赤芍顆粒劑對泛耐藥鮑曼不動桿菌的抗菌活性研究*

王康椿 譚俊青 李藹文

泛耐藥鮑曼不動桿菌為一種革蘭氏陰性，氧化酶陰性的非發(fā)酵桿菌，是臨床上常見的條件致病菌之一，在一定的條件下，容易引起機(jī)體感染，如呼吸道感染、傷口感染等，據(jù)金茜等[1]的報(bào)道，碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌是當(dāng)前在全球醫(yī)院內(nèi)傳播的主要感染性疾病的致病菌之一。由于臨床上抗生素的廣發(fā)使用，加上該細(xì)菌具有多種耐藥機(jī)制，因此，較容易導(dǎo)致耐藥基因的產(chǎn)生，出現(xiàn)多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動桿菌，這給臨床上治療該菌感染帶來了棘手的問題[2]，其耐藥機(jī)制有多重，包括ESBLS、金屬酶、AMPc酶、氨基糖苷修飾酶等[3]。中國是一個(gè)傳統(tǒng)中草藥大國，有豐富的中藥資源，有研究表明許多中藥有抑菌作用，其常見的有抑菌作用的中藥飲片有赤芍、黃連、黃芩、五倍子、五味子、烏梅、連翹、大黃、黃柏、金銀花等[4]。赤芍為毛莨科植物芍藥的干燥根，性微寒、味苦，具有清熱涼血、散瘀止痛功效，臨床上常用于對腸瘋下血、自汗盜汗、目赤腫痛、腹痛、脅痛等癥，有較好的治療效果[5]。2005年武新華等[6]研究赤芍等中藥飲片對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、和傷寒桿菌等體外抗菌活性的研究證實(shí)赤芍有抗菌活性性。中藥顆粒劑又稱為中藥免煎劑，是經(jīng)過現(xiàn)代制藥技術(shù)，將中藥材的藥效成分，經(jīng)過提取、分離、濃縮、制粒等過程，制備成的中藥顆粒劑，其優(yōu)點(diǎn)是不必煎煮、直接沖服等，因其方便，在臨床上已應(yīng)用得越來越廣泛。因此，筆者研究赤芍顆粒對泛耐藥鮑曼不動桿菌的抗菌活性，為臨床該菌感染性疾病治療探索。

1 材料與方法

1.1 藥品配制 赤芍顆粒劑由廣東省第二中醫(yī)院藥房提供，批號：20140205。生理鹽水由鄭州永和制藥有限公司提供，批號：201405。

1.1.1 菌株來源 泛耐藥鮑曼不動桿菌50株，其中試驗(yàn)菌株48株和2株標(biāo)準(zhǔn)菌株，來源于廣東省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室2013年1月-2014年6月對臨床致病菌培養(yǎng)中分離、鑒定、藥敏試驗(yàn)后，其結(jié)果顯示為泛耐藥鮑曼不動桿菌。質(zhì)控菌株：鮑曼不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606，大腸埃希菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，綠膿桿菌ATCC27853，來源于廣東省臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 儀器與試劑 法國梅里埃公司VITEK2全自動細(xì)菌鑒定儀、恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱、CO2恒溫培養(yǎng)箱。血培養(yǎng)平板、巧克力培養(yǎng)平板、水解絡(luò)蛋白培養(yǎng)基（MH培養(yǎng)基）均由廣州迪景微生物公司生產(chǎn)，ATB細(xì)菌鑒定及藥敏卡均由法國梅里埃公司生產(chǎn)，無菌生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 鮑曼不動桿菌液配制 將保存在-70 ℃冰箱內(nèi)臨床常規(guī)標(biāo)本分離中收集的50株泛耐藥鮑曼不動桿菌取出室溫（冰箱溫度控制，要求每天觀察1次溫度變化，以保證溫度在要求范圍之內(nèi)），用無菌小鑷子夾起菌種保存珠將細(xì)菌轉(zhuǎn)種到血液營養(yǎng)培養(yǎng)基上，進(jìn)行分區(qū)劃線轉(zhuǎn)種，然后放置在37 ℃培養(yǎng)18 h后，取出培養(yǎng)基，觀察細(xì)菌生長情況，以第四區(qū)分離出單個(gè)菌落為轉(zhuǎn)中成功，然后用無菌棉簽挑起單個(gè)菌落，放在3 mL用無菌生理鹽水中，用專用麥?zhǔn)媳葷醿x，以生理鹽水調(diào)零，將其調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊木簜溆?，該菌濃度相?dāng)于1.5×109/L[7]。

1.2.2 赤芍顆粒劑溶液稀釋 試驗(yàn)時(shí)赤芍顆粒劑的終濃度為：1024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL；用分析天平準(zhǔn)確稱取赤芍顆粒劑適量（相當(dāng)于中藥飲片約10.24 g），將其溶解在100 mL的肉湯中，置于高壓蒸汽中滅菌，完成后冷卻，使其成為0.1024 g/mL的赤芍顆粒原液，在使其稀釋成為10.24 mg/mL的應(yīng)用液，在將其依次稀釋為終濃度的10倍[8]。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 將上述配制好的各濃度赤芍顆粒溶液分別用無菌加樣槍準(zhǔn)確加入10 μL到相應(yīng)的無菌96孔微量板的相應(yīng)孔中，共有50組不同濃度稀釋后的藥物，然后將50株配制好的菌液各取90 μL，接種到96孔微量板的相應(yīng)孔中，其中各組的第一列加入營養(yǎng)肉湯，不加藥物，作為各組的陽性對照，和最后一列不加菌液作為空白對照。每孔總量為100 μL。加樣完畢后，將其放入35 ℃恒溫低速震蕩培養(yǎng)箱（50 r/min）培養(yǎng) 18 h[9]。

1.2.4 測定方法 將放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后的微量板取出，在生物安全柜的日光燈下肉眼觀察各組微量孔細(xì)菌的生長情況，以每微量板的每孔用細(xì)菌渾濁生長判斷為有菌生長，以沒空液體澄清則判斷為無菌生長，再與陽性對照孔和空白孔比較，判斷微量各組藥物對該菌的體外抑菌情況，然后以各組無菌生長的最低藥物濃度定位該組細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）；然后再用無菌加樣槍吸取10 μL無明顯細(xì)菌生長的培養(yǎng)液接種在血平板培養(yǎng)基上，放入37 ℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察各組培養(yǎng)液在血平板上細(xì)菌生長情況，以無菌生長的最低藥物濃度作為該菌株的最低殺菌濃度（MBC）。再將微量板用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值（OD值），波長為450 nm[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，計(jì)量資料以（±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

18 h培養(yǎng)后，觀察各組陽性對照孔全部有細(xì)菌生長，各組空白對照孔菌無細(xì)菌生長，表明該組試驗(yàn)符合要求，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

不同濃度的赤芍顆粒溶液對泛耐藥鮑曼不動桿菌的OD值均小于陽性對照孔的OD值，并且隨著藥物濃度的增加，OD值也越來越小。OD值和赤芍顆粒溶液抑菌作用成反比，表明赤芍顆粒溶液均有抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，其抑菌作用越強(qiáng)。對不同濃度的赤芍顆粒溶液的抑菌作用的OD值進(jìn)行單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=289.154，P<0.05）。與空白對照孔比較，試驗(yàn)菌株對赤芍顆粒溶液的最低抑菌濃度為64~128 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)菌株的最低抑菌濃度為128 μg/mL，表明赤芍顆粒對泛耐藥鮑曼不動菌的生長能起到耐藥的作用，見表1。

表1 50株泛耐藥鮑曼不動桿菌在不同濃度的赤芍顆粒劑溶液中的OD值

3 討論

隨著臨床上耐藥菌株出現(xiàn)的越來越廣泛，陳詠君等[11]對91例鮑曼不動桿菌的臨床分布特點(diǎn)的研究表明，該菌主要發(fā)生在抵抗力較低的人群，如ICU病房的患者、較長時(shí)間臥床患者、癌癥患者、糖尿病患者等，這部分人群在感染前均有長期在醫(yī)院治療的經(jīng)歷，而且大部分是呼吸道感染為主，并且導(dǎo)致能夠有效治療感染性疾病的抗生素漸漸減少，引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，因此，規(guī)范用藥和研究新的治療方法成了當(dāng)務(wù)之急。雖然傳統(tǒng)中藥材的抗菌機(jī)制目前尚沒有系統(tǒng)的理論依據(jù)，的文獻(xiàn)報(bào)道中的多種試驗(yàn)已經(jīng)證明，多種中藥材在體外抑菌試驗(yàn)中能夠有明顯的抑菌作用，如左國營等[12]研究47種中草藥提取物體外抗菌活性的篩選試驗(yàn)證明得到證明。而泛耐藥鮑曼不動桿菌是臨床上僅次于銅綠假單胞菌的條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力弱時(shí)，極易引起感染性疾病，且具有多種耐藥基因，臨床上常用的治療方法為頭孢哌酮舒巴坦聯(lián)合米諾環(huán)素治療，但隨著耐藥基因逐漸產(chǎn)生，效果漸漸欠佳[13]。雖然抗生素是治療感染性疾病的有效手段，但每種新的抗生素產(chǎn)生之后，很快地細(xì)菌將會產(chǎn)生相應(yīng)的耐藥基因，但新的抗生素研發(fā)有落后于耐藥基因產(chǎn)生的跡象，而中藥有報(bào)道對細(xì)菌有明顯的抑制作用，并且中藥具有其他抗生素不具有的功效（如清熱解毒、祛邪、調(diào)節(jié)免疫力等）[14]。有研究證明，黃芩、五味子、黃蓮粉針劑等中藥對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等有抑制作用[15]。為此，結(jié)合中藥和抗生素的優(yōu)點(diǎn)，聯(lián)合使用治療感染性疾病具有廣闊前景。在此筆者選用赤芍顆粒劑能夠抑制泛耐藥鮑曼不動菌桿生長的結(jié)果表明，赤芍顆粒劑可以作為一種潛在的新藥物或藥物增效劑用于泛耐藥鮑曼不動桿菌的感染。

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