當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒早期干預(yù)結(jié)締組織生長因子防治高血壓腎損害及腎血管病變*

王琳娜 郭存霞 陳小永 楊華山

高血壓腎損害是原發(fā)性高血壓引起的良性小動(dòng)脈性腎硬化和惡性小動(dòng)脈性腎硬化及其伴有相應(yīng)臨床表現(xiàn)的疾病。高血壓腎損害主要表現(xiàn)為血管的損害和腎間質(zhì)纖維化。結(jié)締組織生長因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）是轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transform Growth Factorβ，TGF-β1）下游的重要致纖維化因子之一，早期干預(yù)CTGF表達(dá)，能阻止纖維化進(jìn)程[1-2]。那么當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒（Danggui Buxue granules，DG）早期干預(yù)對(duì)高血壓腎損害的血管病變有無治療作用，早期用藥是否與CTGF表達(dá)相關(guān)，本研究將對(duì)此進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 36只成年雄性自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHR）及10只同源雄性（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠試喂養(yǎng)1周，根據(jù)用藥時(shí)間分早期組和晚期組，早期組選用8周齡SHR大鼠，晚期組選用12周齡SHR大鼠，并設(shè)置同齡WKY組大鼠為正常對(duì)照。早期組包括當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒治療組（DG組，10只）和生理鹽水對(duì)照組（NS組，8只）和同齡WKY大鼠（5只）；晚期組包括當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒治療組（DG組，10只）和生理鹽水對(duì)照組（NS組，8只）和同齡WKY大鼠（5只）。早期DG組6 g/（kg·d）灌胃，直至28周齡；晚期組以同樣DG灌胃，直至28周齡；NS組以等量生理鹽水灌胃，WKY大鼠不做任何處理。各組大鼠血壓采用無創(chuàng)性尾套式大鼠血壓計(jì)監(jiān)測(cè)，每周1次，在大鼠清醒狀態(tài)下測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓，每鼠測(cè)量3次，取均值，每周測(cè)血壓兩次。測(cè)血壓前大鼠經(jīng)37 ℃預(yù)熱15 min。

1.2 主要材料 當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒購自河南省中醫(yī)院配方顆粒藥房，選用黃芪30 g，當(dāng)歸6 g；尿β2微球蛋白按照放射免疫試劑盒由中國原子能科學(xué)研究所生產(chǎn)；總RNA提取試劑盒（RNeasyMini Kit試劑盒）購自美國Qiangen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，real-time PCR試劑盒（q-PCR Mixture）購自日本TaKaRa公司，熒光探針實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI 7900HT）購自美國Applied Biosystems公司，real-time PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成，羊抗CTGF多克隆抗體購自美國Abcam公司，鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司，二抗均購自美國Sigma公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液購自美國Pierce公司。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠在28周齡時(shí)處死，處死前1 d，代謝籠收集24 h尿液，-20 ℃保存。處死時(shí)經(jīng)心臟取血2 mL，冰上靜置10 min，加入抗凝管，3000 r/min離心5 min，取上清液。尿素氮和肌酐由HI-TACHI7150A自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)，尿β2微球蛋白按照放射免疫試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 組織病理學(xué)染色

1.3.2.1 腎臟組織HE染色 腎組織以4%多聚甲醛固定，常規(guī)包埋、切片，做HE染色觀察腎組織病理變化，每張標(biāo)本低倍鏡下單盲依序觀察左上、右上、左下、右下、中間5個(gè)腎小管間質(zhì)視野，依據(jù)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤等8項(xiàng)指標(biāo)來觀察腎間質(zhì)病理改變并進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分[3]。

1.3.2.2 血管病變檢測(cè)及評(píng)分 腎臟組織HE染色，規(guī)定皮質(zhì)區(qū)的動(dòng)脈橫切面>5個(gè)，于光鏡下對(duì)不同的管徑動(dòng)脈實(shí)際橫斷面總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果動(dòng)脈管徑在30~100 μm，其中膜肌層未低于2層，則該動(dòng)脈屬于小動(dòng)脈；如果動(dòng)脈管徑<30 μm，同時(shí)平滑肌的細(xì)胞超過一層，則該動(dòng)脈屬于微動(dòng)脈。借由計(jì)算機(jī)輔助病理分析系統(tǒng)、顯微鏡的目鏡測(cè)微尺，對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜厚度、腎內(nèi)的小動(dòng)脈外徑、微動(dòng)脈的外徑、動(dòng)脈中膜的厚度、小動(dòng)脈的內(nèi)徑以及微動(dòng)脈的內(nèi)徑等進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。

參照Katafuchi等[4]的方法，腎間質(zhì)小血管病變按光鏡下的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)分為4型：（1）透明變性（Hyalinosis，HL）型：動(dòng)脈內(nèi)膜透明樣變或玻璃樣物質(zhì)沉積，可見彈力層分層，血管壁無壞死、無炎細(xì)胞浸潤，無血管內(nèi)膜增厚；（2）動(dòng)脈硬化（Arteriosclerosis，AS）型：動(dòng)脈血管內(nèi)膜增厚、管腔不同程度狹窄及彈力層分層，管壁無壞死，可伴有動(dòng)脈壁透明變性；（3）炎細(xì)胞浸潤（Celluar infil-tration， CI）型：血管壁炎細(xì)胞浸潤，可伴有管壁增厚、透明樣變，無管壁壞死、內(nèi)膜增厚；（4）纖維素變性壞死（Fibroid necrosis，F(xiàn)N）型：血管壁以纖維素樣變性和/或壞死為主要表現(xiàn)，可伴有管腔狹窄。

動(dòng)脈壁增厚的定義為：橫斷面腎內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)徑<1/2外徑。

腎動(dòng)脈病變的半定量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0：無損害；1：<25%；2：25%~50%；3：≥50%。

1.3.3 Real-time PCR檢測(cè)大鼠腎組織CTGF表達(dá)

1.3.3.1 組織總RNA的提取 按照用RNeasy Mini Kit試劑盒提取組織總RNA，抽提的總RNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD值，比值在1.9~2.0，取3 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳，可見5、18、28 s 3條清晰的RNA帶，提示RNA無污染和降解。

1.3.3.2 cDNA的合成 按照用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)操作。Real-time PCR的引物序列如下：β-actin上游5'-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3'，下游5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'；CTGF 上 游 5'-CCTGTGAAGCTGACCTAGAGGAAA-3'，下游5'-ACAGAACTTAGCCCGGTAGGTCTT-3'。

1.3.3.3 Real-time PCR檢測(cè) 在ABI 7900型熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，96孔板加樣，設(shè)計(jì)復(fù)孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Se-quence Detection System軟件分析各檢測(cè)樣本的Ct值（達(dá)到一定熒光閾值的循環(huán)數(shù)），計(jì)算2-△△Ct評(píng)價(jià)TGF-β及CTGF在腎組織中的表達(dá)水平。

1.3.4 Western Blot檢測(cè)腎組織CTGF蛋白表達(dá)

1.3.4.1 腎皮質(zhì)總蛋白質(zhì)的提取 取組織塊100 mg加入組織總蛋白提取液1 mL勻漿，冰上裂解30 min，4 ℃以12 000 r/min離心15 min，取上清，按Bio-rad蛋白定量試劑盒方法進(jìn)行蛋白定量，取80 μL上清加5×變性緩沖液20 μL混勻，100 ℃下變性10 min。

1.3.4.2 免疫印跡檢測(cè) 灌制10%的分離膠和4%的堆積膠，取總蛋白100 μg行上樣電泳，電泳結(jié)束后260 mA電轉(zhuǎn)印90 min至PVDF膜。封閉液（5%牛奶）搖床上封閉2 h，加入羊抗CTGF多克隆抗體（1∶200），4 ℃搖床過夜。洗膜后再加相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，加ECL液后顯影、定影，以β-actin為內(nèi)參照。將膠片掃描后，采用Quantity One軟件分析各條帶灰度值，將各目的條帶灰度值除以同一標(biāo)本內(nèi)參照β-actin條帶灰度值得到一比值，將該比值除以同一膠片上假手術(shù)組的比值作為該目的蛋白表達(dá)量的半定量結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓、血肌酐、尿素氮和尿β2微球蛋白（β2MG）水平比較 SHR血壓較WKY大鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)治療后，DG組大鼠血壓較NS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明DG無降壓作用。早期組治療后，DG組血肌酐、尿素氮和尿β2MG水平均較NS明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。晚期組治療后，DG尿β2MG與NS比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；DG組血肌酐、尿素氮與NS比較，有下降趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組大鼠治療前后各項(xiàng)指標(biāo)的比較（x-±s）

2.2 腎間質(zhì)纖維化和血管病變?cè)u(píng)分 SHR腎間質(zhì)損害及血管病變較WKY大鼠明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；經(jīng)治療后，DG組大鼠腎間質(zhì)損害及血管病變均較NS組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；早期組經(jīng)DG治療后，間質(zhì)纖維化和血管病變程度均較生理鹽水對(duì)照組明顯好轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），治療效果優(yōu)于晚期組，各組比較見表2。

2.3 各組大鼠治療前后腎組織CTGF mRNA和蛋白表達(dá) SHR腎組織CTGF mRNA和蛋白表達(dá)均較WKY大鼠明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；晚期組經(jīng)治療后，DG組大鼠腎間質(zhì)損害及血管病變均較NS組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；早期組經(jīng)DG治療后，間質(zhì)纖維化和血管病變程度均較NS組明顯好轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），治療效果優(yōu)于晚期組，見表2、圖1。

表2 各組大鼠治療前后腎間質(zhì)纖維化和血管病變?cè)u(píng)分比較（x-±s） 分

表3 各組大鼠治療前后CTGF mRNA和蛋白表達(dá)情況比較（x-±s）

圖1 各組大鼠治療前后腎組織CTGF mRNA和蛋白表達(dá)注：1：WKY大鼠；2：早期DG組；3：早期NS組；4：晚期DG粒組；5：晚期NS組

3 討論

高血壓腎損害主要表現(xiàn)為血管的損害和間質(zhì)纖維化，血管損害典型病理表現(xiàn)為腎小動(dòng)脈的肌內(nèi)膜肥厚和/或細(xì)小動(dòng)脈的玻璃樣變。高血壓造成的壓力改變，引起肌型小動(dòng)脈內(nèi)膜膠原纖維及彈力纖維增生，內(nèi)彈力膜分裂，中膜平滑肌細(xì)胞增生肥大，同時(shí)伴纖維組織增生，造成血管壁增厚，管腔狹窄。高血壓造成的細(xì)動(dòng)脈反復(fù)痙攣，內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮間隙擴(kuò)大，血漿蛋白滲入內(nèi)皮下間隙；同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)增多、平滑肌凋亡，最終管壁被上述物質(zhì)替代，發(fā)生細(xì)小動(dòng)脈玻璃樣變，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球及腎小管的缺血性改變，后期表現(xiàn)為腎小球廢棄性或固化性硬化，以及腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化。

CTGF是TGF-β1促纖維化作用的重要下游介質(zhì)，在人體心、腦、肺、肝、腎、肌肉、胎盤、結(jié)締組織中均有表達(dá)，可抑制細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）降解，促進(jìn)ECM生成、沉積，并可通過促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、增殖來誘導(dǎo)、刺激成纖維細(xì)胞活化、增殖[5-7]。CTGF在許多疾病的致纖維化作用中介導(dǎo)了TGF-β1的許多功能。但是TGF-β1的生物學(xué)作用廣泛，阻斷TGF-β1可能會(huì)影響重要功能而產(chǎn)生不良反應(yīng)，而對(duì)下游的因子，如CTGF阻斷和干預(yù)，則更具特異性。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯是一首來自金元時(shí)代李東垣《內(nèi)外傷辯惑論》的經(jīng)典益氣補(bǔ)血方劑，由黃芪和當(dāng)歸兩味藥以5：1比分組成。該方在配伍時(shí)重用黃芪大補(bǔ)脾腎之氣，以資氣血生化之源，配以當(dāng)歸苷辛而溫，養(yǎng)血和營，黃芪為君，當(dāng)歸為臣，目前臨床上多使用當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒。黃芪甲苷是黃芪的主要成分之一，是評(píng)價(jià)黃芪藥材質(zhì)量的優(yōu)劣標(biāo)準(zhǔn)，有抑制腎間質(zhì)纖維化的作用[8]；阿魏酸為非胍類內(nèi)皮素受體拮抗劑，是當(dāng)歸的主要有效成份之一，為其活血成分的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，阿魏酸具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、抗纖維化的作用。

黃芪當(dāng)歸配伍有明確的科學(xué)依據(jù)。黃芪甲苷難溶于水，生物利用度差，而阿魏酸能明顯促進(jìn)黃芪甲肝在大鼠十二指腸的吸收作用[9]。芪歸配比5：1組阿魏酸析出比例最高，大鼠免疫功能及抗炎能力改善影響最大[10-12]。

SHR的血壓升高是由多基因遺傳決定的，與人類高血壓病十分類似，SHR出生后血壓隨鼠齡不斷升高，3~4個(gè)月時(shí)為高血壓確立期，6個(gè)月時(shí)血壓升到最高水平，幼年SHR交感活性增高，隨血壓升高進(jìn)一步出現(xiàn)心、腦、腎等并發(fā)癥。本研究選用8周為SHR大鼠早期干預(yù)點(diǎn)，這時(shí)SHR血壓已開始升高但尚未出現(xiàn)明顯并發(fā)癥；選用12周為晚期干預(yù)點(diǎn)，這時(shí)SHR血壓已經(jīng)出現(xiàn)明顯升高，各種并發(fā)癥開始出現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒早期干預(yù)能明顯降低SHR血肌酐和尿素氮水平、減少尿β2MG水平，改善高血壓腎間質(zhì)纖維化程度和腎血管病變程度，當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒的這一作用與降低腎組織CTGF mRNA和蛋白表達(dá)相關(guān)，早期用藥效果優(yōu)于晚期；當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒對(duì)大鼠血壓無影響，說明當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒治療作用與血流動(dòng)力學(xué)無關(guān)。當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒能通過早期干預(yù)CTGF表達(dá)緩解高血壓腎損害腎血管病變和間質(zhì)纖維化水平。本研究為當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒在高血壓腎損害早期治療方面的臨床應(yīng)用提供了試驗(yàn)參考。

[1]陸忠明，戴小華.高血壓早期腎損害中醫(yī)研究進(jìn)展[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，33（1）：94-96.

[2]王欣彤，方祝元.中藥干預(yù)AngⅡ-AT1R-CTGF通路對(duì)高血壓早期腎損害影響的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41（7）：1546-1548.

[3] Radford G，Donadio J V， Bergstralh E J，et al. Predicting renal outcoming in IgA nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，1997，8（2）：199-207.

[4] Katafuchi R，Kiyoshi Y，Oh Y，et al.Glomerular score as a prognosticator in IgA nephropathy： its usefulness and limitation[J].Clin Nephro，1998，49（3）：1-8.

[5]藍(lán)健姿，嚴(yán)曉華，阮詩瑋，等.解毒通瘀復(fù)腎湯對(duì)慢性腎炎尿結(jié)締組織生長因子水平的影響[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，20（6）：13-16.

[6]車麗雙，黃榮桂.TGF-β1與CTGF在腎間質(zhì)纖維化中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（4）：624-625.

[7] Falke L L，Dendooven A，Leeuwis J W，et al.Hemizygous deletion of CTGF/CCN2 does not suffice to prevent fibrosis of the severely injured kidney[J].Matrix Biology，2012，31（7-8）：421-431.

[8]朱祎，唐英，何立群，等.黃芪甲苷對(duì)腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41（12）：2700-2702.

[9]易軍，鄭子鵬，汪勝.阿魏酸促進(jìn)黃芪甲苷在大鼠十二指腸吸收作用的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（3）：892-894.

[10]王文萍，王華偉，曹琦琛，等.黃芪當(dāng)歸不同配伍比例時(shí)阿魏酸含量比較研究[J].實(shí)用藥物與臨床，2008，11（6）：381-383.

[11]王文萍，曹琦琛，王華偉，等.黃芪當(dāng)歸不同配伍的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，14（6）：659-663.

[12]袁穎，郭忻，金泰安，等.黃芪當(dāng)歸配伍對(duì)氣虛血淤癥大鼠血流變學(xué)及血清干擾素-r、白介素-4的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（11）：44-47.