人羊膜勻漿上清液對脂多糖致傷的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞增殖及分泌炎癥因子的影響

陳云鵬 王 磊 童亞林 劉 亮 呂 璐 莫永亮 詹 球 陽齊瓊 梁 靜 朱富軍 龔震宇 辛海明

(1.廣西師范大學(xué)研究生培養(yǎng)基地暨解放軍第一八一醫(yī)院燒傷整形科， 廣西 桂林 541002；2.解放軍第一八一醫(yī)院燒傷整形科， 廣西 桂林 541002； 3.解放軍第一八一醫(yī)院實驗研究中心、廣州軍區(qū)燒傷整形中心實驗室， 廣西 桂林 541002)

·論 著·

人羊膜勻漿上清液對脂多糖致傷的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞增殖及分泌炎癥因子的影響

陳云鵬1王 磊1童亞林2劉 亮3呂 璐1莫永亮1詹 球3陽齊瓊3梁 靜3朱富軍2龔震宇2辛海明2

(1.廣西師范大學(xué)研究生培養(yǎng)基地暨解放軍第一八一醫(yī)院燒傷整形科， 廣西 桂林 541002；2.解放軍第一八一醫(yī)院燒傷整形科， 廣西 桂林 541002； 3.解放軍第一八一醫(yī)院實驗研究中心、廣州軍區(qū)燒傷整形中心實驗室， 廣西 桂林 541002)

目的：探討人羊膜勻漿上清液(hAHS)對脂多糖(LPS)致傷的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(RPMVECs)增殖及其分泌促炎因子的影響。方法：用新鮮人羊膜制備hAHS，用考馬斯亮藍法和ELISA法分別測定hAHS中總蛋白和表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白介素-4(IL-4)、IL-10、血管生成素-1(Ang-1)、人β-防御素2(HBD2)的含量。MTT法檢測不同體積分?jǐn)?shù)hAHS(0、10%、15%、20%、25%)作用于RPMVECs后細胞增殖活性的變化，確定hAHS促進RPMVECs增殖的最佳濃度。根據(jù)共培養(yǎng)條件不同，將RPMVECs隨機分為4組：N組(10%FBS+DMEM/F12)，A組(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS)，B組(10%FBS+DMEM/F12+LPS)和C組(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS+LPS)。各組細胞在干預(yù)后0、12、24、48、72 h用MTT法測定吸光度值(A值)，并分別于培養(yǎng)6、8、10、12、24 h時用ELISA法測定RPMVECs培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-8的含量。結(jié)果：hAHS中總蛋白濃度為(725.125±12.625)mg/L，其中EGF、bFGF、VEGF、IL-4、IL-10、Ang-1、HBD2的濃度分別為(504.785±4.665)、(4.426±0.138)、(0.185±0.006)、(25.650±4.104)、(13.733±2.197)、(15.561±0.496)和(4.763±0.714)ng/L。hAHS的體積分?jǐn)?shù)在10%～20%時均具有促進RPMVECs增殖的作用且以15%hAHS培養(yǎng)后第7、9天的增殖率最佳，而25%hAHS在第7、9、11天使RPMVECs增殖率小于0%hAHS組(P<0.05)。A組48和72 h細胞增殖活性較N組顯著增加，B組24、48和72 h的增殖活性較N組顯著降低；C組24、48和72h的增殖活性較B組顯著升高(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示，B組各時間點的IL-6和TNF-α的含量以及8、10、12和24 h的IL-8含量均顯著高于N組(P<0.05)；C組10和12 h的IL-6含量，8、10、12和24 h的IL-8含量及各時間點的TNF-α含量均顯著低于B組(P<0.05)。結(jié)論：hAHS含有促進組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、降低血管通透性及殺傷致病微生物的多種生長因子、細胞因子，對LPS致傷的RPMVECs增殖具有促進作用，并減少致傷后炎癥因子分泌。

人羊膜勻漿上清液 大鼠 肺微血管內(nèi)皮細胞 脂多糖 細胞增殖 肺損傷，急性

肺部革蘭陰性(G-)菌感染是臨床上嚴(yán)重?zé)齻绕浜喜⒅囟任胄該p傷氣管切開患者最常見的并發(fā)癥，G-菌壁上的主要成分脂多糖(LPS)通過損傷肺微血管內(nèi)皮細胞引起肺血管通透性增加并導(dǎo)致急性肺損傷(ALI)。有關(guān)應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)治療ALI的研究結(jié)果表明，MSCs通過旁分泌多種細胞因子參與損傷細胞的修復(fù)、減輕炎癥反應(yīng)等是其治療ALI的作用機制之一[1-2]。人羊膜的上皮細胞與間充質(zhì)干細胞同樣具有干細胞特性，可向3個胚層分化并能分泌具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子。本實驗中采用LPS致大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(RPMVECs)損傷模型，觀察人羊膜勻漿上清液(hAHS)對LPS損傷后RPMVECs增殖及分泌炎癥因子的影響，報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人羊膜組織來源于本院婦產(chǎn)科產(chǎn)婦，均簽署了知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。選取產(chǎn)前檢查人類免疫缺陷病毒、乙肝病毒、丙肝病毒及梅毒病毒均為陰性產(chǎn)婦的足月齡胎膜6個，產(chǎn)后立即將胎膜放入無菌生理鹽水中。SD大鼠RPMVECs細胞株(購于武漢原生原代(PriCells)生物醫(yī)藥科技有限公司)，錐蟲藍(美國Amresco公司)，LPS(美國Sigma公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(北京Thermo生物化學(xué)制品有限公司)，胰蛋白酶(安徽合肥博美生物科技有限公司)，甲基噻唑基四唑(MTT，Sigma-Aldrich中國有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，上海偉進生物科技有限公司)；人表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素1(Ang-1)、IL-4、IL-10和人β-防御素2(HBD2) ELISA試劑盒,大鼠TNF-α、IL-6和IL-8 ELISA試劑盒(美國R&D公司)。紫外可見光分光光度計(UV-3100，Mapada公司)；96孔培養(yǎng)板(Corning Incorporated公司)；酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)； 0.02 μm細菌過濾器(Millex-GP公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人羊膜制備及其勻漿上清液的提取 按文獻[3]的方法，胎膜用無菌生理鹽水洗凈殘留的血塊后放入抗生素溶液(50 mg/L青霉素、50 mg/L鏈霉素和2.5 mg/L兩性霉素B)中浸泡10 min。浸泡過程中，通過羊膜與絨毛膜間的間隙鈍性分離獲取羊膜。獲取的羊膜用PBS漂洗3次，按文獻[4]方法在羊膜上隨機取一小部分，錐蟲藍直染法鑒定其細胞活力。選取細胞活力大于95%的人羊膜剩余部分，用眼科剪剪成約1 mm×1 mm碎片，混和均勻后分成兩份。一份按1:1的體積加入無血清的DMEM/F12，然后按照本課題組的方法[5]制備成含DMEM/F12的hAHS，用于細胞培養(yǎng)實驗。另一份人羊膜處理方法同上，但以PBS代替DMEM/F12，制成含PBS的hAHS，用于hAHS中總蛋白以及細胞因子濃度檢測。將制得的hAHS經(jīng)細菌過濾器過濾后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.2.2 hAHS中總蛋白及不同因子濃度的測定 取含PBS的hAHS，hAHS中蛋白濃度采用考馬斯亮藍G-250試劑盒測定。hAHS中EGF、bFGF、VEGF、Ang-1、IL-4、IL-10、HBD2的濃度測定采用ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書步驟操作。

1.2.3 RPMVECs增殖率的測定 用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)原代RPMVECs，傳至第2代，以1×104個/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，根據(jù)hAHS在培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)不同(0、10%、15%、20%、25%)分為5組，分別與含相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)hAHS的培養(yǎng)基孵育，每組設(shè)10個孔。孵育24 h后棄培養(yǎng)液，隔天換液。在孵育后第0、1、3、5、7、9、11天采用MTT法檢測每孔的吸光度(A)值。檢測時每孔加入MTT 20 μl，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加150 μl DMSO，37 ℃振蕩孵育10 min，酶標(biāo)儀測A630值。測定結(jié)果取平均值，繪制RPMVECs生長曲線，計算細胞增殖率：細胞增殖率=[(實驗組A值-0%hAHS組A值)/0%hAHS組A值]×100%。

1.2.4 LPS致傷的RPMVECs細胞增殖活性測定 取培養(yǎng)的第1代RPMVECs，隨機分為4組：N組(10%FBS+DMEM/F12)，A組(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS)，B組(10%FBS+DMEM/F12+LPS)和C組(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS+LPS)。以4×104個/ml密度將RPMVECs接種于96孔板中，每孔200 μl，按照實驗分組更換為相應(yīng)培養(yǎng)基，LPS濃度40 μg/ml，用DMEM/F12溶解。0、12、24、48、72 h后棄去，每孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)放置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄液，每孔加入DMSO 150 μl，37 ℃振蕩孵育15 min，酶標(biāo)儀測定A630值。1.2.5 LPS致傷的RPMVEC炎癥因子分泌的測定 取培養(yǎng)的第1代SD大鼠RPMVECs，待細胞生長融合至80%后消化并制成細胞懸液，以4×104/mL密度接種于96孔板中，每孔200 μl，分組同1.2.4。在更換為相應(yīng)培養(yǎng)基6、8、10、12、24 h后收集各組細胞培養(yǎng)液。按照ELISA試劑盒說明檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

2 結(jié) 果

2.1 hAHS中總蛋白及各細胞因子濃度 hAHS中蛋白質(zhì)的濃度為(725.125±12.625)mg/L，EGF、bFGF、VEGF、Ang-1、IL-4、IL-10、HBD2的濃度分別為(504.785±4.665)ng/L，(4.426±0.138)ng/L，(0.185±0.006)ng/L，(15.561±0.496)ng/L，(25.650±4.104)ng/L，(13.733±2.197)ng/L，(4.763±0.714)ng/L。

2.2 不同體積分?jǐn)?shù)的hAHS對RPMVEC增殖活性和增殖率的影響

2.2.1 增殖活性的變化 各組A值在第1、3、5、7天均明顯高于前一次檢測結(jié)果(P<0.05)，在第11天明顯低于第9天(P<0.05)。10%hAHS組A值在第7、9、11天明顯大于0%hAHS組(P<0.05)。15%hAHS組A值在第5、7、9、11天明顯大于0%hAHS組(P<0.05)。25%hAHS組A值在第7、9、11天明顯小于0%hAHS組(P<0.05)。見表1。

2.2.2 細胞增殖率的變化 10%hAHS組僅第7天、15%hAHS組在第5、7天增殖率明顯大于0%hAHS組(P<0.05)。20%hAHS組在第9天、25%hAHS組在第7、9、11天的增殖率均明顯小于0%hAHS組(P<0.05)。各組其他時間增殖率與0%hAHS組相同時間點相比，差異無顯著性(P>0.05,表2)。

hAHS體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)時間(d)13579110%0.034±0.004*Δ0.048±0.006*Δ0.165±0.019*Δ0.650±0.113*Δ0.706±0.115*0.534±0.099*Δ10%0.035±0.007*Δ0.050±0.008*Δ0.171±0.018*Δ0.816±0.107*Δ#0.883±0.147*#0.703±0.098*Δ#15%0.035±0.005*Δ0.049±0.006*Δ0.188±0.025*Δ#0.894±0.158*Δ#0.965±0.172*#0.748±0.129*Δ#20%0.034±0.003*Δ0.049±0.006*Δ0.174±0.022*Δ0.750±0.132*Δ0.791±0.117*0.598±0.098*Δ25%0.035±0.006*0.049±0.008*0.164±0.031*0.545±0.097*Δ0.583±0.106*#0.326±0.059*Δ#

注：含0%hAHS培養(yǎng)基培養(yǎng)0 d時A值為0.027±0.006；與0%hAHS培養(yǎng)0 d比較；*P<0.05；與本組前一時間點比較：ΔP<0.05；與0%hAHS組相應(yīng)時間點比較；#P<0.05;hAHS體積分?jǐn)?shù)為0%組的標(biāo)本數(shù)為40孔，其余各組標(biāo)本數(shù)均為10孔。

hAHS體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)時間(d)13579110%0.285±0.0520.400±0.0822.438±0.4282.936±0.5680.086±0.013-0.244±0.03610%0.315±0.0620.425±0.0842.410±0.4653.785±0.679*0.083±0.011-0.204±0.02815%0.300±0.0600.412±0.0912.837±0.511*3.755±0.681*0.079±0.012-0.225±0.03020%0.289±0.0510.425±0.0922.557±0.5033.302±0.5820.055±0.010*-0.244±0.03025%0.307±0.0550.404±0.1232.341±0.3082.323±0.311*0.070±0.008*-0.442±0.058*

注：與0%hAHS組相同時間點比較：*P<0.05；hAHS體積分?jǐn)?shù)為0%組的標(biāo)本數(shù)為40孔，其余各組均為10孔

2.3 hAHS對LPS致傷的SD大鼠RPMVECs細胞活性的影響 MTT結(jié)果顯示，A組在第48、72 h的A值高于對照N組，B組從第24 h開始A值低于對照N組，且一直持續(xù)至72 h，C組從第24 h開始A值高于B組，且一直持續(xù)至72 h，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

組別標(biāo)本數(shù)(孔)培養(yǎng)時間(h)012244872N組36A組6B組6C組60.118±0.022———0.118±0.0210.126±0.0220.138±0.0250.175±0.0290.118±0.0240.132±0.0240.179±0.032*0.222±0.039*0.107±0.0190.102±0.017*0.099±0.016*0.101±0.017*0.122±0.0230.128±0.021Δ0.137±0.024Δ0.152±0.028Δ

注：與N組相同時間點比較：*P<0.05；與B組相同時間點比較：ΔP<0.05

2.4 hAHS對LPS致傷的RPMVECs分泌炎癥因子影響

2.4.1 IL-6 B組在各時間點IL-6的含量高于對照N組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。C組各時間點IL-6的含量低于B組，但僅于10、12 h時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4)。

2.4.2 IL-8 B組在8、10、12、24 h時IL-8的含量顯著高于對照N組(P<0.05)。C組在8、10、12、24 h時IL-8的含量顯著低于實驗B組(P<0.05，表5)。

組別標(biāo)本數(shù)(孔)培養(yǎng)時間(h)68101224N組317.921±2.15118.517±2.21218.539±2.22519.878±2.38520.011±2.521A組319.854±2.58221.888±2.72720.326±2.43920.824±2.49922.814±2.738B組324.556±2.947*28.328±3.499*30.742±3.329*40.573±3.309*27.292±3.275*C組321.888±2.62723.400±2.86820.732±2.608Δ20.812±2.617Δ21.554±2.706

注：與N組相同時間點比較：*P<0.05；與B組相同時間點比較：ΔP<0.05

組別標(biāo)本數(shù)(孔)培養(yǎng)時間(h)68101224N組376.625±9.961076.138±10.028076.925±10.103075.925±9.870075.675±9.838A組374.425±9.675076.925±9.986075.533±9.819079.675±10.358076.425±9.935B組399.175±12.893113.515±13.067*115.225±14.979*123.675±14.908*111.325±14.472*C組385.675±11.138079.175±10.293Δ078.635±10.223Δ076.785±9.982Δ00074.5±9.685Δ

注：與N組相同時間點比較：*P<0.05；與B組相同時間點比較：ΔP<0.05

2.4.3 TNF-α B組在各時間點TNF-α的含量顯著高于對照N組(P<0.05)。C組在各時間點TNF-α的含量顯著低于B組(P<0.05，表6)。

組別標(biāo)本數(shù)(孔)培養(yǎng)時間(h)68101224N組3113.265±16.998114.115±17.117114.751±17.213115.324±17.299114.754±17.213A組3125.357±18.804124.286±18.643123.905±18.586122.310±18.346124.381±18.657B組3181.421±27.213*183.886±27.583*189.982±28.497*198.525±28.579*187.482±28.122*C組3126.476±19.971Δ127.224±19.084Δ128.714±19.307Δ130.476±19.571Δ129.667±19.475Δ

注：與N組相同時間點比較：*P<0.05；與B組相同時間點比較：ΔP<0.05

3 討 論

LPS是引起ALI常見因素之一，它通過直接與間接方式損傷RPMVECs和肺泡細胞，并以血管通透性增加、肺水腫作為最主要的特征性病理生理改變。隨著對干細胞治療ALI機制的深入研究，干細胞歸巢到肺損傷處的旁分泌作用逐漸為大家所關(guān)注[6]。研究指出，干細胞通過旁分泌的具有多種生物學(xué)作用的細胞因子參與了ALI的治療，如調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與炎癥過程的促炎因子(IL-6、TNF-α)、抑炎因子(IL-4、IL-10)[7]、趨化因子(IL-8、CCL2、CCL4、CCL5、CCL20、CX3C亞族和CXC亞族)[8]等，促進細胞生長增殖與組織修復(fù)的EGF、bFGF、VEG等[9]，減輕RPMVECs損傷及通透性作用的Ang-1、KGF等[10]，具有一定抗病原菌作用的HBD2與抗菌多肽LL-37等[11]。與MSCs等干細胞相比，人羊膜干細胞具有弱抗原性、無悖倫理并可大量無創(chuàng)獲取的優(yōu)勢[12]。Hodges等[13]已證實人羊膜上皮細胞可減輕呼吸機相關(guān)性肺損傷并可分化為肺泡細胞，并應(yīng)用人羊膜干細胞開展了防治博來霉素致肺纖維化的研究。Tan等[14]發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細胞可通過減少肺部巨噬細胞遷移和促進巨噬細胞由M1向M2轉(zhuǎn)型來減輕肺損傷。本課題組開展的hAHS對大鼠許旺細胞增殖作用研究結(jié)果證實，在hAHS中也含有多種促進細胞增殖的生長因子，并證明hAHS在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯促進大鼠許旺細胞增殖的作用。因此我們推測hAHS也能減輕LPS所致RPMVECs損傷，促進其增殖，并與MSCs一樣可能也在ALI的防治方面發(fā)揮作用。

我們在hAHS中檢測出了具有促進細胞生長作用的EGF、bFGF、VEGF，并發(fā)現(xiàn)hAHS對體外培養(yǎng)的RPMVECs增殖具有促進作用，且以體積濃度為15%的hAHS作用效果最好，而體積分?jǐn)?shù)為25%濃度時hAHS出現(xiàn)明顯抑制RPMVECs增殖現(xiàn)象。我們又觀察了15%hAHS對LPS損傷的RPMVEC增殖的影響，結(jié)果顯示，LPS與RPMVECs共培養(yǎng)后，LPS能明顯抑制RPMVECs的增殖，加入hAHS后可減輕LPS對RPMVECs的損傷、促進其增殖，說明hAHS具有促進正常及LPS致傷的RPMVECs增殖的作用，hAHS分泌的EGF、bFGF、VEGF等多種生長因子可能是其發(fā)揮作用的主要細胞因子之一。本研究結(jié)果為應(yīng)用hAHS促進RPMVECs的損傷修復(fù)提供了依據(jù)。

LPS刺激RPMVEC分泌的TNF-α、IL-8和IL-6均是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子，而最為研究者關(guān)注的是其在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程中所具有的促炎作用，這些促炎因子通過活化免疫細胞并趨向損傷處集聚，參與包括RPMVECs與肺泡細胞在內(nèi)的其他組織細胞損傷與凋亡，并作為刺激因素又進一步促進多種細胞表達并分泌細胞因子，促進、放大并導(dǎo)致失控的炎癥反應(yīng)，其中TNF-α是一種最強烈的早期致炎因子。本實驗中，B組IL-6、TNF-α的含量在各觀察點均高于對照N組(P<0.05)，IL-8的含量在8、10、12、24 h高于對照N組(P<0.05)，說明在LPS的刺激下RPMVECs分泌的炎癥細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α含量增多，而當(dāng)加入hAHS后(C組),受LPS刺激的RPMVECs分泌上述炎癥細胞因子量在不同觀察點降低，提示hAHS對RPMVECs受到LPS刺激后分泌上述促炎因子具有抑制作用。

IL-4是一種多向免疫調(diào)節(jié)因子，能夠降低LPS激活的內(nèi)皮細胞促炎因子IL-6、TNF-α的表達[15]，IL-10具有較強的抗炎與免疫調(diào)節(jié)活性，對LPS引起的炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用[16]；HBD2是一種陽離子抗菌肽，對多種病原微生物(包括G+菌、G-菌、真菌等)均有強烈的直接殺傷作用，還能與LPS中和，且不會誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生[17]；Ang-1具有抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡[18]并通過增加內(nèi)皮細胞之間連接的緊密性達到降低血管通透性的作用[19]。本研究結(jié)果顯示hAHS中也含有IL-4、IL-10、HBD2、Ang-1等細胞因子，提示hAHS可能具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與炎癥過程、減輕RPMVECs損傷并降低其通透性以及殺傷病原微生物的作用。

綜上實驗結(jié)果顯示：①hAHS含有促進組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)強度、降低血管通透性及殺傷致病微生物的多種生長因子、細胞因子；②hAHS可減少LPS致傷后RPMVECs分泌炎癥因子TNF-α、IL-8和IL-6分泌，并促進LPS致傷后RPMVECs增殖。因此，理論上人羊膜干細胞與MSCs一樣具有治療LPS致ALI的潛在作用，但其確切療效及其作用機制還需通過體內(nèi)實驗證實。

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Effect of supernatant of human amnion homogenate on lipopolysaccharide induced pulmonary microvascular endothelial cells injury and their proliferation and expression of proinflammatory factors in rats

Chen Yunpeng*, Wang Lei, Tong Yalin, Liu Liang, Lü Lu, Mo Yongliang,Zhan Qiu, Yang Qiqiong, Liang Jing,Zhu Fujun,Gong Zhenyu, Xin Haiming.*

Base of Postgraduate Education of Guangxi Normal University; Department of Burn & Plastic Surgery,the 181st Hospital of PLA,Guilin 541002, Guangxi, China

Tong Yalin(E-mail: 1526680889@qq.com)

Objective:To investigate the protective effect of supernatant of human amnion homogenate (hAHS) on proliferation and expression of proinflammatory mediators by lipopolysaccharide (LPS) induced injured pulmonary microvascular endothelial cells of rats (RPMVECs).Methods：hAHS was prepared from fresh human amnion. The total protein content and the content of epithelial growth factor (EGF)，basic fibroblast growth factor (bFGF)，vascular endothelial growth factor (VEGF)， interleukin-4 (IL-4)， IL-10， angiogenin-1 (Ang-1)，human β-defensin2 (HBD2) of hAHS were determined with Coomassie blue staining and ELISA. The effect of 0, 10%, 15%, 20%, 25% hAHS on cell proliferation activity of RPMVECs was respectively determined with MTT assay，in order to determine the optimal concentration of hAHS on promoting RPMVECs proliferation. According to different co-culture conditions, RPMVECs were randomly divided into 4 groups：group N (cultured with 10%FBS+DMEM/F12)，group A(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS)，group B (10%FBS+DMEM/F12+LPS),and group C (10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS+LPS). At 0， 12， 24， 48，72 hours after culturing with the corresponding medium of each group，optical density values (Avalues) of each group were determined respectively with MTT assay to determine the proliferation activity， and the contents of IL-6，IL-8，TNF-α levels in the culture supernates were also determined by ELISA at 6， 8， 10， 12 and 24 hours. Results: The total protein concentration of hAHS was (725.125±12.625) mg/L, and levels of EGF, bFGF, VEGF, IL-4, IL-10, Ang-1, HDB2 were respectively(504.785±4.665)ng/L,(4.426±0.138)ng/L,(0.185±0.006)ng/L，(25.650±4.104)ng/L,(13.733±2.197)ng/L,(15.561±0.496)ng/L,(4.763±0.714)ng/L.10%-20% hAHS was shown to promote proliferation of RPMVECs, and 15% hAHS, and the best result was observed on 7 and 9 days. The proliferation rate of RPMVECs in 25% hAHS group at 7, 9 and 11 days was lower than those in the 0%hAHS group (P<0.05).The proliferation activity (Avalue ) of group A was greater than that of group N at 48 and 72 hours, and it was lower in group B significantly as compared with that of group N at 24,48 and 72 hours (P<0.05), while it was significantly higher in group C compared with that of the group B at 24, 48 and 72 hours (P<0.05). ELISA result showed that the contents of IL-6 and TNF-α in group B were higher than those of group N(P<0.05). IL-8 levels of group B at 8, 10, 12 and 24 hours were higher than those of group N (P<0.05). In group C, the level of IL-6 was significantly lower than that of group B at 10 and 12 hours, IL-8 level at 8, 10, 12 and 24 hours (P<0.05), and TNF-α content at each time point (P<0.05).Conclusion: hAHS are rich in factors which can promote tissues repair, regulate immune response, reduce vascular permibility, promote hAHS on LPS induced injury of the proliferation of RPMVECs after being injured by LPS, and reduce the secretion of inflammatory cytokines after injury by LPS challenge.

Supernatant of human amnion homogenate Rat Pulmonary microvascular endothelial cells Lipopolisaccharide Cell proliferation Acute lung injury

10.3969/j.issn.1672-8521.2015.01.004

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81301634)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(1140003A-39)；廣西自然科學(xué)基金(2011GXNSFB018107，2013GXNSFBA019203)；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題(Z2014532)

童亞林，主任醫(yī)師(E-mail:1526680889@qq.com)

2015-01-16)

作者貢獻：本研究的實驗設(shè)計、實驗實施、數(shù)據(jù)處理及論文撰寫為陳云鵬和王磊共同完成，為共同第一作者。