扶腎降濁方含藥血清對(duì)腎小管間質(zhì)損害大鼠成纖維細(xì)胞抗纖維化因子HGF和BMP-7的影響*

李春雨， 魏曉露， 蘇瑋蓮， 李國(guó)霞

(天津醫(yī)科大學(xué)國(guó)際醫(yī)學(xué)院，天津 300070)

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扶腎降濁方含藥血清對(duì)腎小管間質(zhì)損害大鼠成纖維細(xì)胞抗纖維化因子HGF和BMP-7的影響*

李春雨， 魏曉露， 蘇瑋蓮， 李國(guó)霞△

(天津醫(yī)科大學(xué)國(guó)際醫(yī)學(xué)院，天津 300070)

目的： 探討扶腎降濁方對(duì)系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)大鼠腎小管間質(zhì)損害的療效及機(jī)制。方法: 采用扶腎降濁方水溶液灌胃Wistar大鼠常規(guī)制備含藥血清，在MsPGN動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)造模時(shí)間至20周，使其自然發(fā)展為腎小管間質(zhì)損害模型，體外培養(yǎng)造模12、16和20周末大鼠間質(zhì)成纖維細(xì)胞，采用real-time PCR和Western blotting法檢測(cè)扶腎降濁方含藥血清對(duì)病理狀態(tài)間質(zhì)成纖維細(xì)胞中抗纖維化因子肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)mRNA及蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果: 病理狀態(tài)間質(zhì)成纖維細(xì)胞中抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，扶腎降濁方含藥血清隨著給藥周期的延長(zhǎng)可部分逆轉(zhuǎn)間質(zhì)損害造成的上述mRNA和蛋白表達(dá)異常。結(jié)論: 扶腎降濁方含藥血清對(duì)MsPGN大鼠間質(zhì)成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。

扶腎降濁方； 腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞； 血清藥理學(xué)方法； 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7

腎小管間質(zhì)損害是腎小球腎炎由炎癥啟動(dòng)進(jìn)展至腎小球硬化的中間環(huán)節(jié)，腎小球腎炎進(jìn)展至腎小球硬化，大多已不可逆轉(zhuǎn)，而對(duì)其中間環(huán)節(jié)即腎小管間質(zhì)損害進(jìn)行早期有效干預(yù)則可大大延緩腎小球腎炎進(jìn)展，對(duì)防治慢性腎臟疾病具有重要意義[1-2]。扶腎降濁方在臨床廣泛用于慢性腎臟疾病的治療，多年的臨床實(shí)踐取得了總有效率82.5%的療效[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，扶腎降濁方(Fushen Jiangzhuo formula，F(xiàn)SJZ)能改善慢性腎功能衰竭大鼠的常規(guī)生化指標(biāo)，延緩腎衰的病理進(jìn)程[4]。但對(duì)腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用機(jī)制尚不十分清楚。本文在前期研究的基礎(chǔ)上采用血清藥理學(xué)的研究方法，基于抗纖維化因子肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)，從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度，探討扶腎降濁方對(duì)系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 藥物、試劑、儀器和動(dòng)物

扶腎降濁方組成：山茱萸12 g，生黃芪30 g，白花蛇舌草30 g，丹參30 g，鬼箭羽30 g，益母草30 g，實(shí)驗(yàn)所用中藥制劑為天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院按既定工藝制備的配方顆粒，每克含生藥4.06 g，批號(hào)為20120810；葡萄球菌腸毒素B由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為Sigma產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)為AMRESCO產(chǎn)品；Trizol Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及real-time PCR試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、Western blotting檢測(cè)試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

DMI4000B倒置熒光顯微鏡(Leica)；電泳儀購(gòu)自大連競(jìng)邁生物科技有限公司；DH-2000凝膠圖像采集分析系統(tǒng)購(gòu)自Heraeus；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

雄性Wistar大鼠12只，體重(150 ± 10)g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供，合格證號(hào)為SCXK(軍)2009-003。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 Wistar大鼠6只隨機(jī)分為扶腎降濁方組(3只)和空白對(duì)照組(3只)。扶腎降濁方組以每千克51.5 g生藥劑量(成人劑量15倍)灌胃給藥，每日2次(空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水)連續(xù)3 d，于末次給藥后1 h腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min，3 000 r/min 離心20 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活血清，0.22 μm濾膜除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病理狀態(tài)間質(zhì)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)復(fù)制MsPGN大鼠動(dòng)物模型[5-6]。6只Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組(3只)和空白對(duì)照組(3只)，自實(shí)驗(yàn)第1天起，模型組大鼠以20 mg BSA配成水溶液，隔日灌胃1次，空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水，隔日灌胃1次，共12～20周。實(shí)驗(yàn)的第1天模型組分點(diǎn)注射完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg)、第8 天注射不完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg)，實(shí)驗(yàn)的第8天和15天分別經(jīng)尾靜脈注射金黃色葡萄球菌腸毒素B水溶液(0.4 mg/kg)各1次。空白對(duì)照組注射等體積生理鹽水。經(jīng)Masson染色研究證實(shí)本實(shí)驗(yàn)MsPGN大鼠動(dòng)物模型復(fù)制成功。取第12、16和20周的模型大鼠間質(zhì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)培養(yǎng)正常大鼠間質(zhì)成纖維細(xì)胞作為空白對(duì)照。無(wú)菌條件下，將富含小管間質(zhì)的腎組織剪碎成1 mm×1 mm×1mm小塊，經(jīng)PBS洗滌，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×109/L后接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)皿中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞以1.2×109/L接種于6孔培養(yǎng)板，分為空白對(duì)照組(正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞)、模型組、含藥血清低、中、高劑量組(分別為5%、10%、20%FSJZ方含藥血清)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，加入含藥血清(空白對(duì)照、模型組加入20%體積的對(duì)照血清)作用48 h后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 Real-time -PCR檢測(cè)mRNA水平 Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，引物序列見表1，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件為95 ℃15 min；95 ℃10 s、50～60 ℃30 s循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)生成熔解曲線，結(jié)果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析[7-9]。

表1 基因引物序列

2.4 Western blotting法檢測(cè)蛋白水平 蛋白變性后在10% SDS-PAGE中分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入Ⅰ抗4 ℃搖床振蕩孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入Ⅱ抗，室溫?fù)u床振蕩孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Gel-Pro 3.2軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 扶腎降濁方含藥血清對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞HGF、BMP-7 mRNA表達(dá)的影響

MsPGN大鼠腎小管間質(zhì)損害后體外培養(yǎng)間質(zhì)成纖維細(xì)胞，模型組與對(duì)照組比較，HGF和BMP-7的 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，10%含藥血清組在第20周，20%含藥血清組在第12、16和20周成纖維細(xì)胞HGF mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；5%含藥血清組在第20周，10%、20%含藥血清組在第12、16和20周成纖維細(xì)胞BMP-7 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見表2、3。

表2 扶腎降濁方對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞HGF mRNA表達(dá)的影響

△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

表3 扶腎降濁方對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞BMP-7 mRNA表達(dá)的影響

△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

2 扶腎降濁方含藥血清對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞HGF、BMP-7蛋白表達(dá)的影響

MsPGN大鼠腎小管間質(zhì)損害后體外培養(yǎng)間質(zhì)成纖維細(xì)胞，模型組與對(duì)照組比較，HGF、BMP-7蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。5%、10%、20%扶腎降濁方含藥血清組在第12、16、20周成纖維細(xì)胞HGF、BMP-7的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見圖1～3。

討 論

HGF和BMP-7是重要的腎營(yíng)養(yǎng)因子，負(fù)性調(diào)節(jié)腎纖維化[10]。HGF是一種對(duì)多種器官具有多效性的多肽細(xì)胞因子，在動(dòng)物模型中能明顯抑制患病腎臟系膜細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的活化。其拮抗TGF-β1介導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活，阻斷小管細(xì)胞轉(zhuǎn)化而阻止腎臟纖維化作用，因此，HGF水平下降會(huì)加重腎纖維化程度。BMP-7是另一種重要的腎營(yíng)養(yǎng)因子，廣泛表達(dá)于各種腎臟細(xì)胞且對(duì)腎臟的發(fā)育起著決定性作用[11]。在腎臟發(fā)育過程中，BMP-7缺乏導(dǎo)致腎間充質(zhì)細(xì)胞死亡，BMP-7缺乏的小鼠在圍產(chǎn)期死于尿毒癥。BMP-7與受體結(jié)合后，可活化Smad 6，使得Smad 6表達(dá)增加，Smad 6是TGF-β信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)分子，能抑制Smad 2和Smad 3的磷酸化而抑制TGF-β導(dǎo)致纖維化和致腎小管細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效應(yīng)，從而達(dá)到抗纖維化的作用[12]。

Figure 1.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal interstitial fibroblasts in 12 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

Figure 2.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal interstitial fibroblasts in 16 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

Figure 3.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal in terstitial fibroblasts in 20 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

前期研究發(fā)現(xiàn)，扶腎降濁方干預(yù)腎小管間質(zhì)損害造成的腎組織TGF-β1/Smads/ILK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因和蛋白表達(dá)異常，負(fù)性調(diào)節(jié)腎小管EMT，減少炎細(xì)胞的浸潤(rùn)與減輕腎小管間質(zhì)和腎小球損傷，延緩腎小管間質(zhì)損害病程的進(jìn)展[13]。那么，扶腎降濁方在延緩腎小管間質(zhì)損害病理進(jìn)程和抗腎纖維化方面是否還有更深、更多的影響和機(jī)制？本研究從腎小管間質(zhì)纖維化的第2階段(抗纖維化的因子HGF、BMP-7釋放，參與腎臟的自身防御，促進(jìn)炎癥消散和組織修復(fù))著手，觀察扶腎降濁方含藥血清對(duì)腎小管間質(zhì)損害大鼠間質(zhì)成纖維細(xì)胞抗纖維化因子HGF和BMP-7的影響，探討扶腎降濁方含藥血清對(duì)MsPGN腎小管間質(zhì)損害大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

本研究在MsPGN動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)造模時(shí)間至20周，使其自然發(fā)展為腎小管間質(zhì)損害模型，第12、16和20周的模型大鼠腎臟經(jīng)病理組織學(xué)觀察，證實(shí)MsPGN動(dòng)物模型復(fù)制成功。光鏡檢查第12周模型大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、壞死，個(gè)別小管完全萎縮，Masson染色顯示有間質(zhì)纖維化伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)。第16周、20周模型大鼠小管變性、壞死程度進(jìn)一步加重，Masson染色顯示腎小球和腎間質(zhì)有大量纖維組織增生及大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且病變隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐步加重，此部分研究?jī)?nèi)容另行發(fā)表。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MsPGN大鼠發(fā)展為腎小管間質(zhì)損害后，體外培養(yǎng)病理狀態(tài)間質(zhì)成纖維細(xì)胞，抗纖維化因子HGF、BMP-7mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，扶腎降濁方含藥血清能部分逆轉(zhuǎn)腎小管損害造成的上述mRNA和蛋白表達(dá)的異常，提示扶腎降濁方含藥血清可通過升高抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白的表達(dá)，可能是其發(fā)揮保護(hù)腎小管間質(zhì)作用的機(jī)制，本研究為中醫(yī)藥防治慢性腎功能衰竭提供了新的思路。

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促纖維化蛋白WNT5A在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷的早期被激活

急性呼吸窘迫綜合征中肺損傷和纖維化的機(jī)制鮮為人知。WNT/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的功能在肺修復(fù)和纖維化中日益受到重視，為了證實(shí)這條通路在膿毒癥之后早期在肺組織中被激活。一組西班牙科學(xué)家在體外肺細(xì)胞損傷模型中將人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)和人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)暴露在內(nèi)毒素中18 h，用盲腸末端結(jié)扎穿孔術(shù)誘發(fā)動(dòng)物膿毒性急性呼吸窘迫綜合征，并從因患敗血癥性急性呼吸窘迫綜合征而死亡的病人身上提取死亡24 h的肺組織，通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)涉及 Wnt 通路的WNT5A、非磷酸化(Ser33/37/Thr41)β-連環(huán)蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP7)、細(xì)胞周期蛋白D1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。他們發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)就是WNT/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的主要靶點(diǎn)。WNT5A、非磷酸化(Ser33/37/Thr41)β-連環(huán)蛋白、總β-連環(huán)蛋白、MMP7、細(xì)胞周期蛋白D1蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在經(jīng)內(nèi)毒素刺激的BEAS-2B和MRC-5細(xì)胞中均增加。從膿毒血癥動(dòng)物和膿毒血癥患者的肺組織中可以發(fā)現(xiàn)急性肺部炎癥，膠原蛋白沉積，WNT5A和MMP7蛋白水平明顯增加。因此，在膿毒癥誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征中WNT/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路會(huì)在早期被激活，并且能夠在肺的修復(fù)和纖維化中起重要的作用。對(duì)這條通路的調(diào)整可能是治療膿毒血癥和急性呼吸窘迫綜合征的潛在靶點(diǎn)。

Crit Care, 2014, 18(5):568(唐翔詡)

Effect of drug-containing serum of Fushen Jiangzhuo formula on anti-fibrosis factors HGF and BMP-7 in rat renal interstitial fibroblasts with renal tubulointerstitial lesion

LI Chun-yu, WEI Xiao-lu, SU Wei-lian, LI Guo-xia

(InternationalMedicalSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China.E-mail:liguoxia96@163.com)

AIM: To study the protective effects and mechanism of Fushen Jiangzhuo formula (FSJZ) on the rat renal interstitial fibroblasts with renal tubulointerstitial lesion. METHODS: The serum containing FSJZ and blank control serum were prepared. The rat model of mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN) was established and extended the time of modeling to 20th weeks for developing tubulointerstitial lesion naturally. The rat renal interstitial fibroblasts at the end of 12, 16, 20 week of modeling were isolated and cultured. The effects of FSJZ on the expression of hepatocyte growth factor (HGF) and bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) at mRNA and protein levels in the pathological renal interstitial fibroblasts were determined. RESULTS: The anti-fibrosis factors HGF and BMP-7 were changed in pathological renal interstitial fibroblasts. Renal tubulointerstitial lesion significantly down-regulated the expression of HGF and BMP-7, while the drug containing serum of FSJZ significantly up-regulated the expression of HGF and BMP-7. CONCLUSION: Drug containing serum of FSJZ has protective effect on pathological renal interstitial fibroblasts by regulating the mRNA and protein expression of HGF and BMP-7.

Fushen Jiangzhuo formula; Renal interstitial fibroblasts; Serologic pharmacological test; Hepatocyte growth factor; Bone morphogenetic protein-7

1000- 4718(2015)01- 0076- 05

2014- 08- 08

2014- 09- 30

天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 11JCYBJC12800)

△通訊作者 Tel: 022-83336911； E-mail: liguoxia96@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.015