胞術(shù)檢測CIK細胞中CD3+CD8+CD56+含量>80%以確定靶細胞。CIK細胞治療方法：取新鮮制備CIK細胞，每次以2.0×1010濃度細胞懸液輸注100ml，每天1次，連續(xù)5 d，其他參照郝一文等[5]方法。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

與正常對照相比，肝細胞癌患者外周血單個核細胞PHA誘導前后CD25及其mRNA水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。具體見圖1～2。CIK細胞治療后，靜息期和誘導期CD25及其mRNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3～4。

圖1 肝癌患者外周血CD25表達

圖2 肝癌患者外周血CD25 m RNA表達

圖3 肝癌患者CIK細胞治療前后CD25表達

3 討論

肝細胞癌是目前公認的惡性腫瘤，其確切的發(fā)生機制尚未完全闡明，一般認為與宿主的細胞免疫功能有關(guān)。PBMCs是多種免疫活性細胞的集合體，主要是T淋巴細胞，可表達IL-2R，在抗腫瘤免疫反應中起重要作用。

圖4 肝癌患者CIK細胞治療前后CD25mRNA表達

IL-2R是IL-2的特異性受體，包括α、β、γ三個亞單位，分別稱為CD25、CD122、CD132，其中以CD25較重要，是T細胞活化的標志，在IL-2發(fā)揮生物學效應上起關(guān)健作用，其表達水平可反映T細胞的激活過程和機體的免疫狀態(tài)[6]。本研究結(jié)果顯示，肝癌患者外周血PHA誘導前后CD25表達水平均較正常對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示肝癌患者存在明顯的細胞免疫功能低下，T細胞處于抑制狀態(tài)，不能表達足夠的CD25，限制宿主抗腫瘤免疫應答。T細胞表面除表達CD25外，還含有PHA受體。以PHA誘導后，CD25表達水平雖較靜息期明顯提高，提示患者對PHA刺激仍有相當?shù)姆磻?，但與正常對照相比表達水平仍較低，差異性仍有統(tǒng)計學意義，提示肝癌患者T細胞對PHA的誘導反應弱，活化的T細胞減少或不足[7]。進一步觀察不同病理分型患者外周血CD25表達情況，結(jié)果顯示巨塊型、結(jié)節(jié)型、彌漫型肝癌患者外周血CD25及其mRNA表達水平類似，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示肝癌患者的細胞免疫功能低下與病理分型無關(guān)。

CD25 mRNA是反映編碼或調(diào)控CD25表達和分泌的新型指標，在活化性T細胞高表達。本研究結(jié)果顯示肝癌患者PBMCs在靜息狀態(tài)下CD25mRNA水平較低，提示患者外周血中T細胞合成分泌CD25的能力較弱。當PBMCs與PHA共孵育后，CD25mRNA水平顯著升高，但與對照組相比仍有較大差異（P<0.05），提示PHA能非特異性刺激T細胞活化增殖，但其活化能力仍較正常者低，這種低活性T細胞限制宿主抗腫瘤免疫應答。近年來，多項研究表明，肝細胞癌與HBV、HCV感染密切相關(guān)，HBV不僅對肝細胞具有高度的親和性，還可侵犯PBMCs、淋巴結(jié)、腎臟等，形成肝外感染。當HBV侵入PBMCs，一方面在其中復制增殖[8]，甚至通過整合酶形成cccDNA，與宿主細胞基因整合；另一方面促使T細胞產(chǎn)生并釋放大量血清可溶性白細胞介素-2受體（soluble interleukin-receptor，sIL-2R），此與CD25產(chǎn)生競爭抑制，限制CD25的表達[9-10]。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，不同病理類型的肝癌患者PHA誘導前后CD25 mRNA水平相似，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示肝癌患者的CD25 mRNA表達與病理分型無關(guān)[11]。

CIK細胞是PBMCs在體外多種細胞因子（如抗-CD3單抗、IL-2、IFN-γ、IL-1α）共同作用下，獲得的一群以CD3+CD56+T細胞和CD3+CD8+T細胞為主要效應細胞的異質(zhì)細胞群，具有高增殖潛能的免疫細胞[12]。肝癌患者采用CIK細胞治療后，發(fā)現(xiàn)外周血靜息期和誘導期CD25及其mRNA表達均明顯升高，提示由于IL-2等刺激，誘導患者T細胞活化，促進細胞表面表達IL-2R，活化的T細胞通過自分泌和旁分泌效應誘導周邊的T細胞活化，形成級聯(lián)放大效應，從而暫時糾正患者細胞免疫功能低下的表現(xiàn)，患者病情得以控制和緩解[13]。有條件的醫(yī)院可定期為患者輸注CIK細胞，使體內(nèi)活化的T細胞維持在一個相對穩(wěn)定的水平，以糾正細胞免疫功能紊亂，改善患者生存質(zhì)量。

綜上所述，肝癌患者細胞免疫功能明顯低下，主要表現(xiàn)為外周血CD25及其mRNA水平降低，其降低程度與病理分型無關(guān)。PHA可體外誘導患者PBMCs表達CD25。CD25可作為觀察患者細胞免疫功能和評估療效的輔助指標。

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