狼瘡性腎炎患者血漿組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙?；副磉_(dá)及其與IL-6、INF-γ 的關(guān)系*

劉抗寒，梁玉梅，饒慧，歐陽沙西，劉芳，曾清華，黃安蘭

（湖南省人民醫(yī)院 腎臟風(fēng)濕免疫科，湖南 長沙410005）

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus，SLE）最常見的并發(fā)癥和死亡原因[1]。細(xì)胞因子在LN病理進(jìn)程中扮演著重要的角色，針對細(xì)胞因子的治療也越來越受到重視。表觀遺傳學(xué)（epigenetics）是近年來生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，它認(rèn)為在基因序列不變的情況下，DNA合成后的修飾，包括DNA甲基化和組蛋白乙酰化在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用[2-3]。組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）、組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）是調(diào)節(jié)組蛋白乙?；年P(guān)鍵酶。同卵雙胞胎同患SLE一致率僅39%～60%，表觀遺傳學(xué)很好地解釋了為什么DNA序列完全相同的個(gè)體對SLE的易感性不同[4]。HAT、HDAC在狼瘡性腎炎患者中表達(dá)如何，是否參與了狼瘡性腎炎的發(fā)病，目前尚無相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)旨在研究狼瘡性腎炎患者血漿中HAT、HDAC表達(dá)水平及其與狼瘡腎炎活動性及白介素-6（interleukin-6，IL-6）、干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）的關(guān)系，探尋其在LN發(fā)病中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象及實(shí)驗(yàn)分組

18例狼瘡腎炎患者均為2012年07月-2014年5月本科室住院患者，全部患者都達(dá)到美國風(fēng)濕學(xué)會（American College of Rheumatology，ACR）1997年推薦的SLE的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。參照FENG、WAGNER等學(xué)者[5-6]對LN的分類標(biāo)準(zhǔn)，滿足以下條件為活動性的LN，蛋白尿>0.5 g/d，或活動性尿沉渣改變（血尿>5個(gè)紅細(xì)胞/Hp，或膿尿>5個(gè)白細(xì)胞Hp，或1個(gè)細(xì)胞管型/Hp），血肌酐升高>1.2mg/dl，并排除感染、腎結(jié)石和其他原因引起的。非活動的LN：蛋白尿<0.5 g/L，非活動性的尿沉渣。將LN患者分為兩組：非活動性組（inactive group，I組），患者8例，男1名，女7名，年齡26～51歲，平均（36.1±10.4）歲；活動性LN組（active group，A組），患者10例，其中，男2名，女8名，年齡24～53歲，平均（39.5±9.4）歲。正常對照組（normal group，N組），患者8例，其中，男1名，女7名，年齡23～36歲，平均（39.4±4.6）歲，均來自本院的健康醫(yī)務(wù)人員。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本收集 所有研究對象均在體檢時(shí)或者入院時(shí)空腹采集靜脈血，靜置30min后，3 000 r/min離心10min，去除下層血細(xì)胞，留取上層血清，并將其置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)凍存，待標(biāo)本收集完畢后檢測HAT、HDAC、INF-γ 濃度。

1.2.2 采用ELISA檢測血漿HAT、HDAC、INF-γ水平 血清中HAT、HDAC、IL-6、INF-γ 濃度的測定，嚴(yán)格按照美國RD公司提供人HAT、HDAC、IL-6、INF-γ 試劑盒內(nèi)的說明書執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩個(gè)樣本均數(shù)之間的比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用方差分析（ANOVA），相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料分析

本實(shí)驗(yàn)入組的LN患者共18例，其中，女15例，男3例，平均年齡分別為（36.1±10.4）vs（39.5±9.4）歲。正常對照組、非活動性LN組、活動性LN組組間的性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組患者的一般資料見表1。

表1 LN患者及對照組的一般資料 （±s）

表1 LN患者及對照組的一般資料 （±s）

注：Pred：強(qiáng)的松；HCQ：羥氯喹；MMF：霉酚酸酯；CTX：環(huán)磷酰胺；ACEI/ARB：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素受體拮抗劑

組別 性別（女）/% 病程/月 蛋白尿/（g/L） 血肌酐/（μmol/L） SLEDAI 主要治療A組（n=10） 80.0 9.1±6.4 1.89±0.61 93±52.7 8.2±2.3 Pred+HCQ+MMF/CTX+ACEI/ARB I組（n=8） 87.5 8.7±5.4 0.32±0.19 80±40.7 2.25±1.0 Pred+HCQ+MMF/CTX/ACEI/ARB N組（n=8） 87.5 - 0.02±0.01 73±33.7 0 -

2.2 各組患者血漿HAT、HDAC含量

I組患者血漿HAT含量低于N組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（12.54±4.94）vs（15.32±3.32），P>0.05]，A組患者HAT含量明顯低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（9.74±3.67）vs（15.32±3.32），P<0.05]，但與I組患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在N組中血漿HDAC含量較高（17.08±6.46），而I組和A組患者中血漿HDAC含量明顯降低[（6.75±2.05）vs（4.53±3.62）]，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組血漿HAT、HDAC含量 （±s）

表2 各組血漿HAT、HDAC含量 （±s）

注：1）與N組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；2）與I組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

組別 HDAC/（ng/L）N組（n=8） 17.08±6.46 I組（n=8） 6.75±2.052）A組（n=10） 4.53±3.622）HAT/（ng/L）15.32±3.32 12.54±4.94 9.74±3.671）

2.3 各組患者血漿IL-6、INF-γ 含量

I組和A組患者血漿中IL-6、INF-γ 均明顯高于N組，A組患者血漿中IL-6、INF-γ 明顯高于I組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組血漿IL-6、INF-γ 含量 （±s）

表3 各組血漿IL-6、INF-γ 含量 （±s）

注：1）與N組比較，差異有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；2）與I組比較，差異有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

組別 INF-γ/（ng/L）N組（n=8） 0.48±0.26 I組（n=8） 1.66±0.581）A組（n=10） 2.86±0.851）2）IL-6/（ng/ml）90.21±13.34 123.67±23.071）174.12±30.281）2）

2.4 HAT、HDAC與IL-6、INF-γ 相關(guān)性分析

發(fā)現(xiàn)HAT、HDAC與IL-6呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.532和-0.665）；同時(shí)，HAT、HDAC與INF-γ 呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.621和-0.720）。

3 討論

表觀遺傳學(xué)參與了SLE的發(fā)病機(jī)制[4，7-8]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）主要是在組蛋白H3、H4的N端尾上的賴氨酸加上乙?；趸M蛋白賴氨酸的正電荷，減少組蛋白與DNA之間的靜電作用，增加基因的表達(dá)；組蛋白去乙?；福℉DAC）則相反，參與組成轉(zhuǎn)錄共同抑制復(fù)合物。HAT與HDAC活性改變，會導(dǎo)致組蛋白乙?；潭劝l(fā)生改變，影響基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生[2]。

本研究首次觀察了狼瘡性腎炎患者血漿中HAT、HDAC表達(dá)情況，并發(fā)現(xiàn)LN活動期患者和非活動期患者血漿HAT、HDAC較正常對照組明顯降低。表明狼瘡性腎炎患者HAT、HDAC活性發(fā)生了改變，可能參與了狼瘡性腎炎的發(fā)病。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，活動組患者血漿中HAT、HDAC低于非活動組患者，盡管這種差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由于本研究樣本量較少，不能簡單地認(rèn)為，血漿HAT、HDAC含量與LN活動性無關(guān)，這有待進(jìn)一步大樣本的研究。

細(xì)胞因子在SLE病理進(jìn)程中扮演著重要的角色，并與LN活動性有著密切的關(guān)系[9]。IL-6可以激活B細(xì)胞，促使?jié){細(xì)胞分化，也能促進(jìn)Th17和濾泡Th細(xì)胞分化，是一種重要的促炎癥因子[10]，而INF-γ是主要由NK、CD4、CD8T細(xì)胞產(chǎn)生發(fā)揮免疫刺激和免疫調(diào)節(jié)作用的一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞因子[11]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡和狼瘡性腎炎患者血漿中IL-6、INF-γ 明顯高于正常水平[9]，在狼瘡性腎炎患者中已經(jīng)觀察到高水平INF-γ 與腎臟疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，同時(shí)，血漿中INF-γ 含量升高與增殖性腎小球腎炎和膜性腎?。↖V型和V型）相關(guān)[12]?；顒有訪N患者尿中INF-γ 表達(dá)增多，其水平與SLEDAI相關(guān)[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，LN患者血漿中IL-6、INF-γ 水平明顯高于正常人，同時(shí)，活動性LN組血漿中IL-6、INF-γ 明顯高于非活動組，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致[7]，提示IL-6、INF-γ 與LN活動相關(guān)。

為了進(jìn)一步探尋HAT、HDAC與LN的關(guān)系，本課題組分析了HAT、HDAC和IL-6、INF-γ 的相關(guān)性。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HAT、HDAC與IL-6、INF-γ 呈負(fù)相關(guān)，提示血漿HAT、HDAC的改變可能影響IL-6、INF-γ 表達(dá)，間接提示HAT、HDAC可能與LN活動相關(guān)。組蛋白具有各種炎癥因子和炎癥信號轉(zhuǎn)錄的“開關(guān)”分子功能，組蛋白乙酰化改變參與多種細(xì)胞因子激活，HAT、HDAC則直接調(diào)節(jié)組蛋白乙?；絒14-15]。HAT、HDAC的活性改變可能直接影響細(xì)胞中IL-6、INF-γ 基因啟動子組蛋白乙酰化水平發(fā)揮作用，或者通過影響其他促炎癥因子基因組蛋白乙酰化水平間接增加IL-6、INF-γ 表達(dá)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

以上研究表明，LN患者血漿HAT、HDAC活性降低，可能影響IL-6、INF-γ 等表達(dá)，可能參與LN的發(fā)病。

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