宮頸癌及CINⅢ組織miRNA-34a表達(dá)及意義

袁匯，趙淑萍，戴紅英

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科,山東 青島 266003)

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宮頸癌及CINⅢ組織miRNA-34a表達(dá)及意義

袁匯，趙淑萍，戴紅英

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科,山東 青島 266003)

目的 探討miRNA-34a(miR-34a)在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅢ)及宮頸鱗癌組織和血清表達(dá)及其意義。方法 選擇41例宮頸鱗癌病人(宮頸癌組)、27例CINⅢ病人(CINⅢ組)和20例正常宮頸者(對(duì)照組)，提取其血清及組織中的小分子RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-34a的表達(dá)。結(jié)果 宮頸癌及CINⅢ組織中miR-34a相對(duì)表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有顯著性(F=70.26，q=8.36、16.58，P<0.01)。宮頸癌組血清中miR-34a相對(duì)表達(dá)量較CINⅢ組明顯下降，差異有顯著性(F=39.96，q=5.54，P<0.01)。CINⅢ組血清中miR-34a相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組也明顯下降，差異有顯著性(q=7.08，P<0.01)。宮頸癌組病人血清及組織中miR-34a的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.886，P<0.01)。結(jié)論 miR-34a在CINⅢ及宮頸鱗癌病人組織及血清中異常表達(dá)，可能在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)宮頸癌的診斷具有一定臨床價(jià)值。

miRNA-34a；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變；宮頸腫瘤；聚合酶鏈反應(yīng)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。近年來(lái),宮頸癌的發(fā)病率逐年升高，發(fā)病日趨年輕化，嚴(yán)重威脅婦女健康和生命。研究顯示，大量增高或降低的微小RNA(miRNA)在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[1]。已有研究表明，miRNA-34a(miR-34a)異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，如非小細(xì)胞肺癌[2]、膀胱癌[3]、前列腺癌等[4]。本文旨在檢測(cè)miR-34a在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅢ)及宮頸鱗癌組織中的表達(dá)，探討其在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中可能的作用及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

2013年1月—2014年4月，青島大學(xué)附屬海慈醫(yī)院婦科住院宮頸鱗癌手術(shù)病人癌組織標(biāo)本41例(宮頸癌組)，術(shù)前均未行放、化療。病人年齡31～62歲，平均44.5歲。病理分級(jí):G1級(jí)7例，G2級(jí)10例，G3級(jí)24例。按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期21例，Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期5例。CINⅢ病人的組織標(biāo)本27例(CINⅢ組)，病人年齡28～51歲，平均39.3歲。另取同期年齡匹配的正常宮頸組織標(biāo)本20例作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師明確診斷。清晨空腹時(shí)分別采集各組病人靜脈血5 mL于真空干燥管中，以1 500 r/min離心15 min，吸取上層血清于潔凈離心管中，然后置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2 研究方法

按照miRcute miRNA提取分離試劑盒使用說(shuō)明書的步驟從組織及血清中提取總RNA。Beckman DU 800型紫外線分光光度計(jì)測(cè)定RNA提取液A260吸光度值，計(jì)算總RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，首先對(duì)提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后按照熒光定量PCR試劑盒操作說(shuō)明操作,反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，60 ℃15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，以去RNA酶的水模板為陰性對(duì)照，得到各模板的Ct值，然后用公式2-△△Ct計(jì)算各樣本中miR-34a的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取均值。

2 結(jié) 果

對(duì)照組、CINⅢ組和宮頸癌組組織中miR-34a的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.908±0.223、0.528±0.299、0.211±0.208，血清中miR-34a的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.960±0.212、0.584±0.288、0.341±0.250。宮頸癌及CINⅢ組織中miR-34a相對(duì)表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有顯著意義(F=70.26，q=8.36、16.58，P<0.01)；宮頸癌組和CINⅢ組組織中miR-34a相對(duì)表達(dá)水平差異也有顯著性(q=8.30，P<0.01)。宮頸癌組血清中miR-34a相對(duì)表達(dá)量較CINⅢ組明顯下降，差異有顯著性(F=39.96，q=5.54，P<0.01)。CINⅢ組血清中miR-34a相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降，差異有顯著性(q=7.08，P<0.01)。見(jiàn)表1。宮頸癌病人血清與組織中miR-34a表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.886，P<0.05)。

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展常需要經(jīng)歷宮頸上皮內(nèi)瘤變、原位癌、浸潤(rùn)癌等階段，與HPV感染、染色體突變、單核苷酸多態(tài)性變化等密切相關(guān)，是一個(gè)多基因參與、涉及多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程[5]。多項(xiàng)研究表明，miRNA參與細(xì)胞增殖與代謝、分化與凋亡等生物學(xué)過(guò)程，miRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)的序列互補(bǔ)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用，與人類腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，miR-34a 在CINⅢ和宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，同時(shí)宮頸癌組與CINⅢ組miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較差異也有顯著性，表明隨著宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，miR-34a的表達(dá)逐漸降低，提示miR-34a很可能具有抑癌基因作用。近年來(lái)對(duì)miR-34a的相關(guān)研究逐漸增多，其抗腫瘤的作用機(jī)制也不斷被揭示。miR-34家族普遍存在于哺乳動(dòng)物中，其家族成員包括miR-34a、miR-34b和miR-34c，具有高度保守性。其主要功能包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻止細(xì)胞遷移及促使細(xì)胞周期停滯等[6]。作為家族中的一員，miR-34a的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。p53作為一種抑癌基因已被廣泛認(rèn)知，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，p53與miR-34a關(guān)系密切。CASTRO等[7]的研究表明，miR-34a受到p53的直接調(diào)控，同時(shí)還以正反饋的方式調(diào)節(jié)p53活性，通過(guò)沉默信息調(diào)節(jié)因子1參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。研究證明，在肺癌、腎癌等多種腫瘤中miR-34a有異常表達(dá)，起到抑制癌癥發(fā)生的作用。

目前，組織及血清中miRNA的表達(dá)和相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)技術(shù)日趨成熟，而且血清中miRNA具有高度穩(wěn)定性，具備疾病分子生物標(biāo)志物的某些特點(diǎn)，使其作為惡性腫瘤的分子標(biāo)志物成為可能[8-9]。劉秀琴等[9]的研究結(jié)果表明，miR-21過(guò)表達(dá)在急性B淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，可作為判斷兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病預(yù)后的指標(biāo)之一。本文研究結(jié)果顯示，組織及血清中miR-34a將為宮頸癌的早期診斷提供一個(gè)新的可供參考的指標(biāo)，其可能具有的抑癌基因作用，有望成為宮頸癌新的治療靶點(diǎn)。

[1] SIOMI H, SIOMI M C. Posttanscriptional regulation ofmicroRNA biogenesis in animals[J]. Mol Cell, 2010,38(3):323-332.

[2] 曾婷,郝麗,謝逸欣,等. microRNA-34a與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系及其可能調(diào)節(jié)機(jī)制[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2012,9(23):5-7.

[3] WANG W, LI T, HAN G, et al. Expression and role of miR-34a in bladder cancer[J]. Indian J Biochem Biophys, 2013,50(2):87-92.

[4] LIU C, KELNAR K, LIU B, et al. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44[J]. Nat Med, 2011,17(2):211-215.

[5] TSUBOKURA M, KOMATSU T, KAMI M. The prevalence of high-risk human papillomavirus in women with different types of cervical cancer[J]. Ann Intern Med, 2008,149(4):283.

[6] YAMAKUCHI M F M, LOWENSTEIN C J. MiR-34a repression of SIRT1 regulatesapoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(36):13421-13426.

[7] CASTRO R E, FERREIRA D M, AFONSO M B, et al. miR-34a/SIRT1/p53 is suppressed by ursodeoxycholic acid in the rat liver and activated by disease severity in human non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol, 2013,58(1):119-125.

[8] LI B S, ZHAO Y L, GUO G, et al. Plasma microRNAs, miR-223, miR-21 and miR-218, as novel potential biomarkers for gastric cancer detection[J]. PLoS One, 2012,7(7):e41629.

[9] 劉秀琴,于樹紅,孫立榮. 急性B淋巴細(xì)胞白血病病兒miR-21表達(dá)及意義[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2014,29(1):1-2,5.

(本文編輯 厲建強(qiáng))

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF MIRNA-34A IN CERVICAL CANCER AND CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA

YUANHui,ZHAOShuping,DAIHongying

(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the expression of miRNA-34a and its significance in cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ (CINⅢ), squamous carcinoma of the cervix (SCC) and serum.MethodsForty-one patients with SCC (SCC group),27 with CINⅢ (CINⅢ group) and 20 with normal cervix (control group) were enrolled in this study. The small RNA was extracted from their serum and tissues for detection of miRNA-34a expressions using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe expression levels of miRNA-34a in CINⅢ and cancer tissues was notably lower than that in the normal control, the differences were significant (F=70.26;q=8.36,16.58;P<0.01). The serum level of miRNA-34a in the cancer was lower than that in CIN Ⅲ (F=39.96;q=5.54,7.04;P<0.01), that in CIN Ⅲ was lower than that in the normal control (q=7.08,P<0.01). In SCC patients, the expression levels of miRNA-34a in cancer tissue and in serum were positively correlated (r=0. 886,P<0.01).ConclusionThe abnormal expression of miRNA-34a in tissues and serum of CIN Ⅲ and cervical cancer is likely to play an important role in the occurrence and development of cervical cancer, which has a certain value in the diagnosis of this malignancy.

miRNA-34a; cervical intraepithelial neoplasia; uterine cervical neoplams; polymerase chain reaction

2015-02-22;

2015-04-30

袁匯(1975-)，女，博士研究生。

趙淑萍(1966-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。

R

A

1008-0341(2015)04-0457-02