血清胰島素樣生長(zhǎng)因子-2、甲胎蛋白、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶II及異常凝血酶原聯(lián)合檢測(cè)在肝癌診斷中的價(jià)值

戴衛(wèi)鋒

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢430033）

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤第二位，預(yù)后差，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高[1]。肝癌早期診斷是肝癌治療研究的熱點(diǎn)，腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是一種無創(chuàng)且性價(jià)比較高的檢測(cè)方法，現(xiàn)已被患者和臨床廣泛認(rèn)可。AFP是目前肝癌診治中最常采用的標(biāo)志物，而γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶II（γ-glutamyl transferase isoenzyme II，GGT-II）和異常凝血酶原（abnormal prothrombin，APT）是目前另外兩種比較常用的標(biāo)志物，其特異性較高，對(duì)肝癌診斷有較高的臨床價(jià)值。雖然目前腫瘤標(biāo)志物對(duì)肝癌早期診斷有一定的臨床意義，但它們的靈敏度以及特異性并不令人十分滿意[2]。胰島素樣生長(zhǎng)因子3（insulin like growth factor 3，IGF-2）是生長(zhǎng)激素效應(yīng)的主要介導(dǎo)者，是體內(nèi)重要的促有絲分裂因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，抑制凋亡。研究表明，IGF-2對(duì)一系列腫瘤細(xì)胞系有強(qiáng)絲裂原效應(yīng)，包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌及肝細(xì)胞癌等[3]。血中IGF-2濃度增高提示罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[4]。應(yīng)用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）研究肝癌患者血清中IGF-2表達(dá)的特點(diǎn)以及聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物AFP、GGT-II、APT檢測(cè)對(duì)肝癌診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值，旨在探索一種新的、無創(chuàng)的肝癌早期診斷及療效判斷方法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

114例肝癌患者及28例肝良性病變患者均為2013年1-12月期間在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院普外科住院患者；47例健康受試者為本院健康體檢正常的成年人。所有研究對(duì)象均行腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)且排除高血壓、心血管疾病及糖尿病疾患。114例肝癌患者中，男81例，女33例，年齡43～86歲，平均63歲。其中79例經(jīng)外科手術(shù)、腫瘤穿刺活組織檢查證實(shí)，35例為PET/CT、CT（MRD）及全身骨顯像等發(fā)現(xiàn)胸外有明確轉(zhuǎn)移灶并結(jié)合病史確診。健康體檢者無肝部疾患和其他嚴(yán)重疾病，肝良性病變患者經(jīng)病理檢查或治療后影像學(xué)隨訪確診，其中肝硬化患者36例，肝良性囊腫11例。

1.2 試劑與儀器

IGF-2檢測(cè)試劑盒（美國Diagnostic system laboratories公司）；AFP，GGT-II，APT檢測(cè)試劑購自Roche公司；SN-6958型全自動(dòng)放射免疫計(jì)數(shù)儀（上海核所日光環(huán)電儀器有限公司生產(chǎn)）；化學(xué)發(fā)光免疫多功能檢測(cè)儀（美國Roche公司生產(chǎn)，型號(hào)cobas e 601型）。

1.3 血清采集

所有研究對(duì)象均于早晨6∶00～9∶00空腹靜脈采血3ml，分離血清后立即用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。

1.4 IGF-2及AFP、GGT-II、APT檢測(cè)

IGF-2采用放射免疫法（RIA）進(jìn)行檢測(cè)，按試劑盒說明書的步驟測(cè)定血清IGF-2濃度。AFP、GGT-II、APT應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

血清標(biāo)志物的水平以中位數(shù)及極差表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件包。組間比較采Kruskal-Wallis單因素方差分析，兩兩比較采用Mann Whitney秩和檢驗(yàn)，P<0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用ROC曲線分析各項(xiàng)指標(biāo)的診斷靈敏度和特異性，單項(xiàng)指標(biāo)通過檢測(cè)結(jié)果作圖繪成ROC曲線，聯(lián)合指標(biāo)先建立多因素非條件Logistic回歸模型（采用偏最大似然估計(jì)的Enter法），再通過模型中的概率值擬合ROC曲線。曲線下面積（area under the ROC curve，Auc）采用Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 IGF-2與三種腫瘤標(biāo)志物在三組研究對(duì)象中的表達(dá)特征及比較

肝癌組與非肝癌組各項(xiàng)指標(biāo)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IGF-2：χ2=267.18，P<0.001；AFP：χ2=52.11，P<0.001；GGT-II：χ2=39.52，P<0.001；APT：χ2=38.94，P<0.001）。

2.2 IGF-2與三種腫瘤標(biāo)志物單個(gè)或聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

為了觀察各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)肝癌診斷整體情況，把診斷的界值設(shè)為特異性為95%時(shí)，計(jì)算出各單項(xiàng)項(xiàng)指標(biāo)及聯(lián)合指標(biāo)診斷肝癌靈敏度、陽性預(yù)測(cè)值以及陰性預(yù)測(cè)值（表2）。

由表2可知，單個(gè)檢測(cè)時(shí)，IGF-2和GGT-II的各項(xiàng)指標(biāo)均較高，靈敏度分別為76.0%和66.7%，正確率分別為85.3%和80.7%；陽性預(yù)測(cè)值分別為93.4%和92.6%，陰性預(yù)測(cè)值分別為78.9%和74.0%聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，靈敏度明顯上升，正確率和陰性預(yù)測(cè)值亦有所升高，但特異性和陽性預(yù)測(cè)值有不同程度下降；綜合考慮，以（IGF-2）+（GGT-II）與（IGF-2）+（AFP）+（GGT-II）兩種組合較好。

2.3 IGF-2與GGT-II、AFP、APT單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)肝癌診斷效能的比較

以非肝癌組作為參照，繪制各個(gè)腫瘤指標(biāo)的ROC曲線。由圖1可以明顯看出，GGT-II對(duì)肝癌的診斷效能最高，其他依次是IGF-2、AFP和APT。GGT-II曲線下面積為0.891，95%的可信區(qū)間為0.821～0.962；IGF-2曲線下面積（AUC）為0.887，95%的可信區(qū)間（CI）為0.798～0.963；AFP曲線下面積為0.836，95%的可信區(qū)間為0.746～0.9251，APT曲線下面積為0.697，95%的可信區(qū)間為0.576～0.818。

2.4 IGF-2與GGT-II、AFP、APT不同組合對(duì)肝癌診斷效能的比較

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果作多因素非條件Logistic回歸模型，再根據(jù)模型中的概率值擬合ROC曲線（圖2）。比較圖1與圖2，聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高肝癌的診斷效能。

表1 健康人、肝良性病患者和肝癌患者三種血清標(biāo)志物及IGF-2測(cè)定值 （±s）

表1 健康人、肝良性病患者和肝癌患者三種血清標(biāo)志物及IGF-2測(cè)定值 （±s）

注：經(jīng)Kruskal-Walis單因素方差分析和Mann Whimey秩和檢驗(yàn)：1）表示肝癌組與肝良性病變組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；2）表示肝癌組與健康體檢組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

組別 n AFP GGT-II APT IGF-2健康體檢組 47 1.752±0.372 1.446±0.218 11.36±3.142 155.8±27.94肝良性病變組 28 1.475±0.294 2.014±0.593 11.18±2.863 125.8±21.63肝癌組 114 6.921±1.5321）2） 3.943±1.2641）2） 13.95±3.1741）2） 263.8±34.391）2）

表2 IGF-2與三種腫瘤標(biāo)志物單個(gè)或聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

圖1 IGF-2及三種血清腫瘤標(biāo)志物診斷肝癌的ROC曲線

3 討論

目前胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)（IGFs）在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注。研究表明IGFs在促細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及抗凋亡方面具有十分重要的作用，尤其是IGF-2。IGF-2主要是通過增加DNA的合成并上調(diào)周期素D1（Cyclin D1）的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期中GI-S期的轉(zhuǎn)化。近來的研究表明血清中IGF-2水平與肝癌的發(fā)生呈正相關(guān)性，不僅與患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而且與肝癌的生物學(xué)行為如轉(zhuǎn)移等相關(guān)[5-6]。本研究結(jié)果顯示肝癌患者血清中IGF-2水平明顯高于肝良性病變組患者和健康受試者（P<0.05），表明IGF-2可作為鑒別肝部良惡性病變的指標(biāo)。健康體檢組與肝良性病變組血清IGF-2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明它對(duì)肝部良性病變?cè)\斷無臨床意義。特異性為95%時(shí)，靈敏度為76.0%，準(zhǔn)確性為85.3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他指標(biāo)；ROC曲線顯示，它的曲線下面積是0.887，僅比GGT-II 0.891稍低；表明它的診斷效能較高，有望成為新的腫瘤標(biāo)志物。

大量研究證實(shí)，AFP具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，如促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡和免疫逃避[7-8]。現(xiàn)已證實(shí)其在肝癌患者血清中陽性值百分比也較高，是目前肝癌診治中最常采用的標(biāo)志物之一[9]。本研究結(jié)果顯示肝癌組血清AFP水平顯高于非肝癌（P<0.001）。AFP對(duì)肝癌的診斷ROC曲線下面積（AUC）的AUC值為0.836；特異性為95%時(shí)，它的靈敏度不高，僅為53.3%。

圖2 IGF-2及GGT-II、AFP聯(lián)合診斷肝癌的ROC曲線

GGT廣泛分布于體內(nèi)，以腎臟、肝臟、胰腺、小腸等臟器最為豐富，其中又以腎臟活性最高。但血清中GGT多來自肝組織[10]。GGT-II診斷HCC特異性高，除轉(zhuǎn)移癌偶可出現(xiàn)陽性外，其余肝病中及正常人中出現(xiàn)率極低。目前檢測(cè)GGT-II的方法主要有聚丙烯酰胺梯度電泳（PVSGE）和親和層析法，國內(nèi)學(xué)者報(bào)道其檢測(cè)陽性率分別為90%和84%，檢測(cè)特異性分別為98%和97%[11]。因此GGT-II可作為診斷肝癌的重要腫瘤標(biāo)志物。本研究顯示肝癌組血清GGT-II水平明顯高于非肝癌組（P<0.001），GGT-II曲線下面積為0.891，與趙威等[12]研究的一致，比IGF-2稍高，但在特異性為95%時(shí)，靈敏度為66.7%，準(zhǔn)確度為80.7%，比AFP和APT高，比IGF-2低。

異常凝血酶原（APT）是在肝臟合成凝血酶原的過程中，因前體不完全羧化而產(chǎn)生并釋放入血的一種物質(zhì)，肝癌患者的血液中該物質(zhì)呈顯著增高，有學(xué)者做了大量關(guān)于APT在肝癌診斷中的研究，取得了不少成果[13-14]。本研究結(jié)果顯示肝癌組血清APT水平也明顯高于非肝癌組（P<0.001），特異性為95%時(shí)，靈敏度為42.7%，準(zhǔn)確性為68.7%，ROC曲線下面積為0.697。

盡管IGF-2、AFP、GGT-II及APT對(duì)肝癌診斷有各自的價(jià)值，但單獨(dú)用于肝癌診斷均有欠缺，這可能與腫瘤組織具有明顯的異質(zhì)性有關(guān)。腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合診斷可明顯增加肝癌的診斷效能，但對(duì)IGF-2與其他腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合研究尚無報(bào)道。本文將IGF-2與AFP、GGT-II、APT進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，各聯(lián)合組的敏感性均明顯高于單項(xiàng)指標(biāo)的敏感性，但特異性發(fā)生了不同程度的下降，兩項(xiàng)聯(lián)合以（IGF-2）+（GGT-II）較好，靈敏度達(dá)了94.7%，特異性也達(dá)到了90.7%，準(zhǔn)確性為92.7%，陽性預(yù)測(cè)值為91.0%，陰性預(yù)測(cè)值為94.4%；IGF-2與AFP及GGT-II三項(xiàng)組合靈敏度達(dá)至97.3%，特異性為86.7%，準(zhǔn)確性為92.0%，陽性預(yù)測(cè)值為88.0%，陰性預(yù)測(cè)值為97.0%，IGF-2與AFP、GGT-II、APT四項(xiàng)聯(lián)合靈敏度為97.3%，但特異性下降到82.7%。通過ROC曲線可見，各聯(lián)合組的診斷效能明顯提高，兩項(xiàng)聯(lián)合以（IGF-2）+（GGT-II）診斷效能最高，AUC為0.969；（IGF-2）+（AFP）+（GGT-II）與（IGF-2）+（AFP）+（APT）的AUC值均為0.984。聯(lián)合檢測(cè)有助于提高肝癌的臨床診斷率，降低肝癌的漏診率，是肝癌診斷的較好選擇。

[1]SCHLAGETER M,TERRACCIANO LM,D'ANGELO S,et al.Histopathology of hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2014,20(43):15955-15964.

[2]趙敏星,倪潤洲,肖明兵,等.HS-AFP,GGT-Ⅱ及AFP預(yù)測(cè)肝硬化癌變的臨床價(jià)值[J].中國腫瘤臨床,2009,36(11):601-604.

[3]LIVINGSTONE C.IGF2 and cancer[J].Endocr Relat Cancer,2013,20(6):321-339.

[4]ENGUITA-GERMáN M,FORTES P.Targeting the insulin-like growth factor pathway in hepatocellular carcinoma[J].World J Hepatol,2014,6(10):716-737.

[5]RASHAD NM,EL-SHAL AS,ABD ELBARY EH,et al.Impact of insulin-like growth factor 2,insulin-like growth factor receptor 2,insulin receptor substrate 2 genes polymorphisms on susceptibility and clinicopathological features of hepatocellular carcinoma[J].Cytokine,2014,68(1):50-58.

[6]OKUSHIN K,ASAOKA Y,FUKUDA I,et al.IGF-II producing hepatocellular carcinoma treated with sorafenib:metabolic complications and a foresight to molecular targeting therapy to the IGF signal[J].Case Rep Gastroenterol,2012,6(3):784-789.

[7]DEBRUYNE EN,DELANGHE JR.Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma with alpha-fetoprotein:new aspects and applications[J].Clin Chim Acta,2008,395(1-2):19-26.

[8]LI M,LI H,LI C,et al.Alpha fetoprotein is a novel protein-binding partner for caspase-3 and blocks the apoptotic signaling pathway in human hepatoma cells[J].Int J Cancer,2009,124(12):2845-2854.

[9]YANG X,ZHANG Y,ZHANG L,et al.Silencing alpha-fetopro

tein expression induces growth arrest and apoptosis in human

hepatocellular cancer cell[J].Cancer Lett,2008,271(2):281-293.

[10]XU K,MENG XY,WU JW,et al.Diagnostic value of serum gamma-glutamyl transferase isoenzyme for hepatocellular carcinoma:a 10-year study[J].Am J Gastroenterol,1992,87(8):991-995.

[11]OHATA M,TODA G.Gamma-glutamyitranspeptidase(Gamma-GT)[J].Rinsho Byofi,2001,116(8):62-71.

[12]趙威,竇科峰,岳樹強(qiáng),等.血清AFP,GGT-II及sICAM-1聯(lián)合檢測(cè)診斷肝細(xì)胞性肝癌的價(jià)值[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(5):465-467.

[13]TANABE Y,OHNISHI K,NOMURA F,et al.Plasma abnormal prothrombin levels in patients with small hepatocellular carcinoma[J].American Journal of Gastroenterology,1988,83(12):1386-1389.

[14]OHHIRA M,SAITO H,SUZUKI Y,et al.A variant of des-γ-carboxy prothrombin was increased in alcoholic liver disease without hepatocellular carcinoma[J].Alcoholism:Clinical and Experimental Research,2001,25(6 suppl):46S-50S.