低強(qiáng)度脈沖超聲促進(jìn)骨組織再生相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展

姜懿軒 宮蘋 張亮

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院種植科，成都 610041

超聲作為機(jī)械能量中的一種，可傳入體內(nèi)產(chǎn)生獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)，不同強(qiáng)度、頻率的超聲廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷與治療中。由于高強(qiáng)度超聲能在組織中產(chǎn)生大量熱量，可能會(huì)損傷器官、組織和細(xì)胞，低強(qiáng)度脈沖超聲（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）一般被認(rèn)為既不產(chǎn)生熱損傷也不具有破壞性[1]，在醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域尤其是骨組織修復(fù)與再生領(lǐng)域表現(xiàn)出了一定的應(yīng)用潛力。以往研究多基于LIPUS對(duì)骨折愈合的影響，近年來(lái)針對(duì)LIPUS在骨組織再生方面的研究有較大進(jìn)展，如在牽張成骨、骨壞死、骨缺損修復(fù)、牙周組織再生等模型中，LIPUS也表現(xiàn)出了積極效應(yīng)。

由于LIPUS以非侵入方式通過(guò)軟組織傳遞到骨骼，在此過(guò)程中各種類型的細(xì)胞相互作用并提供適當(dāng)水平的生物活性分子，將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號(hào)后發(fā)揮作用，因此LIPUS促進(jìn)骨組織再生所涉及的分子機(jī)制較為復(fù)雜。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明LIPUS不僅可能作用于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）等直接促進(jìn)成骨，還可通過(guò)其對(duì)血管、神經(jīng)的作用對(duì)骨組織愈合與再生產(chǎn)生一定的積極影響，本文就這方面的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 LIPUS可促進(jìn)骨組織修復(fù)與再生

臨床前實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)LIPUS參與了骨組織修復(fù)與再生過(guò)程中的一系列生物學(xué)反應(yīng)，如血管生成、軟骨形成、骨重塑等[2-3]。比如，在大鼠創(chuàng)傷性椎體骨折模型中，LIPUS通過(guò)增加軟骨形成、誘導(dǎo)成骨細(xì)胞成骨以及H型微血管的形成，從而加速創(chuàng)傷性椎體骨折愈合[4]；通過(guò)誘導(dǎo)成骨和新生血管形成，LIPUS也可以促進(jìn)類固醇相關(guān)骨壞死兔模型的骨組織修復(fù)再生[5]；此外，LIPUS還能促進(jìn)大鼠顱骨缺損處的骨再生，這與成骨細(xì)胞增殖的顯著增加有關(guān)[6]等等。在21世紀(jì)初，LIPUS就已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療新鮮骨折愈合和陳舊性骨不連[7]。

LIPUS不僅可單獨(dú)作用，與其他治療手段結(jié)合時(shí)可發(fā)揮更積極的影響。比如LIPUS結(jié)合多孔支架對(duì)骨再生有著更強(qiáng)大的促進(jìn)作用，可能成為治療骨缺損的新方法[8]；LIPUS+自體濃縮骨髓移植作為一種新開(kāi)發(fā)的關(guān)節(jié)保存手術(shù)，對(duì)股骨頭壞死患者具有一定安全性，并可能有效促進(jìn)新骨形成[9]；LIPUS和生物可降解鎂材料骨植入物結(jié)合應(yīng)用，可以極大促進(jìn)植入物周圍骨再生，提高相應(yīng)的骨誘導(dǎo)性、生物相容性和生物安全性[10]；LIPUS和引導(dǎo)組織再生術(shù)（guided tissue regeneration，GTR）同時(shí)應(yīng)用于牙槽骨缺損處，能促進(jìn)更多骨生成，因此在牙周組織修復(fù)領(lǐng)域具有一定的潛在應(yīng)用前景，但其有效性尚需進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)證實(shí)[11]。

2 LIPUS促進(jìn)骨組織再生的分子機(jī)制

2.1 LIPUS與成骨細(xì)胞

多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)表明，LIPUS對(duì)成骨細(xì)胞增殖、活化及礦化有積極作用，這可能是音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號(hào)通路上調(diào)所致，抑制SHH通路降低了成骨細(xì)胞的遷移、增殖和活化能力，并阻礙了LIPUS的治療效果[12-13]。Miyasaka等[14]發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號(hào)通路作為重要的成骨相關(guān)信號(hào)通路，可被LIPUS誘導(dǎo)激活；當(dāng)BMP信號(hào)途徑被抑制時(shí)，LIPUS則刺激Smad1磷酸化來(lái)抑制熱休克蛋白（heat-shock pro-tein，HSP）27、上調(diào)HSP90水平，引起成骨細(xì)胞活化和成骨信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。LIPUS也可以作用于成熟成骨細(xì)胞，使核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）的表達(dá)明顯升高，激活RANKL信號(hào)通路，進(jìn)而激活下游趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白 1β的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)其活化和礦化[15]。

此外，LIPUS還可通過(guò)成骨細(xì)胞膜上P2X7受體誘導(dǎo)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的釋放及細(xì)胞分化，ATP作為機(jī)械刺激反應(yīng)中的關(guān)鍵介質(zhì)能促進(jìn)骨形成。Manaka等[16]證實(shí)，這是一條獨(dú)立于堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活化信號(hào)通路以外的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

對(duì)于成骨前體細(xì)胞，LIPUS刺激可以令其產(chǎn)生活性氧以激活絲裂原活化蛋白激酶通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著增加[17]；另外LIPUS可以加速成骨前體細(xì)胞對(duì)鈣和磷酸鹽的攝取從而促進(jìn)其礦化[18]。Tabuchi等[19]則首次證實(shí)，在小鼠成骨前體細(xì)胞中，有許多基因?qū)IPUS刺激有反應(yīng)，比如與骨形態(tài)相關(guān)的Dmp1、Fbn1、Igf2、Lum、Mmp13和Thbs1以及參與成骨細(xì)胞發(fā)育和/或分化的Cd200、Dmp1、Igf2和Nr4a1等基因，在被LIPUS刺激后會(huì)發(fā)生上調(diào)，從而降低成骨細(xì)胞分化的Id1、Id2、Id3等相關(guān)基因，使其發(fā)生下調(diào)。上述研究結(jié)果表明，LIPUS可能通過(guò)直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞基因表達(dá)，或調(diào)控不同信號(hào)通路來(lái)影響成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖、活化及礦化，提示LIPUS的作用機(jī)制可能涉及多個(gè)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.2 LIPUS與破骨細(xì)胞

破骨細(xì)胞也是骨形成過(guò)程中一種不可或缺的細(xì)胞，與成骨細(xì)胞一起共同調(diào)控骨組織代謝，在骨重建塑形過(guò)程中起重要作用。Suzuki等[20]研究了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在LIPUS刺激下的生物學(xué)行為，結(jié)果顯示，破骨細(xì)胞標(biāo)志物如抗酒石酸酸性磷酸酶、組織蛋白酶K表達(dá)降低，而成骨細(xì)胞標(biāo)志物如骨鈣素、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）等表達(dá)增加，破骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因由LIPUS處理后上調(diào)，表明LIPUS可加速破骨細(xì)胞凋亡。Hanmoto等[21]研究表明，破骨細(xì)胞內(nèi)核因子κB受體活化因子/RANKL信號(hào)通路在LIPUS刺激下被適度激活，影響破骨細(xì)胞活性進(jìn)而誘導(dǎo)骨再生。此外，LIPUS也可能通過(guò)抑制ERK-c-Fos-NFATC1級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，有效地抑制破骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)[22]。綜合近年來(lái)研究數(shù)據(jù)可見(jiàn)，關(guān)于LIPUS對(duì)骨組織再生影響的報(bào)道大多集中在成骨細(xì)胞的分化、增殖及基因表達(dá)調(diào)控上，對(duì)破骨細(xì)胞等其他骨相關(guān)細(xì)胞研究較少，且LIPUS作用于破骨細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚未完全闡明，其后的相關(guān)研究可多關(guān)注破骨細(xì)胞對(duì)不同LIPUS治療參數(shù)（如頻率和強(qiáng)度）的反應(yīng)以及其中潛在的細(xì)胞分子機(jī)制。

2.3 LIPUS與MSC

MSC可分化為多種細(xì)胞類型，如脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。MSC成脂和成骨向分化的嚴(yán)格控制對(duì)于骨再生至關(guān)重要[23]，機(jī)械刺激是調(diào)節(jié)MSC分化的關(guān)鍵因素之一。LIPUS作為一種物理機(jī)械刺激，可能通過(guò)降低過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ2（peroxisome proliferator activated receptor γ2，Pparg2）和脂肪酸結(jié)合蛋白4的基因表達(dá)、下調(diào)Pparg2的磷酸化水平，從而抑制MSC向脂肪細(xì)胞分化[24]；同時(shí)LIPUS促進(jìn)MSC的成骨向分化，表現(xiàn)為誘導(dǎo)OCN、Runx2、ALP、COL1等mRNA的表達(dá)、增加細(xì)胞鈣化，這可能是通過(guò)激活RhoA/ROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[24-25]。另外He等[26]研究顯示，LIPUS可有效促進(jìn)小鼠胚胎來(lái)源的MSC C3H10T1/2細(xì)胞從靜止期進(jìn)入生長(zhǎng)/分裂期，增強(qiáng)細(xì)胞增殖從而促進(jìn)骨缺損愈合，其機(jī)制可能與Bmi-1基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）來(lái)說(shuō)，細(xì)胞間間隙連接在LIPUS激活BMSC的過(guò)程中具有潛在作用[27]。另一方面，BMSC的遷移能力對(duì)骨再生也至關(guān)重要。Xiao等[28]研究證實(shí)，LIPUS刺激能夠通過(guò)上調(diào)趨化因子受體CXCR4和CCR-2、上調(diào)整合素 1β來(lái)激活并改善BMSC的遷移。因此，LIPUS可能通過(guò)刺激MSC成骨向分化、增加細(xì)胞增殖并抑制其成脂向分化、活化BMSC等，發(fā)揮對(duì)骨組織修復(fù)再生的積極效應(yīng)，有望成為骨組織工程的潛在輔助治療手段之一。

3 LIPUS促進(jìn)血管生成與骨組織再生

血管與骨組織之間存在著密切且復(fù)雜的偶聯(lián)關(guān)系，從組織結(jié)構(gòu)上看，血管與成骨相關(guān)細(xì)胞緊密分布，尤其在骨再生區(qū)域，血管生成對(duì)骨折愈合及預(yù)后十分關(guān)鍵[29-30]。Katano等[31]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS可促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨從而縮短骨折愈合期，這一過(guò)程血管內(nèi)皮細(xì)胞向新生骨組織處遷移，愈傷組織周圍的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)和微血管新生顯著增加。Cheung等[32]應(yīng)用骨質(zhì)疏松大鼠模型也證實(shí)了，LIPUS可以通過(guò)上調(diào)血管生成相關(guān)基因表達(dá)、增加血管生成和愈傷組織重塑，來(lái)加速骨質(zhì)疏松性骨折的愈合。另一項(xiàng)體內(nèi)研究[33]則觀察了LIPUS在1型糖尿病大鼠股骨骨折模型中的應(yīng)用效果，結(jié)果表明，LIPUS干預(yù)后的糖尿病大鼠骨折部位血管密度較正常對(duì)照大鼠及無(wú)LIPUS干預(yù)的糖尿病大鼠顯著增加，且此效應(yīng)與VEGF生成的顯著增加有關(guān)。

最新一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照雙盲臨床試驗(yàn)[34]表明，針對(duì)截骨術(shù)后腓骨延遲愈合的患者進(jìn)行LIPUS干預(yù)，與對(duì)照組相比，LIPUS治療組患者骨愈合部位的血管體積密度顯著增加，從而增加新生骨體積。體外實(shí)驗(yàn)[35-36]則證實(shí)，LIPUS刺激可引起人血管內(nèi)皮細(xì)胞中包括VEGF信號(hào)傳導(dǎo)和局灶性黏連途徑等1 050個(gè)基因發(fā)生改變。綜上，可以推測(cè)LIPUS不僅能通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)分子機(jī)制作用于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、MSC等直接調(diào)控骨代謝，還可能通過(guò)局部微循環(huán)改建間接對(duì)骨組織再生產(chǎn)生積極影響，且此過(guò)程可能與VEGF及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，是否涉及其他分子機(jī)制則需深入研究。

4 LIPUS促進(jìn)周圍感覺(jué)神經(jīng)再生與骨組織再生

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，周圍感覺(jué)神經(jīng)對(duì)骨再生起重要的調(diào)控作用，骨組織活力狀態(tài)與感覺(jué)神經(jīng)分布密度相關(guān)，正常生理狀態(tài)下，骨代謝活躍的區(qū)域感覺(jué)神經(jīng)分布密集，而阻斷感覺(jué)神經(jīng)支配可導(dǎo)致骨組織密度和形態(tài)學(xué)改變[37]，如失下牙槽神經(jīng)后可引起嚴(yán)重的下頜骨病理改變[38]。

LIPUS對(duì)感覺(jué)神經(jīng)損傷后修復(fù)再生存在一定積極影響，除可有效促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖和軸突再髓鞘化外[39]，還可能誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)嵴干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[40-41]，加速神經(jīng)修復(fù)再生。另外有研究[42]提示，LIPUS可上調(diào)周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的mRNA及相應(yīng)基因表達(dá)，而這些因子對(duì)骨組織再生起著積極作用。

在骨代謝活躍的區(qū)域，降鈣素基因相關(guān)肽（cal-citonin gene-related peptide，CGRP）陽(yáng)性感覺(jué)神經(jīng)纖維分布密度較高。Zhou等[43]報(bào)道在脊柱融合動(dòng)物模型中，LIPUS促進(jìn)異位成骨的同時(shí)，CGRP陽(yáng)性感覺(jué)神經(jīng)纖維快速增加，提示LIPUS可能通過(guò)CGRP陽(yáng)性感覺(jué)神經(jīng)支配來(lái)促進(jìn)成骨。Lam等[44]報(bào)道在大鼠坐骨神經(jīng)切除后，LIPUS不能促進(jìn)其脛骨骨折愈合，而神經(jīng)存在時(shí)LIPUS超聲實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出更快更成熟的愈合修復(fù)，表明完整的神經(jīng)分布可能在LIPUS促進(jìn)骨折愈合中發(fā)揮重要作用。另有研究[38]也同樣證實(shí)，LIPUS可以顯著改善由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)改變，但只發(fā)生在神經(jīng)可愈合的情況下；當(dāng)神經(jīng)無(wú)法愈合時(shí)，LIPUS并不能促進(jìn)骨組織修復(fù)與再生。

上述研究結(jié)果提示，LIPUS具有促進(jìn)神經(jīng)再生的潛力，主要表現(xiàn)為刺激雪旺細(xì)胞增殖來(lái)促進(jìn)軸突再生和髓鞘化、增加感覺(jué)神經(jīng)纖維的數(shù)量和密度等來(lái)加速外周神經(jīng)損傷后修復(fù)，而完整的神經(jīng)分布在骨組織修復(fù)與再生中可能起重要作用。目前關(guān)于LIPUS在促進(jìn)神經(jīng)與骨組織再生平衡中作用機(jī)制的研究尚不深入，需進(jìn)一步探索挖掘，但仍為L(zhǎng)IPUS的臨床應(yīng)用提供了新的思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。