傳統細菌培養(yǎng)法、實時熒光PCR法在冷卻水中的比較*

袁展紅 周日東 吳燦權 劉綺明

軍團菌廣泛存在于各種天然和人工水環(huán)境中，其中嗜肺軍團菌是引起非典型肺炎的重要病原菌，具有極強的傳染性和較高的病死率，嚴重危害人類的健康和生命安全，已成為世界性的公共衛(wèi)生問題；嗜肺軍團菌在美國首次被發(fā)現，它主要是通過建筑物的水系統進行傳播，感染該菌后發(fā)病速度快，死亡率高，我國自1982年在南京首次證實軍團病以來，已有資料證實軍團菌污染冷卻水與軍團菌病的暴發(fā)密切相關[1]。2003年衛(wèi)生部《公共場所集中空調通風系統衛(wèi)生規(guī)范》中明確規(guī)定在空調冷卻水中不得檢出軍團菌[2]。冷卻水中軍團菌傳統實驗室檢測采用細菌培養(yǎng)、生化反應和血清學鑒定等方法，耗費時間長，易受水中雜質和其他微生物的干擾，檢測結果的時效性和準確性難以滿足疫情控制的需求，而實時熒光PCR法因其操作簡便、快速可靠、抗污染性強等優(yōu)點，已逐漸得到廣泛應用。本次研究就冷卻水中嗜肺軍團菌傳統細菌培養(yǎng)法和實時熒光PCR法檢測結果進行對比分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 主要儀器 Opticon 2實時熒光定量PCR儀（美國MJ Research公司），多功能智能厭氧系統（荷蘭MART公司），Microfic微檢過濾系統（美國Minipore公司）。

1.2 主要試劑 軍團菌診斷血清購自日本生研株式會社和天津生物芯片技術有限責任公司，GVPC、BCYE、BCYECyS瓊脂平板購自某公司，嗜肺軍團菌實時熒光PCR檢測試劑盒購自某公司，所有試劑均在有效期內使用。

1.3 水樣采集 抽取某市范圍的集中空調冷卻水，以滅菌玻璃瓶采集500 mL水樣，采樣后立即送實驗室當天檢驗。

1.4 方法

1.4.1 軍團菌的分離培養(yǎng)與鑒定 按照衛(wèi)生部《公共場所集中空調通風系統衛(wèi)生規(guī)范 附錄A》（2013）的要求進行軍團菌檢測[3]。

1.4.2 傳統細菌培養(yǎng)法 （1）水樣處理：將水樣預處理后通過孔徑0.45 μm濾膜過濾，取下濾膜置于滅菌水中，充分洗脫，備用。（2）熱處理：取1 mL洗脫樣品置50 ℃水浴加熱30 min。（3）酸處理：取2 mL洗脫樣品調pH至2.2搖勻放置5 min。（4）分離培養(yǎng)：將不處理和經處理的樣品各0.1 mL分別接種GVPC瓊脂平板，置于35~37 ℃、2.5% CO2培養(yǎng)1~10 d，每天觀察菌落生長情況。（5）軍團菌的鑒定：凡是在GVPC瓊脂平板上48 h后生長，菌落呈灰白色、圓形稍凸、邊緣整齊、表面光滑濕潤、毛玻璃狀，挑起似牙膏狀，可初步確定為可疑菌落[4]。挑取可疑菌落接種BCYE和BCYE-CyS瓊脂平板，35~37 ℃培養(yǎng)2 d，凡在BCYE瓊脂平板生長而在BCYE-Cys瓊脂平板不生長的菌落可初步認定為軍團菌，再通過革蘭氏染色涂片鏡檢、生化試驗、血清凝集試驗鑒定軍團菌。

1.4.3 實時熒光PCR測定 （1）樣品處理：取待測樣品1 mL加到1.5 mL無菌離心管中，8000 rpm離心5 min，棄上清，加入50 μL提取液，混勻后水浴5 min，13 000 rpm離心5 min，吸取上清液進行PCR檢測。（2）PCR擴增：反應體系為25 μL，包括DNA模板2 μL，PCR反應液22.5 μL，混合酶液0.5 μL[5]。反應條件設為第1步：37 ℃ 5 min，95 ℃3 min，1 個循環(huán)；第 2 步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40 個循環(huán)。FAM通道采集熒光信號。（3）結果判定：熒光定量PCR檢測圖見圖1，熒光定量PCR檢測以Ct值<37且擴增曲線呈S型為陽性判定原則，其中，樣本檢測結果Ct值<35，且曲線有明顯的指數增長期，可直接判定為陽性；若樣本檢測結果Ct值35~37值，需重復檢測，若兩次實驗均得到良好的S型擴增曲線則應判定為陽性[6]。

圖1 熒光定量PCR檢測圖

1.5 統計學處理 使用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理，計量資料采用（x-±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 培養(yǎng)法和實時熒光PCR法檢測結果 64份冷卻水通過培養(yǎng)法檢出嗜肺軍團菌8株，陽性率為12.50%，同時有14株有可疑菌落生長，通過實時熒光PCR法做進一步鑒定。對培養(yǎng)法分離出的8株嗜肺軍團菌和14株有可疑菌株進行實時熒光PCR鑒定時，結果顯示22株均為嗜肺軍團菌陽性，陽性率為34.38%，兩種檢測方法差異有統計學意義（ 字2=9.389，P<0.05）。

2.2 軍團菌血清型分布 分離的22株嗜肺軍團菌中，血清型分布以LP1為主，占菌株總數的68.18%（15/22），其次是LP3占菌株總數的13.64%（3/22），LP5和LP8各2株，LP6 1株。其中一份樣品同時存在2種血清型（LP5和LP6）。

3 討論

目前，軍團菌已知有52個種，70多種血清型，能引起人類疾病的有20多種[7-8]。嗜肺軍團菌是引起軍團菌病的重要病原體，已發(fā)現15種血清型[9]。軍團菌檢測方法主要有分離培養(yǎng)法、免疫學檢測法和分子生物學檢測法。培養(yǎng)法是水軍團菌檢測標準方法，軍團菌生長條件苛刻，要求特殊培養(yǎng)基，生長速度緩慢，活的不可培養(yǎng)軍團菌的存在以及其他菌種在培養(yǎng)基上的過度生長影響培養(yǎng)法的檢測結果，對實驗人員的技術要求比較高，不能作快速鑒定。利用實時熒光PCR法檢測環(huán)境樣品中嗜肺軍團菌，檢測時間快，但PCR檢測程序沒有標準化，容易受樣品中和前處理PCR抑制劑，核酸擴增過程中引物和探針選擇等因素影響，產生一定假陰性和假陽性[10]。

將培養(yǎng)法分離的陽性菌株及可疑陽性菌株用實時熒光PCR法予以驗證，結果均為陽性，隨著培養(yǎng)基配方的改進，樣品前處理技術的發(fā)展，培養(yǎng)法分離軍團菌的靈敏度有所提高。朱兵清等[11-12]研究表明，在BCYE-a培養(yǎng)基中添加合適的抗生素可有效抑制環(huán)境水樣中的雜菌，提高嗜肺軍團菌的分離率。培養(yǎng)法具有不可替代的優(yōu)點，如發(fā)現新菌種等[13]。隨著實時熒光PCR技術的不斷發(fā)展，檢測方法敏感性和特異性會相應提高。培養(yǎng)法和實時熒光PCR技術的聯合應用，將對軍團菌污染早期預警具有重要作用。

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