液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜檢測染毒動物血漿中沙林和梭曼酪氨酸加合物

于惠蘭，裴承新，胡 真，劉石磊，向 宇

(1.國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室, 北京 102205；2.防化研究院, 北京 102205)

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液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜檢測染毒動物血漿中沙林和梭曼酪氨酸加合物

于惠蘭1,2，裴承新1,2，胡 真2，劉石磊1,2，向 宇2

(1.國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室, 北京 102205；2.防化研究院, 北京 102205)

為了追溯性檢測神經(jīng)性毒劑沙林(GB)和梭曼(GD)暴露染毒，以染毒白蛋白上的特異性加合位點-411位酪氨酸加合物為重要生物標志物，建立了高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(LC/Q-TOF MS)分析動物血液中神經(jīng)性毒劑GB和GD酪氨酸加合物的檢測方法。在采用不同樣品處理和儀器條件的基礎(chǔ)上，確定了最佳實驗條件。血液經(jīng)離心后，取50 μL分離的血漿加入到50 μL 10 g/L鏈霉蛋白酶的NH4HCO3(50 mmol/L)水溶液中，于37 ℃孵育2.5 h，用0.5 mL 10 ku超濾管以16 000 r/min離心15 min，LC/Q-TOF MS電噴霧正離子模式分析濾液。應(yīng)用本方法進行GB半致死劑量(LD50)動物施毒實驗，在施毒的動物血樣中檢測到膦?；野彼峒雍衔?，證明了該方法快速、簡單、可靠。

生物標志物；神經(jīng)性毒劑；沙林(GB)；梭曼(GD)；血漿；酪氨酸加合物；液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(LC/Q-TOF MS)

自第一次世界大戰(zhàn)以來，化學毒劑(chemical warfare agents，CWAs)作為大規(guī)模殺傷性武器被多次使用，其中，神經(jīng)性毒劑的毒性、殺傷力最強，可在μg/kg劑量范圍內(nèi)造成死亡。典型的神經(jīng)性毒劑有G類和V類兩種，G類毒劑的代表是沙林(GB)和梭曼(GD)，而V類毒劑的代表是維?？怂?VX)，其結(jié)構(gòu)式示于圖1。

圖1 典型的神經(jīng)性毒劑的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of typical nerve agents

多年來，禁止化學武器公約組織(OPCW)一直計劃將生物醫(yī)學樣品的分析納入化學武器核查指定的實驗室分析網(wǎng)絡(luò)。與環(huán)境基質(zhì)樣品相比，毒劑在生物體內(nèi)存在的時間較長，具有較強的溯源性，因此，對生物醫(yī)學樣品的分析檢測可以提供生物體接觸神經(jīng)性毒劑的明確證據(jù)。雖然白蛋白和毒劑的結(jié)合常數(shù)遠小于膽堿酯酶與神經(jīng)性毒劑的結(jié)合常數(shù)[1-5]，但是生物體內(nèi)白蛋白的濃度是膽堿酯酶濃度的1 000倍，同時白蛋白與毒劑加合物具有較長的半衰期，P—O官能團上的烷基不容易脫去，即不易發(fā)生衰變，是一類溯源性較強的生物標志物，有助于明確鑒定染毒的神經(jīng)性毒劑種類[1-6]。

目前，在生物醫(yī)學樣品分析中，液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)是首選技術(shù)[7-16]，主要原因是相對于氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)技術(shù)而言，LC/MS分析的是生物標志物本身，樣品不用衍生等處理步驟，加快了分析進程，減少了試劑對生物標志物的干擾，而GC/MS是通過還原反應(yīng)將染毒生成的加合物和(或)代謝物重新還原成毒劑原體[17-19]進行分析，不能明確鑒定每一種生物標志物。LC/MS通常采用液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(LC/Q-TOF MS)和液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-QQQ MS)兩種技術(shù)。LC/Q-TOF MS是一種四極桿和飛行時間質(zhì)譜相結(jié)合的具有高分辨功能(質(zhì)量數(shù)精確到小數(shù)點后第3位)的技術(shù)，對于未知的生物標志物，可以獲得MS/MS碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，排除樣品中可能的共流出基質(zhì)干擾物對生物標志物的干擾，降低化學噪音，從而提高定性結(jié)果的可靠性。LC-QQQ MS技術(shù)主要是對已知化合物進行分析，屬于單位質(zhì)量分辨質(zhì)譜技術(shù)，采用儀器中的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)對化合物進行鑒定，靈敏度比LC/Q-TOF MS高。

為了能夠鑒定未知的生物標志物，本研究采用LC/Q-TOF MS技術(shù)檢測經(jīng)鏈霉蛋白酶酶解后的GB和GD染毒的動物血漿中生物標志物——膦?；野彼峒雍衔?，并通過活體動物GB施毒實驗驗證，以期建立適合染毒生物醫(yī)學樣品的高通量分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與器材

Agilent HPLC 1200/6520 Q-TOF高效液相色譜/四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；SPE固相萃取儀：日本GL Sciences 公司產(chǎn)品；Anke TGL-16G離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；HB-202 Thermo cell恒溫金屬浴槽：杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；10 ku超濾管：美國Millipore公司產(chǎn)品；移液槍：北京吉爾森公司產(chǎn)品；ProteoExtract?白蛋白去除試劑盒：德國Merk公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

乙腈(HPLC級)：美國J&K公司產(chǎn)品；純凈水：杭州娃哈哈公司產(chǎn)品；甲酸(LC/MS級)：美國Agilent公司產(chǎn)品；白蛋白結(jié)合緩沖液(250 mmol/L磷酸鈉，pH 7.4)、白蛋白去除緩沖液(25 mmol/L磷酸鈉，pH 8，2 mol/L NaCl)、碳酸氫銨(純度98%)：均為比利時Acros公司產(chǎn)品；鏈霉蛋白酶：瑞士Roche公司產(chǎn)品；乙二胺四乙酸鈉(EDTA，分析純)：北京化工廠產(chǎn)品。

1.3 血液與GB和GD孵育及酶解

1.3.1 血液與GB和GD孵育 從若干只比格狗和大耳白兔靜脈各取1 mL全血，置于含一定量乙二胺四乙酸的5 mL塑料離心管中，加入一定量的GB、GD乙腈溶液，在37 ℃孵化，輕輕晃動，2.5 h后取出，以16 000 r/min離心3 min，將染毒全血分離成紅細胞和血漿，取出一定量血漿，剩余部分于-20 ℃下冷凍，備用。

1.3.2 鏈霉蛋白酶酶解血漿 取50 μL染毒血漿，加入等體積的50 mmol/L NH4HCO3水溶液稀釋，然后再加入50 μL 10 g/L鏈霉蛋白酶的NH4HCO3水溶液，于37 ℃孵化2.5 h，用0.5 mL 10 ku超濾管以16 000 r/min高速離心15 min，用100 μL移液槍取出試管中的小分子液體置于裝有200 μL內(nèi)襯管的自動進樣器小瓶中，供LC/MS分析。

1.4 液相色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent zorbax Eclipse plus C18柱(2.1 mm×150 mm×5 μm)；流動相：水(0.05% 甲酸)(A)-乙腈(B)體系；梯度條件：5%B(0～2 min)—50%B(2.5 min)—100%B(6～12 min)—5%B(13～17 min)；流速0.25 mL/min；進樣體積5 μL；柱溫30 ℃。

電離方式：電噴霧(ESI)離子源；正離子掃描；全掃描方式，小分子掃描范圍m/z50～1 000，大分子掃描范圍m/z50～3 000，掃描時間0.77 s，分辨率大于10 000；毛細管電壓3.5 kV；氣體溫度350 ℃；干燥氣(氮氣)流速8 L/min；霧化氣(氮氣)壓力2.07×105Pa；碎裂電壓150 V；MS/MS碰撞能量20 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

為了避免毒劑的水解與醇解，將毒劑配制在乙腈中，部分實驗采用乙腈作為沉淀劑進行樣品處理，為了保證溶劑的一致性，選擇乙腈和水作為流動相，在不同的梯度條件下洗脫，其洗脫條件列于表1。實驗發(fā)現(xiàn)，乙腈含量高，目標加合物的信噪比高，即檢測靈敏度高；但是由于血漿樣品比較復雜，如果乙腈含量過高，有可能使雜質(zhì)等干擾物和目標物分離不完全。經(jīng)實驗驗證，采用梯度洗脫條件4，在分析時間較短的情況下，能夠保證加合物與干擾物有很好的分離，且靈敏度較高，因此最佳的梯度洗脫條件為條件4。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

為了使目標物獲得較高的響應(yīng)值，對質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化。采用高分辨ESI正離子模式，m/z50～1 000的全掃描模式掃描，有效地提高了目標化合物信號的信噪比。由于檢測的是超痕量目標化合物，考慮到靈敏度，所以優(yōu)化了采集質(zhì)譜圖的頻率(1.1、1.3、1.5 spectra/s)。由于采用的水相比例較大，為了最大限度的降低質(zhì)譜信號中的噪音，優(yōu)化了干燥氣流量(5、8、10 L/min)、噴霧壓力(1.38×105、2.07×105、2.76×105Pa)、干燥氣流溫度(250、300、350 ℃)、毛細管電壓(3.2、3.5 kV)和碎裂電壓(100、120、150 V)等5個主要指標。最終確定最佳質(zhì)譜條件為：干燥氣流量8 L/min，噴霧壓力2.07×105Pa，干燥氣流溫度350 ℃，ESI+毛細管電壓3.5 kV，碎裂電壓150 V，采集譜圖的頻率1.3 spectra/s。

表1 GB和GD染毒酪氨酸加合物的梯度洗脫條件

2.3 白蛋白分離

采用白蛋白去除試劑盒分離純化白蛋白。首先取180 μL分離的血漿，采用10倍結(jié)合緩沖劑稀釋樣品，即將180 μL血漿加入到180 μL 10倍結(jié)合緩沖劑中，然后加入1 440 μL高純水。白蛋白試劑盒的處理方法為：采用高純水將適當?shù)?0倍白蛋白結(jié)合緩沖液稀釋成1倍結(jié)合緩沖劑，將6～10 mL 1倍結(jié)合緩沖劑用一次性注射器以0.1 mL/min的流速注入白蛋白去除小柱，用來平衡小柱，去除小柱內(nèi)的空氣；將稀釋的樣品用新的注射器以每5秒2滴的流速注入平衡后的小柱，使樣品中的白蛋白與小柱上的鍵合相充分結(jié)合；用2 mL 1倍結(jié)合緩沖劑淋洗小柱，用新的一次性注射器取2 mL白蛋白去除緩沖劑，以0.1 mL/min的流速洗脫小柱上的白蛋白，收集流出液；將收集的流出液用10 ku超濾管以16 000 r/min超濾10 min，去除其中的小分子，用高純水淋洗樣品3次，分別以16 000 r/min超濾10 min，去除緩沖劑。留在超濾管中濃縮的大分子樣品共計150 μL，用200 μL移液槍取出置于帶有200 μL內(nèi)襯管的自動進樣器小瓶中，備用。

與直接將血漿酶解的方法比較，白蛋白去除試劑盒樣品處理方法比較復雜，所得的染毒白蛋白分子質(zhì)量與未染毒分子質(zhì)量沒有明顯的偏差，酶解后檢測到的酪氨酸加合物與血漿直接酶解方法檢測到的酪氨酸加合物基本一致，因此可采用直接將血漿酶解超濾后分析。

2.4 LC/MS分析

經(jīng)鏈霉蛋白酶消解后的GB染毒血樣，通過LC/MS和LC-MS/MS鑒定得到膦?；野彼峒雍衔颩eP(O)(OiPr)-Tyr，經(jīng)LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)譜圖中有m/z97甲基膦酸特征峰。鏈霉蛋白酶消解的未染毒樣品、GB染毒樣品和標樣的ESI+-MS提取離子色譜圖(EIC)及標樣的MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖2。按照同樣方法分析鏈霉蛋白酶消解的未染毒樣品、GD染毒樣品和標樣的ESI+-MS EIC圖及標樣的MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜圖，示于圖3。

注：a. 空白；b. 樣品；c. 標樣；d. GB酪氨酸加合物標樣圖2 GB染毒膦?；野彼峒雍衔锏腅SI+-MS EIC圖及標樣的ESI+-MS/MS圖Fig.2 ESI+-MS EIC and MS/MS spectrum of phosphylated tyrosine adduct exposure to GB

2.5 LC-MS/MS譜圖解析

對于GB染毒膦酰化酪氨酸加合物，MS譜圖中基峰為準分子離子峰[M+H]+m/z302.116 2，計算的元素組成為C13H21NPO5；MS/MS質(zhì)譜圖中基峰為m/z214.063 0，計算的元素組成為C9H13NPO3。其他碎片離子為m/z260.068 7、197.036 2、136.075 3、118.065 0、97.005 8，碰撞電壓20 V，幾乎不見準分子離子峰。在一定電壓下，異丙基官能團容易脫去，形成m/z260.068 7碎片離子，計算的元素組成為C10H15NPO5；進一步失去酪氨酸上的羧基，形成m/z214.063 0碎片離子；同時質(zhì)譜圖中的m/z197.036 2碎片離子是由m/z214.063 0碎片離子失去NH3形成的，計算的元素組成為C9H10PO3；m/z136.075 3計算的元素組成為C8H10NO；m/z118.065 0計算的元素組成為C8H8N；其中甲基膦酸特征峰m/z97.005 8計算的元素組成為CH5PO3，其裂解途徑示于圖4。對于GD染毒膦?；野彼峒雍衔?，MS譜圖中基峰為m/z260.069 1碎片離子，m/z366.144 7是[M+Na]+峰。在一定碰撞電壓下，GD染毒膦?；倌軋F很快衰變，P—O官能團上的頻哪基很容易脫去，與文獻報道一致[8,10]，其余裂解規(guī)律同GB染毒膦?；野彼峒雍衔?。

2.6 動物染毒實驗應(yīng)用研究

選取3只(2.5±0.05)kg大耳白兔，分別靜脈注射半致死劑量的新鮮配制的GB20%乙醇水溶液。注射后，大耳白兔均有全身震顫、呼吸困難、瞳孔縮小等神經(jīng)性毒劑中毒癥狀，3只白兔的染毒劑量分別為20、22、22 μg/kg。在染毒1 h、3 h、6 h、1 d、2 d、5 d和8 d共7個時間段，分別抽取靜脈血，分析血漿中是否含有白蛋白膦?；野彼峒雍衔铩嶒灡砻?，在兔染毒5 d內(nèi)，沒有檢測到GB與酪氨酸加合物，但在兔染毒8 d后，抽取的3個血樣樣品中均發(fā)現(xiàn)了少量的膦?；野彼幔銭SI+-MS EIS圖示于圖5。

注：a. 空白；b. 樣品；c. 標樣；d. GD酪氨酸加合物標樣圖3 GD染毒膦?；野彼峒雍衔锏腅SI+-MS EIC圖及標樣的ESI+-MS/MS圖Fig.3 ESI+-MS EIC and MS/MS spectrum of phosphylated tyrosine adduct exposure to GD

圖4 GB膦?；野彼峒雍衔锏腅SI+-MS/MS質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 ESI+-MS/MS fragmentation pathway of phosphylated tyrosine adduct exposure to GB

注：a. 空白; b. 1#兔; c. 2#兔; d. 3#兔; e. 沙林酪氨酸加合物標樣圖5 GB染毒樣品中膦?；野彼岬腅SI+-MS EIC圖Fig.5 ESI+-MS EIC of phosphylated tyrosine adduct exposure to GB in rabbit plasma

3 結(jié)論

通過白蛋白提取、純化和鏈霉蛋白酶酶解等樣品處理方法，建立了神經(jīng)性毒劑GB和GD染毒白蛋白生物標志物——膦?；野彼岬腖C/Q-TOF MS和MS/MS定性方法，經(jīng)GB染毒動物活體實驗驗證，該方法具有普適性，是一種較理想的神經(jīng)性毒劑染毒溯源性檢測方法。

[1] FIDDER A, NOORT D, HULST A G, et al. Retrospective detection of exposure to organophosphorus anti-choline sterases: Mass spectrometric analysis of phosphylated human butyrylcholinesterase[J]. Chem Res Toxicol, 2002, 15(4): 582-590.

[2] NOORT D, FIDDER A, van der SCHANS M J, et al. Verification of exposure to organophosphates: Generic mass spectrometric method for detection of human butyrylcholinesterase adducts[J]. Anal Chem, 2006, 78(18): 6 640-6 644.

[3] TSUGE K, SETO Y. Detection of human butyrylcholinesterase nerve gas adducts by liquid chromatography-mass spectrometric analysis after in gel chymotrytic digestion[J]. J Chromatogr B, 2006, 838(1): 21-30.

[4] SUN J C, LYNN B C. Development of a MALDI-TOF-MS method to identify and quantify butyrylcholinesterase inhibition resulting from exposure to organophosphate and carbamate pesticides[J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2007, 18(4): 698-706.

[5] LI H, SCHOPFER L M, NACHON F, et al. Aging pathways for organophosphate-inhibited human butyrylcholinesterase, including novel pathways for isomalathion, resolved by mass spectrometry[J]. Toxicol Sci, 2007, 100 (1): 136-145.

[6] BLACK R M. History and perspectives of bioanalytical methods for chemical warfare agent detection[J]. Journal of Chromatography B, 2010, 878(17/18): 1 207-1 215.

[7] BLACK R M, HARRISOM J M, READ R W. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: The identification of a novel phosphylation site[J]. Arch Toxicol, 1999, 73(2): 123-126.

[8] PEEPLES E S, SCHOPFER L M, DUYSEN E G. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant exposure, identified by mass spectrometry[J]. Toxicol Sci, 2005, 83(2): 303-312.

[9] LI B, SCHOPFER L M, HINRICHS S H, et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry assay for organophosphorus toxicants bound to human albumin at Tyr411[J]. Anal Biochem, 2007, 361(2): 263-272.

[10]WILLIAMS NH, HARRISON J M, READ R W, et al. Phosphylated tyrosine in albumin as a biomarker of exposure to organophosphorus nerve agents[J]. Arch Toxicol, 2007, 81(9): 627-639.

[11]BLACK R M. An overview of biological markers of exposure to chemical warfare agents[J]. Journal of Analytical Toxicology, 2008, 32(1): 2-9.

[12]READ R W, HARRISON J M，STEVENS J A, et al. Biomarkers of organophosphorus nerve agent exposure: Comparison of phosphylated butyrylcholinesterase and phosphylated albumin after oxime therapy[J]. Arch Toxicol, 2010, 84(1): 25-36.

[13]JOHN H, BREYER F, THUMFART J O, et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for detection and identification of albumin phosphylation by organophosphorus pesticides and G- and V-type nerve agents[J]. Anal Bioanal Chem, 2010, 398(6): 2 677-2 691.

[14]BAO Y, LIU Q, CHEN J, et al. Quantification of nerve agent adducts with albumin in rat plasma using liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1 229: 164-171.

[15]BLACK R M, READ R W. Biological markers of exposure to organophosphorus nerve agents[J]. Arch Toxicol, 2013, 87(3): 421-437.

[16]CHEN S G, ZHANG J, LUMLEY L, et al. Immunodetection of ierum albumin adducts as biomarkers for organophosphorus exposures[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2013, 344(2): 531-541.

[17]NOORT D, HULST A G, PLATENBURG D H J M, et al. Quantitative analysis of O-isopropyl methylphosphonic acid in serum samples of Japanese citizens allegedly exposed to sarin: Estimation of internal dosage[J]. Arch Toxicol, 1998, 72(10): 671-675.

[18]NOORT D, BLACK R M. Methods for the retrospective detection of exposure to toxic scheduled chemical. Part B. Mass spectrometry and immunochemical analysis of covalent adducts to proteins and DNA. In: Mesilaakso M(ed) Chemical weapons convention chemicals analysis(sample collection, preparation and analytical methods)[M]. West Sussex: Wiley, 2005: 403-431.

[19]ADAMS T K, CAPACIO B R, SMITH J R. The application of the fluoride reactivation process to the detection of sarin and soman nerve agent exposures in biological samples[J]. Drug Chem Toxicol, 2004, 27(1): 77-91.

Determination of Sarin and Soman Tyrosine Adducts in Exposed Animal Plasma by Liquid Chromatography/Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry

YU Hui-lan1,2, PEI Cheng-xin1,2, HU Zhen2, LIU Shi-lei1,2, XIANG Yu2

(1.StateKeyLaboratoryofNBCProtectionforCivilian,Beijing102205,China;2.ResearchInstituteofChemicalDefence,Beijing102205,China)

In order to retrospective analysis of biomedical samples exposed to nerve agents sarin (GB) and soman (GD), a method for determination of GB tyrosine adducts and GD tyrosine adducts in exposed animal plasma as a biomarker was developed by liquid chromatography/quadrupole-time of flight mass spectrometry(LC/Q-TOF MS). After optimizing different sample preparation processes and a series of instrumental parameters, the adducts were analyzed by LC/Q-TOF MS in positive electrospray ionization mode. After centrifugation, 50 μL plasma was added into 50 μL 10 g/L Pronase E in ammonium bicarbonate(50 mmol/L)and incubating at 37 ℃ for 2.5 h. The supernatant was analyzed after filtered through 0.5 mL molecular mass cutoff filters (10 ku) under centrifugation at 16 000 r/min for 15 min. The method is rapid, simple and reliable, which is suitable for analyzing the phosphylated tyrosine adducts in blood samples from the rabbits injected with LD50of GB.

biomarker; nerve agent; sarin(GB); soman(GD); plasma; tyrosine adduct; liquid chromatography/quadrupole -time of flight mass spectrometry(LC/Q-TOF MS)

2014-05-07;

2014-08-21

于惠蘭(1972—)，女(漢族)，山東文登人，副研究員，從事軍事化學研究。E-mail: yuhuilan1@163.com

時間：2015-01-30；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150130.1515.004.html

O657.63

A

1004-2997(2015)03-0261-07

10.7538/zpxb.youxian.2015.0002