HPLC-MS/MS法測定豬肌肉、肝臟及腎臟中雙氯芬酸鈉殘留量

王 莉，倪瑩瑩，王 慧，王文艷

(煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005)

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HPLC-MS/MS法測定豬肌肉、肝臟及腎臟中雙氯芬酸鈉殘留量

王 莉，倪瑩瑩，王 慧，王文艷

(煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005)

建立了HPLC-MS/MS方法檢測豬肌肉、肝臟及腎臟3種組織中非甾體抗炎藥雙氯芬酸鈉的殘留量。樣品處理以萘普生為內(nèi)標，先經(jīng)乙酸乙酯液液提取，后經(jīng)甲醇沉淀，Eclipse Plus C18 柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)等度洗脫。在負離子模式下，采用ESI電離源選擇性反應監(jiān)測模式(SRM)對雙氯芬酸及萘普生進行檢測。結果表明：在0.5～100 μg/kg濃度范圍內(nèi)，雙氯芬酸鈉在豬肌肉、肝臟及腎臟組織中的線性關系均良好，相關系數(shù)均大于0.99，各組織中的準確度RE及精密度CV均小于15%。該方法快速、有效、可靠，可應用于市場出售的豬肌肉、肝臟及腎臟中雙氯芬酸鈉殘留量的檢測。

雙氯芬酸鈉；殘留量；肌肉；肝臟；腎臟；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)

雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium，DS)是一種常用的非甾體抗炎藥(NSAIDs)，其作用機制是通過與COX酶結合，阻斷前列腺素E2的合成過程，從而起到鎮(zhèn)痛、消炎和解熱的作用[1-3]。NSAIDs的應用范圍比較廣泛，已被用來治療疼痛、子宮炎、乳腺炎等疾病。但這類藥物在抑制前列腺素生成的過程中會產(chǎn)生一些毒副作用，如對消化系統(tǒng)和腎臟的損害[4]，以及過敏反應，其中有0.2%～0.4%的致死率[5]。據(jù)報道，NSAIDs具有抗凝血作用，不少不法商販在肉中摻加NSAIDs以保持肉質(zhì)鮮嫩[6]。為了滿足市場對肉類的需求，NSAIDs在養(yǎng)殖業(yè)上的使用逐漸增加，其在動物性食品中的藥物殘留對消費者健康的損害已引起廣泛關注[7-8]。2005年，山東省藥品不良反應監(jiān)測中心將塞來昔布、雙氯芬酸、二氟尼柳等19種非甾體抗炎類藥物列為重點監(jiān)測品種，以加強安全性監(jiān)測[9]。

目前，國內(nèi)對動物性食品中NSAIDs的檢測主要參照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準(SN/T 2190—2008)[10]以及歐盟標準(2002/657/EC)[11]。對DS的檢測方法主要有高效液相色譜法[12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]等，檢測的樣品基質(zhì)主要為血漿[17]、尿液[18]，而關于動物組織中含有的DS殘留量檢測的報道很少。本研究通過建立HPLC-MS/MS方法對豬肌肉、肝臟及腎臟中的DS殘留量進行測定，旨為豬肉食品中DS殘留量的測定提供方法依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 藥物與試劑

雙氯芬酸鈉(批號：100334-200302)，萘普生(批號：100198-200403)：純度均為98%，由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈(色譜純)：德國Merck公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器

TSQ Quantum Access型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品，配有ESI源以及Xcalibur數(shù)據(jù)處理軟件；Agilent 1100自動進樣液相色譜系統(tǒng)：美國Agilent公司產(chǎn)品，包括四元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱；高速勻漿機：德國Fluko公司產(chǎn)品；XW-80A渦旋混合器：上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品；HSC-24A氮吹儀：天津恒奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；TGL-16G高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品。

1.3 儲備液及工作液的配制

精密稱取10 mg雙氯芬酸鈉及萘普生(內(nèi)標)，分別溶于水及甲醇中，配制成10 g/L儲備液，置于4 ℃冰箱中，備用。取適量體積的雙氯芬酸鈉儲備液，用流動相稀釋成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mg/L系列濃度的標準工作液，待用。精密量取內(nèi)標儲備液，用流動相逐級稀釋成500 μg/L內(nèi)標工作液，所有儲備液以及工作液均置于4 ℃冰箱中，備用，保存1個月。

1.4 HPLC-MS/MS條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18 柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-水溶液(45∶25∶30，V/V/V)，含0.2 mmol/L 醋酸銨和0.1%乙酸；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化電離源(ESI)，負離子模式下采用選擇性反應監(jiān)測模式(SRM)；噴霧電壓3 000 V；離子傳輸毛細管溫度350 ℃；鞘氣壓力207 kPa；輔助氣壓力34.5 kPa；雙氯芬酸及萘普生的碰撞誘導解離電壓均為15 eV，檢測離子對分別為m/z294.0→249.9和m/z229.1→170.1，掃描周期為0.1 s，代表性圖譜示于圖1；采用Xcalicur工作站對實驗數(shù)據(jù)進行采集及處理。

1.5 樣品處理

精密稱取1 g豬肌肉(或肝、腎)組織，按1∶3加入水進行勻漿，取組織勻漿液于10 mL離心管中，加入10 μL內(nèi)標(500 μg/L萘普生)、100 μL 1%甲酸，渦旋混合30 s，加入5 mL乙酸乙酯提取劑，渦旋混合3 min，以3 600 r/min離心10 min，將上層有機相轉移至另一10 mL玻璃管中，置于40 ℃水浴空氣流吹干后，加入300 μL甲醇，混合渦旋1 min，轉移至1.5 mL EP管中，以13 000 r/min離心10 min，取上清液于另一潔凈試管中，吹干，用100 μL流動相復溶，離心后進樣于HPLC-MS/MS系統(tǒng)，進樣體積10 μL。

圖1 雙氯芬酸(a)及萘普生(b)的[M-H]-二級全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full-scan product ion spectra of [M-H]- for diclofenac (a) and naproxen (b)

1.6 應用

通過已建立的方法對購買于煙臺市某些超市以及農(nóng)貿(mào)市場的新鮮豬肌肉、肝臟及腎臟中非甾體抗炎藥雙氯芬酸鈉的藥物殘留量進行監(jiān)測，按1.5節(jié)處理后，進行HPLC-MS/MS分析。

2 實驗結果

2.1 方法特異性

空白樣品中，除不加內(nèi)標外，其他按1.5節(jié)方法處理樣品，篩選得到的空白肌肉、肝臟及腎臟樣品的SRM色譜圖，空白組織加入標準溶液及實際樣品處理后進樣分析的代表性圖譜示于圖2。雙氯酚酸和萘普生的出峰時間分別為3.3 min和2.3 min，色譜峰峰型良好，且不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

2.2 線性范圍

取數(shù)只玻璃離心管，分別加入3 mL(相當于1 g組織樣品)空白豬肌肉、肝臟或腎臟樣品勻漿液和10 μL不同濃度的標準工作液，使最終濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/kg，對8個濃度點的標準曲線進行線性考察。同時制備空白樣品，按1.5節(jié)方法處理后，進行HPLC-MS/MS分析測定。以濃度x(μg/kg)為橫坐標，以待測物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值y為縱坐標，以加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸計算。在0.5～100 μg/kg范圍內(nèi)，雙氯芬酸鈉在豬肌肉、肝臟及腎臟組織樣品中均呈現(xiàn)出良好的線性關系。其中，代表性的標準曲線方程如下：y肌肉=0.272 0x+0.021 84(r=0.993 0)，y肝=0.238 9x+0.058 51(r=0.998 0)，y腎=0.278 9x+0.071 29(r=0.994 7)。

2.3 準確度和精密度

配制低、中、高濃度(0.5、5、50 μg/kg)雙氯芬酸鈉的肌肉、肝臟及腎臟樣品，按1.5節(jié)方法進行操作，每一濃度平行測定5樣本，連續(xù)3天，以考察方法的準確度和精密度。準確度以相對偏差(RE)表示，精密度以變異系數(shù)(CV)表示，結果列于表1。從數(shù)據(jù)可以看出，該方法的準確度RE和精密度CV均小于15%，說明該方法可以滿足豬肌肉、肝臟、腎臟樣品中雙氯芬酸鈉殘留量的測定。在3種組織中，方法的定量下限均為0.5 μg/kg。

表1 HPLC-MS/MS法測定豬肌肉、肝臟及腎臟中雙氯芬酸鈉的準確度和精密度

續(xù)表1

注：a.肌肉組織，b.肝組織，c.腎組織；1.空白組織，2.定量下限樣品，3.實測組織樣本；上通道為萘普生，下通道為雙氯芬酸圖2 LC-MS/MS法測定豬肌肉、肝臟及腎臟中雙氯芬酸鈉的典型SRM色譜圖Fig.2 Typical SRM chromatograms of diclofenac sodium in swine muscle, liver or kidney by LC-MS/MS

2.4 提取回收率

配制低、中、高(0.5、5、50 μg/kg)3種不同濃度雙氯芬酸鈉的肌肉、肝臟及腎臟組織樣品，按1.5節(jié)方法進行操作，通過DS在組織樣品中提取后的峰面積與相應濃度的純凈溶液的峰面積比值進行回收率測定。雙氯酚酸鈉在肌肉、肝臟及腎臟中的提取回收率分別為79.1%～84.2%、65.0%～72.2%和69.8%～75.6%；內(nèi)標在肌肉、肝臟及腎臟中的提取回收率分別為71.0%、74.3%和64.6%。

2.5 方法學應用

對抽取的不同來源的豬肌肉、肝臟及腎臟樣品平行測定2份，按1.5節(jié)方法進行操作，測得的結果列于表2。

表2 不同來源豬肉組織中雙氯芬酸鈉殘留情況

注：ND為未檢出

3 結論

組織樣品經(jīng)乙酸乙酯提取吹干后仍有一定油脂的干擾，為保證HPLC-MS/MS的進樣更潔凈，采用甲醇進一步分離油脂，經(jīng)兩步處理后，可保證樣品回收率符合分析要求，方法雜質(zhì)干擾少、靈敏度高。本實驗采用內(nèi)標法進行DS含量的計算，考慮到內(nèi)標物的化學結構、離子化效率、保留時間、提取回收率，再結合實驗室已有的化合物，嘗試了吲哚美辛、萘普生、五味子素作為內(nèi)標進行考察。因萘普生的出峰穩(wěn)定，在選擇的實驗條件下可以達到分析要求，最終選取萘普生作為內(nèi)標。

歐盟規(guī)定，豬可食性組織中雙氯芬酸鈉的標示殘留物為雙氯芬酸，其在豬肌肉、肝臟、腎臟的最大殘留量(MRLs)應不超過5、5、10 μg/kg。據(jù)此，抽檢來自于超市以及農(nóng)貿(mào)市場的豬肌肉、肝臟及腎臟，其雙氯芬酸鈉的殘留量均低于限量，能夠滿足人們食用的要求。采用HPLC-MS/MS方法對豬肌肉、肝臟及腎臟3種生物基質(zhì)中雙氯芬酸鈉的殘留量進行測定，該方法快速、準確，其靈敏度可以滿足國際上對動物性食品DS殘留限量檢測的要求，可為今后豬肉產(chǎn)品食用安全檢驗提供合理化的方法參考。

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Determination of Diclofenac Sodium Residue in Swine Muscle,Liver or Kidney by HPLC-MS/MS

WANG Li, NI Ying-ying, WANG Hui, WANG Wen-yan

(PharmaceuticalSchool,YantaiUniversity,Yantai264005,China)

The method for high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was established for the determination of diclofenac sodium (NSAIDs) in swine muscle, liver or kidney. Naproxen was adapted for internal standard. The samples were pretreated by liquid-liquid extraction, then methanol protein precipitation. Chromatographic separations were performed on an Eclipse Plus C18 column (100 mm×2.1 mm×3.5 μm) with an isocratic elution. Diclofenac and naproxen were ionized with an ESI source operated in negative ion mode, and were measured by selective reactions monitoring mode (SRM). The results show that the relationships of diclofenac sodium in the three tissues are well in the concentration of 0.5-100 μg/kg. The correlation coefficinets are more than 0.99. The RE of accuracy and the CV of precisions are all less than 15%. The method is rapid, specific and reliable, which has been applied to determine the residue of diclofenac sodium in swine muscle, liver or kidney bought from markets.

diclofenac sodium; drug residue; muscle; liver; kidney; high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

2014-06-10;

2014-09-01

王 莉(1989—)，女(漢族)，山東濟寧人，碩士研究生，藥學專業(yè)。E-mail: wlqwfy.163.com.ok@163.com

王文艷(1976—)，女(蒙古族)，內(nèi)蒙古赤峰人，副教授，從事藥代動力學研究。E-mail: ytuwwy@163.com

時間：2015-01-30；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150130.1529.008.html

O657.63

A

1004-2997(2015)03-0237-06

10.7538/zpxb.youxian.2015.0007