氨基肽酶N在腎細(xì)胞癌組織的表達(dá)及意義

陳平鋒

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，湖南 衡陽(yáng)421001）

腎細(xì)胞癌是起源于腎小管上皮細(xì)胞的一類(lèi)惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，在成人泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率僅次于膀胱癌，居第2位[1]，且發(fā)病和死亡率有逐年增高的趨勢(shì)?；颊叱踉\時(shí)約45%已有腫瘤轉(zhuǎn)移，50%～60%的腎癌患者術(shù)后有腫瘤復(fù)發(fā)。腎癌具有特殊的遺傳生物學(xué)特性和異質(zhì)性，較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的放化療對(duì)晚期轉(zhuǎn)移性腎癌極不敏感。多年來(lái)應(yīng)用分子免疫、基因治療以及抗腫瘤血管形成的分子靶向治療對(duì)晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌己取得令人滿意的療效。在對(duì)腎癌的診斷、治療和預(yù)后相關(guān)性研究中，大量的腫瘤相關(guān)因子表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

氨基肽酶N（aminopeptidase N，APN） 又名CD13是一種Ⅱ型膜結(jié)合鋅離子金屬蛋白酶，可以將氨基酸從寡肽N末端切除的膜結(jié)合糖蛋白[2]。CD13最早主要作為髓細(xì)胞表面標(biāo)志物用于白血病分類(lèi)的鑒別。近年來(lái)CD13在腫瘤方面的相關(guān)研究日益增多。研究表明其在體內(nèi)通過(guò)單一機(jī)制或多個(gè)機(jī)制協(xié)同作用參與腫瘤病理生理過(guò)程。CD13通過(guò)蛋白水解酶的作用，降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與腫瘤間的信號(hào)傳導(dǎo)，參與新生血管形成，導(dǎo)致腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[3]。本研究采用免疫組化方法研究了腎癌組織中CD13的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系，以期為腎癌的診斷、預(yù)后及靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2006年6月-2009年6月南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的腎癌、癌旁、遠(yuǎn)癌新鮮組織各93例，所有標(biāo)本術(shù)前均未經(jīng)放、化療，并經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確認(rèn)均為腎細(xì)胞癌。從每例患者的手術(shù)標(biāo)本中分別取癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織，癌組織均在原發(fā)灶取材，避開(kāi)壞死、炎癥區(qū)域；癌旁組織取自相應(yīng)腫塊旁0.5～2 cm的腎組織;遠(yuǎn)癌組織均取自距腫塊邊緣5 cm以上的腎組織。標(biāo)本均在術(shù)中離體后立即收集，取材均為黃豆粒大小，取材后立即凍存保存于液氮中。93例標(biāo)本中，其中，男62例，女31例；年齡<60歲56例，≥60歲37例；透明細(xì)胞癌64例，乳頭狀細(xì)胞癌13例，嫌色細(xì)胞癌12例，集合管癌4例；臨床分期：Tl期32例，T2期34例，T3～T4期27例；病理組織學(xué)分級(jí)：Gl級(jí)24例，G2級(jí)37例，G3～G4 26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例。

1.2 試劑

CD13單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗人VEGF多克隆抗體（貨號(hào)ZA-0509，北京中杉公司），PV-9000試劑盒（北京中杉公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)PV-9000法

將存檔的石蠟標(biāo)本重新制備4μm厚切片，脫蠟，再水化。置于pH 6.0的檸檬酸緩沖液中行高壓抗原修復(fù)后，3%雙氧水（H2O2）消除切片內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。滴加一抗（CD13單克隆抗體，工作液濃度為1∶150；兔抗人VEGF多克隆抗體，即用型，稀釋度1∶100），4℃冰箱濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。滴加二抗試劑1和試劑2（PV-9000試劑盒），并置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育30min。顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水至透明，中性樹(shù)膠封片。用已知肝癌陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：由2位不知曉患者臨床資料的病理醫(yī)師進(jìn)行結(jié)果判定。以胞核內(nèi)有黃或棕黃色顆粒染色者為CD13陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比<10%計(jì)為Spl陰性，10%～50%者計(jì)為CD13陽(yáng)性表達(dá)，>50%者為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's精確概率法，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD13與腎細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

CD13主要表達(dá)于癌細(xì)胞膜，CD13陽(yáng)性表達(dá)（+）和CD13強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（++）（圖1）。CD13在93例腎癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為73.11%（68/93），癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為21.51%（20/93），正常腎組織中陽(yáng)性表達(dá)率為6.45%（6/93）。三者表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。腎細(xì)胞癌中CD13蛋白表達(dá)與腫瘤大小、年齡、性別無(wú)相關(guān)性，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)及TNM分期有關(guān)（P<0.05，表2）。

2.2 CD13在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

腎細(xì)胞癌組織中CD13表達(dá)陽(yáng)性患者1、3及5年生存率分別為50.0%（34/68）、20.43%（15/68）及2.94%（2/68）；CD13陰性表達(dá)患者1、3及5年生存率分別為88.0%（22/25）、76.0%（19/25） 及32.0%（8/25）。CD13表達(dá)陽(yáng)性患者1、3及5年生存率均低于CD13表達(dá)陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。K-M生存曲線分析（圖2）顯示CD13陽(yáng)性表達(dá)組（+）中位生存時(shí)間為13.86個(gè)月，CD13強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)組（++）中位生存時(shí)間為8.76個(gè)月，CD13陰性表達(dá)組中位生存時(shí)間為51.50個(gè)月。CD13陽(yáng)性表達(dá)組患者預(yù)后明顯差于CD13陰性表達(dá)組，其中CD13強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)組（++）病例預(yù)后最差。Log-rank檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。多因素COX逐步回歸分析提示腎癌患者的預(yù)后與CD13表達(dá)、TNM分期相關(guān)，CD13是影響總體生存率預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 CD13在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)

表1 CD13蛋白在腎癌、癌旁、正常組織的表達(dá) （n=93）

表2 腎癌組織中CD13蛋白表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系 [例（%）]

圖2 CD13表達(dá)陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性和陰性腎癌患者的生存曲線

3 討論

目前研究證實(shí)，CD13參與多種人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其可能的機(jī)制包括四個(gè)方面。①CD13能夠通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，釋放促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子，也可間接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖信號(hào)，或作為一種特殊受體參與MMP（matrix metalloproteinase）的過(guò)表達(dá)過(guò)程，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)[4-5]。②CD13還參與腫瘤新生血管的形成，新生血管形成主要與Ras-絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）途徑和Ras-PI K途徑2條途徑有關(guān)，而CD13是Ras介導(dǎo)的兩個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的靶分子。活化的Ras、Raf、MAPK傳遞信號(hào)到核內(nèi)，使核轉(zhuǎn)錄因子Ets-2磷酸化。活化的Ets-2與CD13近端啟動(dòng)子相結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[6]。③CD13還參與腫瘤細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，CD13可水解靶器官或靶組織的細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜（基膜和Ⅳ型膠原蛋白），從而使原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞隨血液或淋巴液循環(huán)遷移黏附形成轉(zhuǎn)移灶；④CD13可通過(guò)降解IL-8、MHCⅡ型黏附抗原決定簇而降低T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，從而降低機(jī)體免疫功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活[7]。

近年的研究顯示CD13在肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞表面均有異常表達(dá)而且與某些腫瘤的分化狀態(tài)、臨床分期和預(yù)后相關(guān)[8-10]。但是對(duì)于CD13在膀胱癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，相關(guān)研究不多。本研究顯示膀胱癌組織CD13的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織以及正常膀胱組織，而且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分級(jí)分期相關(guān)。目前臨床上最為常用的膀胱癌診斷方法為尿細(xì)胞學(xué)（UC）檢查，但近年發(fā)現(xiàn)UC檢查對(duì)早期患者的敏感性不甚令人滿意，臨床亟需更加敏感或特異的生化標(biāo)志物。VAN等[11]對(duì)全血、良惡性胸腹水及腫瘤內(nèi)液可溶性CD13（sCD13）水平進(jìn)行研究表明：惡性腫瘤患者血漿或胸腹水中的sCD13的水平明顯高于良性疾病患者。乳腺癌、卵巢癌和骨肉瘤患者體液中sCD13顯著升高，提示sCD13水平有助于惡性腫瘤的診斷。IKEDA等[12]對(duì)50例胰腺癌患者研究顯示，CD13與腫瘤新生血管有關(guān)，可作為胰腺癌的獨(dú)立的診斷標(biāo)志。因此，根據(jù)以往和本研究結(jié)果，筆者大膽推測(cè)CD13有可能作為一個(gè)新的膀胱癌診斷標(biāo)志物，但具體方法有待進(jìn)一步研究。CD13與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)及臨床分期有關(guān)，提示CD13與膀胱癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。CD13陽(yáng)性表達(dá)組病例的1、3及5年生存率顯著低于CD13陰性表達(dá)組，CD13陽(yáng)性表達(dá)組患者預(yù)后較差。

COX分析顯示CD13是影響膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。這些結(jié)果提示CD13的表達(dá)也可以作為判斷預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)。

研究表明CD13抑制劑可通過(guò)半胱天冬酶-3信號(hào)途徑和磷脂酰肌醇-3激酶（P13K）-糖原合酶（GSK）信號(hào)途徑誘導(dǎo)K562細(xì)胞和急性白血病細(xì)胞U937凋亡[13]。其代表藥物為Bestatin，是一種從橄欖網(wǎng)狀鏈霉菌培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)的小分子肽。目前，CD13抑制劑已用于動(dòng)物腫瘤轉(zhuǎn)移模型的治療，已有多種藥物在人類(lèi)臨床前實(shí)驗(yàn)中取得良好的抗腫瘤效果。TSUKAMOTO等[14]研究表明Bestatin能提高宮頸癌化療療效，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞Hela凋亡。CHRIST等[15]研究發(fā)現(xiàn)Bestatin能誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡，提高膀胱癌化療療效。NGR血管跟蹤肽即天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg）是CD13的特異性受體。以NGR為載體，將各種抑癌物質(zhì)如阿霉素、腫瘤壞死因子和抑癌基因特異結(jié)合研究腫瘤血管靶向治療新藥物，可增加療效，減少全身用藥，降低不良反應(yīng)。CHEN等[16]將包裹阿霉素的脂質(zhì)體和抑癌基因與NGR結(jié)合靶向?qū)隒D13陽(yáng)性表達(dá)的人纖維肉瘤細(xì)胞Ht-1080，引起CD13表達(dá)陽(yáng)性的Ht-1080細(xì)胞凋亡。然而CD13在人體分布范圍廣、功能多并參與各種生理病理過(guò)程，因此，只有研制出選擇性高、組織特異性好的CD13靶點(diǎn)藥物才可有效抗腫瘤，否則會(huì)影響機(jī)體功能，產(chǎn)生多種并發(fā)癥。綜上所述，檢測(cè)CD13對(duì)膀胱肝癌的診斷、預(yù)后及治療具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1]FUESSEL S,ERDMANN K,TAUBERT H,et al.Prognostic impact of urokinase-type plasminogen activator system components in clear cell renal cell carcinoma patients without distant metastasis[J].BMC Cancer,2014,14(1):974-983.

[2] ASHMUM RA, LOOK AT. Metalloprotease activity of CD13/aminopeptidase N on the surface of human myeloid cells[J].Blood,1990,75(8):462-469.

[3]SAIKI I,FUJII H,YONEDA J,et al.Role of aminopeptidase N(CD13)in tumor cell invasion and extracellular matrix degradation[J].Int J Cancer,1993,5(9):137-143.

[4]LAI A,GHAFFAIR A,LI Y,et al.Paracrine regulation of fibroblast aminopeptidase N/CDl 3 expression by keratinocyte-releasable stratifin[J].J Cell Physiol,2011,226(8):3114-3120.

[5]GHAFFARI A,LI Y,KILANI RT,et a1.14-3-3 sigma associates with cell surface aminopeptidase N in the regulation of matrix metalloproteinase[J].J Cell Sci,2010,123(11):2996-3005.

[6]BHAGWAT SV,PETROVIC N,OKAMOTO Y,et al.The angiogenic regulator CD13/APN is a transcriptional target of Ras signaling pathways in endothelial morphogenesis[J].Blood,2003,101(21):1818-1826.

[7]RIEMANNN D,KEHLEN A,LANGNER J.CD13-not just a marker in leukemia typing[J].Immunol Today,1999,20(19):83-88.

[8]WICKSTROM M,LARSSON R,NYGREN P,et al.Aminopeptidase N (CD13)as a target for cancer chemotherapy[J].Cancer Science,2011,102(18):501-518.

[9]ROCKEN C,LICHT J,ROESSNER A,et al.Canalicular immunostaining of aminopeptidase N(CD13)as a diagnostic marker for hepatocellular carcinoma[J].J Clin Pathol,2005,58(9):1069-1075.

[10]HARAGUCHI N,ISHII H,MIMORI K,et al.CDl 3 is a therapeutic target in human liver cancer stem cells[J].J Clin Invest,2010,120(14):3326-3339.

[11]VAN HENSHERGEN Y,BROXTERMAN HI,HANEMAAIJER R,et a l.Soluble aminopeptidase N/CDl 3 in malignant and nonmalignant effusions and intratumoral fluid[J].Clin Cancer Res,2002,8(2):3747-3754.

[12]IKEDA N,NAKAJIMA Y,TOKUHARA T,et al.ClinicaI significance of aminopeptidase N/CDl 3 expression in human pancreatic carcinoma[J].Clin Cancer Res,2003,9(23):1503-1508.

[13]PIEDFER M,DAUZONNE D,TANG R,et a l.Aminopeptidase-N/CD13 is a potential proapoptotic target in human myeloid tumor cells[J].FASEB J,2011,25(7):2831-2842.

[14]TSUKAMOTO H,SHIBATA K,KAJIYAMA H,et a1.Aminopeptidase N(APN)/CD13 inhibitor,ubenimex,enhances radiation sensitivity in human cervical cancer[J].BMC Cancer,2008,8(7):74.

[15]CHRIST B,STOCK P,DOLLINGER MM.CD13:Waving the flag for a novel cancer stem cell target[J].Hepatology,2011,53(12):1388-1390.

[16]CHEN Y,WU JJ,HUANG L.Nanopartieles targeted with NGR motif deliver c-myc siRNA and doxorubiein for antieancer therapy[J].Mol Ther,2010,18(4):828-834.