改良CT掃描及CT尿路成像在大鼠膀胱癌動物模型活體檢測中的價值

許天源，朱照偉，夏磊磊，王先進(jìn)，秦 亮，張 祥，沈周俊

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海 200025）

膀胱癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中居于首位。動物模型是體內(nèi)研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移、化療抵抗機理及新型治療方法的主要途徑，其中使用亞硝基類致癌劑是誘發(fā)原位膀胱腫瘤的重要膀胱癌動物建模手段［1］。由于原位膀胱腫瘤生長在肉眼不可直視的膀胱腔內(nèi)，因此活體檢測對動物模型的評價具有重要意義。我們曾在國內(nèi)首次報道了膀胱癌大鼠的活體CT檢測方法，對評判建模效果具有良好的指導(dǎo)價值［2］。盡管如此，這種單純CT平掃的成像對比度欠佳，且實驗動物目標(biāo)較小，檢測靈敏度有待提升。此外CT作為一種平面成像手段，無法提供直觀、精準(zhǔn)的病灶定位和形態(tài)信息。CT尿路成像（CT urography，CTU）作為臨床上一種高效的膀胱癌影像學(xué)診斷技術(shù)，彌補了上述缺點，值得在動物實驗中參考。有鑒于此，本課題組提出了一種改良的膀胱癌大鼠CT檢測方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了CTU三維重建，取得了很好的檢測效果?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 造模試劑N－甲基－N－亞硝脲（MNU）（2g瓶裝混合物，純度50%）購自美國Sigma公司。枸櫞酸緩沖液的配置：枸櫞酸4.2g，氫氧化鈉2.1g，加經(jīng)高壓滅菌的去離子240mL水振搖溶解，用5mol／L濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，再加去離子水至250mL搖勻，分裝、密封后4℃保存。將緩沖液50mL注入MNU瓶中，配置成濃度20mg／mL的MNU溶液，3mL分裝后置于－80℃冰箱保存。CT掃描用InveonmicroPET／CT顯像儀（西門子公司，德國），檢測中使用碘造影劑歐乃派克（通用電氣藥業(yè)上海有限公司，中國）。

1.2 實驗動物及模型構(gòu)建 建模動物選用10～12周齡無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級雌性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley，SD）大鼠，體重190～220g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)研究中心飼養(yǎng)［SCXK（滬）2011－0113］。飼養(yǎng)條件：SPF級獨立盒籠系統(tǒng)，常規(guī)飲食，12h晝夜節(jié)律，濕度50%～60%，溫度24～27℃。整個實驗過程，按照實驗動物3R原則對大鼠給予人道的關(guān)懷，方案經(jīng)實驗動物倫理委員會審核通過。

取大鼠30只隨機分為兩組，對照組（A組）10只，造模組（B組）20只。A組以枸櫞酸鈉緩沖液0.1 mL每2周膀胱灌注1次，共4次：每次給藥前2%50 mg／kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，仰臥固定并消毒會陰，取潔凈硬脊膜外麻醉導(dǎo)管（直徑1mm，長度6 cm），石蠟油潤滑后經(jīng)尿道置管，尿液流出提示插入膀胱；抽盡膀胱尿液并注入枸櫞酸鈉緩沖液0.1mL（注射器推至盡頭后拔出、抽吸少量空氣，再連接導(dǎo)管將導(dǎo)管中的殘余液體全部注入大鼠膀胱），拔除導(dǎo)尿管后粗絲線扎住尿道外口，大鼠平臥2h解除絲線等待麻醉清醒。B組以A組同法經(jīng)膀胱灌注配置好的MNU溶液0.1mL（2mg）。兩組大鼠誘癌期結(jié)束后均常規(guī)飼養(yǎng)，觀察大鼠一般情況。

1.3 改良的CT及CTU檢測 活體檢測在14周時進(jìn)行。我們在既往大鼠CT檢測［2］的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對方法做了改良：大鼠麻醉后經(jīng)自制導(dǎo)尿管注入1～1.5mL歐乃派克稀釋液（100mg／mL）使膀胱充盈，隨后固定在CT機上。CT掃描層厚1.5mm，橫軸位、矢狀位、冠狀位均進(jìn)行掃描。利用上述數(shù)據(jù)，進(jìn)一步通過多平面重建、最大密度投影、曲面重建和容積再現(xiàn)等技術(shù)，對大鼠的下尿路進(jìn)行CTU三維重建。

1.4 病理組織學(xué)分析 活體檢測后（14周末）處死所有大鼠，肉眼觀察膀胱成瘤情況；取新鮮膀胱組織，10%甲醛溶液固定24h，脫水，石蠟包埋，切片4～5 μm，HE染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料采用s進(jìn)行統(tǒng)計描述。組間比較計量資料采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 實驗中，A組大鼠1只因首次膀胱灌注時麻醉過量死亡。B組大鼠死亡2只，1只因首次膀胱灌注時麻醉過量死亡，1只于第6周時死亡，尸體解剖可見腎膿腫形成。兩組大鼠平均初始體重相近［（205±10）g vs.（207±11）g］；整個實驗過程中大鼠活動正常，14周時A組存活大鼠平均體重略高于B組［（319±15）g vs.（308±21）g］，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B組大部分大鼠于第7周后陸續(xù)出現(xiàn)肉眼血尿。

2.2 建模效果與病理組織學(xué)特征 14周末處死所有存活大鼠。肉眼下A組大鼠均未見成瘤，膀胱黏膜光滑、壁薄、厚度均勻、血管紋理清晰。B組大鼠成瘤17只（94%），膀胱腫瘤呈米粒樣、乳頭狀、菜花狀或團塊狀，膀胱壁可見不同程度的增厚；部分大鼠伴膀胱結(jié)石及輸尿管積水。所有大鼠均未見肝腎、淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。

兩組大鼠的肉眼及鏡下典型組織病理特征如圖1所示。A組大鼠膀胱黏膜均為3～4層移行上皮細(xì)胞組成，細(xì)胞大小均一，排列有序，核圓；B組大鼠成瘤病理類型均為尿路上皮癌，膀胱腫瘤細(xì)胞大小不一，層次明顯增多，細(xì)胞排列紊亂，極性消失，核畸形，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，常堆積于核膜下，核漿比例大，可見不同程度的核分裂像。

2.3 大鼠CT檢測結(jié)果 改良的CT成像如圖2所示，膀胱腔內(nèi)含碘的歐乃派克稀釋液呈高信號，與周圍中低信號的膀胱壁及腫瘤組織對比鮮明。正常大鼠膀胱內(nèi)腔呈橢圓形高密度影，邊界清晰光整，周圍膀胱壁厚薄均一；膀胱癌大鼠可見乳頭狀、團塊狀等大小不等的低信號隆起凸向膀胱腔形成充盈缺損，膀胱壁厚薄不均，局部可見增厚。利用該方法成瘤大鼠全部檢出，檢出率100%。

2.4 大鼠CTU檢測結(jié)果 利用CT掃描數(shù)據(jù)，我們進(jìn)一步進(jìn)行了大鼠膀胱CTU三維重建（圖2）：正常膀胱呈光滑的橢球形，左右輸尿管及下方尿道均顯影清晰；膀胱新生物表現(xiàn)為橢球表面大小不同、形狀各異的凹陷，邊界、位置清晰。

圖1 兩組大鼠膀胱的肉眼及鏡下組織病理學(xué)特征

圖2 兩組大鼠CT及CTU圖像

3 討 論

化學(xué)致癌法用于原位膀胱癌建模有以下優(yōu)勢：①尿路上皮選擇性；②周期短、誘癌率高；③與人類膀胱癌發(fā)生的自然規(guī)律和病理類型相似；④實驗動物要求低［3］。因此該方法在膀胱癌研究中應(yīng)用廣泛，其中MNU為代表的亞硝基類化合物最為常用。MNU是直接致癌劑，通過鳥嘌呤烷化引起DNA損傷誘發(fā)膀胱腫瘤，需經(jīng)尿道膀胱灌注給藥，適用于雌性大、小鼠。既往研究采用相同給藥方法，膀胱灌注3周出現(xiàn)不典型增生，6～7周出現(xiàn)原位癌，9周可見癌性腫塊，12～14周為膀胱乳頭狀癌或浸潤性癌［4－5］。本研究與上述報道一致，14周時大鼠成瘤率94%，鏡下新生物為尿路上皮癌，部分腫瘤見肌層浸潤，病理特征與人膀胱癌相似?？梢奙NU誘導(dǎo)大鼠膀胱癌是一種可靠、高效的建模方法。

由于MNU需經(jīng)膀胱灌注給藥，規(guī)范化操作對保證建模效果特別重要。實驗組非腫瘤因素死亡2例，分別為首次麻醉過量和逆行尿路感染引起的腎膿腫。為了減少意外致死，給藥時須注意控制麻醉劑量、防止大鼠窒息；術(shù)前器械滅菌、會陰部消毒以減少尿路感染；術(shù)中導(dǎo)尿管置入不宜過深，避免粗暴操作損傷尿路；還可經(jīng)飲水給予大鼠抗生素，不僅可預(yù)防感染及膀胱結(jié)石，還減少了非尿路上皮腫瘤的發(fā)生［6］。另一方面，為了提高成瘤率、減少大鼠成瘤的異質(zhì)性，也應(yīng)保證麻醉深度、輕柔置管以減少膀胱收縮，同時術(shù)后牢固結(jié)扎尿道外口，防止MNU溶液漏出；術(shù)前6～8h禁水有利于提高膀胱內(nèi)MNU的濃度。

由于動物模型建立后常需繼續(xù)體內(nèi)實驗，因此需要非處死的實驗動物活體檢測方法來確定建模效果。對于大鼠原位膀胱癌模型，有以下幾種可能的方法：下腹部觸診極為簡便，但這種方法不能評判膀胱腫瘤的具體情況，且只有質(zhì)量超過200mg的新生物可被觸及，并不可靠［7］；麻醉解剖觀察后再縫合，該方法創(chuàng)傷較大，容易導(dǎo)致感染、腫瘤種植甚至致死，對腫瘤特征和后續(xù)研究結(jié)果也可能產(chǎn)生影響；尿脫落細(xì)胞檢測無創(chuàng)簡便，但陽性率過低［8］；核磁共振也可以用于檢測大鼠膀胱腫瘤，但較為昂貴，與CT等方法相比并無明顯優(yōu)勢［9］；既往研究還利用SPECT顯像進(jìn)行活體檢測，但該方法具有放射性，且耗時較長［5］。我們曾首次報道了CT對大鼠原位膀胱癌檢測的價值，該方法直接方便、準(zhǔn)確靈敏［2］。盡管小動物CT有較好的檢出率，但平掃下膀胱壁及腫瘤組織呈等密度或低密度，與腔內(nèi)生理鹽水暗區(qū)對比并不十分明顯，對微小病變（0～2mm）的識別效果不能保證。為此我們進(jìn)一步改良，提出了CT平掃聯(lián)合碘造影劑膀胱灌注的新方法，大鼠膀胱內(nèi)腔呈高密度影，與周圍膀胱新生物及正常組織對比鮮明，腫瘤邊界、位置清晰。這種方法一定程度上彌補了小動物CT空間分辨率低、層厚不足的缺陷，更有利于發(fā)現(xiàn)膀胱微小病變（直徑1mm的顆粒樣腫塊），大鼠膀胱癌檢出率高達(dá)100%，還可利用影像進(jìn)行腫瘤負(fù)荷定量評價。

事實上，本研究中改良CT的鑒定方法與臨床CTU檢查極為相似。CTU基于圖像三維重建技術(shù)，正逐步取代傳統(tǒng)靜脈尿路造影受到醫(yī)生的青睞。本研究中，我們將復(fù)雜的靜脈注射造影劑改良為膀胱灌注給藥，CT尿路三維重建效果與臨床CTU相似，由此提出了一種“小動物CTU”檢測方法。通過圖像處理軟件，可以去除多余骨骼、肌肉及臟器疊影，并對三維圖像進(jìn)行任意旋轉(zhuǎn)，包括輸尿管下段、膀胱及尿道在內(nèi)的大鼠下尿路得到立體呈現(xiàn)；在腫瘤檢出方面，CTU彌補了二維平面成像的不足，實現(xiàn)了病灶形態(tài)與位置的精確描述，腫瘤負(fù)荷也可得到計算。與CT相比，這種方法更為全面和直觀，有利于膀胱癌動態(tài)生長和治療效果的連續(xù)觀測；若今后需開展上尿路或尿道原位腫瘤的動物實驗，CTU無疑更具活體檢測價值。

［1］PAN Y，LAVELLE J，BASTACKY S，et al.Detection of tumorigenesis in rat bladders with optical coherence tomography［J］.Med Phys，2001，28（12）：2432－2440.

［2］唐小瑩，潘春武，孫俊，等.大鼠原位膀胱癌模型的建立與CT診斷價值［J］.中國實驗動物學(xué)報，2010，18（1）：6－8.

［3］DING J，XU D，PAN C，et al.Current animal models of bladder cancer：awareness of translatability［J］.Exp Ther Med，2014，8（3）：691－699.

［4］吳志平，石家齊，由慧娟，等.N－甲基亞硝基脲誘導(dǎo)大鼠膀胱腫瘤動物模型的實驗研究［J］.貴州醫(yī)藥，2012，36（3）：205－208.

［5］楊玉成，侯建全，周守軍，等.MNU誘導(dǎo)的大白鼠膀胱腫瘤模型的建立及病理學(xué)動態(tài)觀察［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2006，26（1）：41－43，54.

［6］CHO J，HOLLEY J.Squamous cell carcinoma of the bladder in a female associated with multiple bladder stones［J］.BMC Res Notes，2013，6：354.

［7］GUNTHER J，F(xiàn)RAMBACH M，DEINERT I，et al.Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer（MB49）［J］.J Urol，1999，161：1702－1706.

［8］錢立新，劉訓(xùn)良，丁鴻，等.N－甲基亞硝基脲誘導(dǎo)大鼠膀胱腫瘤作用的動態(tài)觀察［J］.中華實驗外科雜志，2004，21（5）：563－564.

［9］那彥群，葉章群，孫穎浩，等.膀胱癌診斷治療指南［S］.中國泌尿外科疾病診斷治療指南手冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：25.