肺間質(zhì)纖維化中去整合素金屬蛋白酶17的表達(dá)及作用機(jī)制*

張蕾，劉敬禹，張輝

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 呼吸科，遼寧 錦州121000）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種原因不明，發(fā)病率和死亡率日趨增加的炎性間質(zhì)性肺部疾病。病理改變與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，早期主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎的炎癥性改變，晚期則為成纖維細(xì)胞大量增殖、細(xì)胞外基質(zhì)和膠原沉積增加、正常的肺組織被替代。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，預(yù)后不良，臨床治療效果欠佳。

去整合素金屬蛋白酶17（disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）屬于A(yíng)DAMs家族成員之一，具有水解蛋白、使生物活性因子釋放的作用[1]，從而活化多種跨膜生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和受體[2-4]，參與黏附、遷移和信號(hào)傳遞等多種細(xì)胞過(guò)程[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)腎臟細(xì)胞ADAM17通過(guò)促進(jìn)TGF-α活化而發(fā)揮致纖維化的作用[5]。本文觀(guān)察了ADAM17在肺纖維化組織中ADAM17基因的表達(dá)，以及細(xì)胞外間質(zhì)Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)ADAM17在肺間質(zhì)纖維化疾病中的作用及分析可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 患者與肺組織

患者來(lái)自遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)、外科，病例收集時(shí)間為2008年4月-2011年4月。肺結(jié)節(jié)病16例，男8例，女8例，年齡33～54歲，均經(jīng)臨床特征、影像學(xué)、病理學(xué)活檢確診及證實(shí)，符合肺結(jié)節(jié)病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；肺結(jié)核患者16例，男8例，女8例，年齡36～50歲，經(jīng)內(nèi)科胸腔鏡獲得病變組織，經(jīng)病理證實(shí)為肺結(jié)核。非小細(xì)胞肺癌10例，男5例，女5例，年齡40～70歲；志愿者8名，男4例，女4例，年齡35～52歲。作為正常對(duì)照，來(lái)源于胸外科手術(shù)切除肺部良性腫瘤周邊的正常肺組織，對(duì)照組患者均無(wú)吸煙史，胸片證實(shí)未見(jiàn)異常。以上均獲得遼寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 Realtime RT-PCR 首先進(jìn)行cDNA第一鏈合成，從-80℃冰箱中取出RNA，在室溫下解凍，然后在0.2ml PCR管中配制反應(yīng)溶液：總RNA 3μg，Oligo-dT（1μg/μl）0.5μl，dNTP mix（10 mM）1μl，ddH2O（DEPC）7.5μl，將反應(yīng)管置于PCR儀中，65℃預(yù)變性5min。變性反應(yīng)結(jié)束后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系：5×first-strand bμffer 4.0μl，0.1MDTT 2.0μl，RNA inhibitor1.0μl，Superscript II（200U/μl）1.0μl，將PCR管子置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，42℃保溫50min后，70℃變性15min。SYBR Green RT-PCR，反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR buffer 12.5μl，ROX 0.5μl，primer（5 pmol）1μl，Template+ddH2O 11μl。50℃孵育2min，然后95℃，2min；接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，94℃，30 s；62℃，30 s。

引物：ADAM17上游引物：5'-AGTCTGCCTGGC TCATCTTT-3'，下游：5'-TACATAATACCCGGGTCAC ACTC-3'；GAPDH上游引物：5'-TGACTTCAACAGC GACACCCA-3'，下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTA GCCAAA-3'。

1.2.2 W estern blot 將處理后的肺組織細(xì)胞用PBS洗2次，加入變性細(xì)胞裂解液并收集，煮沸5min，12 000 g離心15min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩CA蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度，取20μg蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，電壓120 V，電泳時(shí)間2 h；然后將蛋白印跡到硝酸纖維素膜上，于含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉2 h。一抗（1∶1 000）4℃過(guò)夜，二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行顯色反應(yīng)，X膠片曝光，拍照。凝膠成像系統(tǒng)在白光下對(duì)X光膠片掃描后，進(jìn)行吸光度分析，以肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，以與肌動(dòng)蛋白的比值表示各組蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去整合素金屬蛋白酶17基因在肺間質(zhì)纖維化組織中表達(dá)

ADAM17mRNA在肺結(jié)節(jié)病組、肺結(jié)核組、非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05）；在肺結(jié)節(jié)病組與肺結(jié)核組的表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。肺癌組ADAM17 mRNA表達(dá)高于肺結(jié)節(jié)病組和肺結(jié)核組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白在肺間質(zhì)纖維化組織中表達(dá)

Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白在肺結(jié)節(jié)病組、肺結(jié)核組、非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05）；在肺結(jié)節(jié)病組與肺結(jié)核組的表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。肺癌組Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白表達(dá)高于肺結(jié)節(jié)病組和肺結(jié)核組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 去整合素金屬蛋白酶17 mRNA在肺間質(zhì)纖維化組織表達(dá)Real-time PCR結(jié)果

圖2 Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白在肺間質(zhì)纖維化組織表達(dá)Western blot結(jié)果

3 討論

ADAM17參與多種炎癥和增生性疾病，其病理生理作用與腎纖維化、多囊腎和其他慢性腎臟疾病有關(guān)[6]。ADAM17與TGF-α 共同存在于腎纖維化中，MELENHORST等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)腎臟細(xì)胞ADAM17通過(guò)促進(jìn)TGF-α 成熟而發(fā)揮致纖維化的作用。

在多種呼吸系統(tǒng)疾病包括COPD的氣道重塑中，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶解離素（ADAMs）發(fā)揮著重要的作用[6]。吸煙已被證實(shí)減低金屬蛋白酶（TIMPs）內(nèi)生組織抑制劑的表達(dá)，激活A(yù)DAM17。目前的研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17在腫瘤細(xì)胞表面被激活和呈高表達(dá)狀態(tài)[7]。在非小細(xì)胞肺癌中，通過(guò)ADAM17激活Notch 1導(dǎo)致EGFR表達(dá)增加[8]?？梢?jiàn)，ADAM17與纖維化之間存在相關(guān)性。

本文以臨床肺間質(zhì)纖維化疾?。ǚ谓Y(jié)節(jié)病、肺結(jié)核和非小細(xì)胞肺癌）組織作為研究對(duì)象，檢測(cè)了ADAM17mRNA及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白表達(dá)情況，結(jié)果肺間質(zhì)纖維化疾病組織與正常肺組織對(duì)比，ADAM17及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白均表達(dá)加強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；尤其以肺癌組織表達(dá)最高，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與肺結(jié)節(jié)病及肺結(jié)核組對(duì)照亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析ADAM17可能是導(dǎo)致肺纖維化的因素之一，機(jī)制如下：①ADAM17功能多樣，具有水解蛋白、使生物活性因子釋放的功能，可能導(dǎo)致組織增生、纖維化。研究表明：至少有74種不同的膜蛋白的修飾活化過(guò)程受ADAM17的調(diào)控[10]。而對(duì)于系統(tǒng)的TGF-α、HB-EGF、AR的活化則是必需的[11]；這些蛋白通過(guò)特異的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，致纖維化；②A(yíng)DAM17可能使細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的作用減弱，破壞細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間的平衡，最終形成肉芽腫，并為細(xì)胞外基質(zhì)沉積、肺纖維化的發(fā)生提供可能。本文得到的結(jié)果，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)增加即為纖維化機(jī)制之一；③在非小細(xì)胞肺癌中，ADAM17可激活Notch 1，導(dǎo)致一個(gè)EGFR表達(dá)增加的正反饋，從而使組織過(guò)度增殖，引起纖維化。

總之，肺纖維化疾病的組織ADAM17表達(dá)增高，伴隨細(xì)胞外基質(zhì)Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白表達(dá)同步增加，其作用機(jī)制可能是ADAM17打破了細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)平衡，導(dǎo)致基質(zhì)蛋白沉積。確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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