Wnt 信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)改善高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠胰島素抵抗中的作用

孫婧 劉素娟 牛燕媚 傅力

1 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系（天津300070）

2 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖與組織胚胎學(xué)系

3 天津醫(yī)科大學(xué)康復(fù)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)系

1 前言

胰島素抵抗(Insulin Resistance, IR) 指胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素作用敏感性下降， 即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于其正常生物學(xué)效應(yīng)的狀態(tài)。 IR的發(fā)生涉及多個(gè)信號(hào)通路，是一種多位點(diǎn)、多層次胰島素信號(hào)共同作用異常的狀態(tài)[1]。現(xiàn)代人們生活方式如偏愛(ài)富含飽和脂肪酸、 單糖和膽固醇的西式飲食和疏于運(yùn)動(dòng)是導(dǎo)致IR及其合并代謝綜合征發(fā)病率俱增的主要因素。

長(zhǎng)期規(guī)律性有氧運(yùn)動(dòng)已成為防治代謝綜合征的有效手段之一，而其中的分子生物學(xué)機(jī)制尚不完全清楚。 運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素敏感性及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用效果極其復(fù)雜，主要與運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間有關(guān)[2，3]。 有研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可通過(guò)增加一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)及提高其活性以增強(qiáng)機(jī)體利用和攝取葡萄糖的能力。 這些關(guān)鍵蛋白質(zhì)主要指與骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取及代謝相關(guān)的調(diào)控蛋白； 與骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)(AMPK和AS160)；與線粒體形成相關(guān)、可促進(jìn)機(jī)體脂氧化能力的蛋白質(zhì)[4]。

近年有研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路不僅在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生中有重要作用， 還與IR、T2DM及肥胖的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[5，6]。有研究發(fā)現(xiàn)Wnts通過(guò)增加胰高血糖素樣多肽1（Glucagon Like Peptide-1, GLP-1）的表達(dá)，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖并減少其凋亡，促進(jìn)葡萄糖刺激胰島素分泌[7，8]。 有研究顯示胰島β細(xì)胞基因GSK3β敲除（β-GSK-3β-/-）小鼠可改善機(jī)體葡萄糖耐受能力，促進(jìn)β細(xì)胞增殖而抵抗高脂飲食誘導(dǎo)IR發(fā)生[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞內(nèi)β-catenin 和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1）的mRNA及蛋白表達(dá)與其對(duì)照組相比顯著下降，這可能是糖尿病患者傷口不易愈合的原因之一[10]。 另有研究發(fā)現(xiàn)人類骨骼肌的收縮活動(dòng)可調(diào)節(jié)GSK3和βcatenin分子的生物活性[11]。

鑒于Wnt信號(hào)通路及通路關(guān)鍵信號(hào)蛋白GSK3β和β-catenin與IR發(fā)生及運(yùn)動(dòng)改善IR之間關(guān)系密切， 推測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)增加小鼠骨骼肌細(xì)胞GSK3βSer9蛋白磷酸化表達(dá)，降低其下游信號(hào)蛋白β-cateninSer33/37，βcatenin Thr41磷酸化激活Wnt信號(hào)通路，由此調(diào)控機(jī)體糖脂代謝，提高機(jī)體外周組織對(duì)胰島素敏感性，從而防治IR。 因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)10周高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠誘導(dǎo)IR發(fā)生，隨后通過(guò)6周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練，比較分析高脂飲食及有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)下各組C57BL/6小鼠骨骼肌細(xì)胞GSK3β和β-catenin基因、蛋白及其磷酸化的表達(dá)，旨在探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)IR發(fā)生中的作用及潛在分子機(jī)制。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選用80只、4周齡雄性C57BL/6小鼠，平均體重為14.8 ± 0.39 g， 購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，光照12小時(shí)/天，動(dòng)物室室溫為20～25°C，濕度為30%～40%。

2.2 IR 動(dòng)物模型建立

1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后， 將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Con組）和胰島素抵抗模型組（IR組），分別飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料和高脂飼料10周。 通過(guò)檢測(cè)小鼠口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test, OGTT）及空腹血清胰島素（fasting serum insulin, FINs）鑒定模型建立情況。 高脂飼料成分為：蛋白質(zhì)20% kcal、碳水化合物35% kcal、脂肪45% kcal。

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)動(dòng)物模型建立

將已發(fā)生IR的小鼠隨機(jī)分為高脂飲食安靜組（HC組）和高脂飲食運(yùn)動(dòng)組（HE組），繼續(xù)喂飼高脂飼料；正常對(duì)照組隨機(jī)分為正常飲食安靜（NC組）和正常飲食運(yùn)動(dòng)組（NE組），繼續(xù)喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料。 各運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行為期6周75% VO2max有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，60 min/次/天，5次/周。

2.4 OGTT

分別檢測(cè)高脂飲食10周后及有氧運(yùn)動(dòng)6周后小鼠空腹血糖值。首先將小鼠禁食16小時(shí)，稱量并記錄禁食后小鼠體重。 小鼠尾靜脈取血微量, 檢測(cè)空腹血糖值（T0）， 隨后根據(jù)小鼠體重 （10μl/g） 迅速經(jīng)口腔灌注20%葡萄糖溶液。 分別檢測(cè)并記錄灌注葡萄糖后15、30、60和120 min的血糖值。

2.5 動(dòng)物血液、骨骼肌和胰腺樣本提取

小鼠為期6周有氧跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， 禁食16小時(shí)。采用摘取小鼠眼球取血法留取小鼠血液樣本， 靜置30分鐘后，4°C，3000 g/min離心15 分鐘，取上層血清。 分離并留取小鼠胰腺組織，浸泡于10%中性甲醛。 隨后，迅速分離小鼠小腿腓腸肌液氮速凍后，保存于-80°C冰箱備用。

2.6 FINs

取提取的小鼠血清，選用ELISA法檢測(cè)10周高脂飲食后及6周有氧運(yùn)動(dòng)后小鼠空腹血清胰島素水平。

2.7 胰島β細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將小鼠胰腺組織從10%中性甲醛固定液中取出，流水下沖洗10分鐘。 由脫水機(jī)進(jìn)行乙醇梯度脫水過(guò)夜，兩次浸入二甲苯，每次30分鐘，使組織透明。 隨后進(jìn)行石蠟包埋，切片和HE染色。 高倍鏡觀察胰島β細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.8 Real-time PCR方法檢測(cè)小鼠骨骼肌GSK3β和βcatenin mRNA表達(dá)

采用Trizol Reagent法提取骨骼肌總RNA。 隨后取1μl RNA經(jīng)由1%的瓊脂糖凝膠電泳； 由分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA的濃度和純度。 以總RNA為模板， 選用SuperScript TMIIIFirst-Strand Synthesis System for RTPCR試劑盒（Invitrogen）合成cDNA 第一鏈。選用IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀，以合成的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)（引物序列見(jiàn)表1）。取SYBR Green 10 μl，5’ Primer 0.5 μl，3’ Primer 0.5 μl，cDNA 3 μl，ddH2O 6 μl混勻，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。 設(shè)置程序?yàn)?4°C 2分鐘，40個(gè)循環(huán)（94°C 30 s；目的基因退火溫度30 s；72°C 1分鐘），65°C 30 s, 95°C 30 s。

表1 Real-time PCR引物序列

2.9 Western Blot 方 法 檢 測(cè) 小 鼠 骨 骼 肌GSK3β 和βcatenin蛋白及其磷酸化表達(dá)

采用NP-40方法提取小鼠骨骼肌總蛋白質(zhì)，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 取蛋白80～100 μg 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。 電泳條件為：60V，30分鐘；后110V，2小時(shí)。 采用濕法電轉(zhuǎn)印，條件為：4°C，300 mA，2 小時(shí)。 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，放入5%脫脂奶粉封閉液中封閉1小時(shí)， 搖床轉(zhuǎn)速為40 Rpm，后TBST洗滌PVDF膜。用含有5%BSA的抗體稀釋液按比例（GSK3β, pGSK3βSer9，β-catenin 和 pβ-cateninSer33/37Thr41抗體分別按1∶3000、1∶2000、1∶4000和1∶2000 稀釋）稀釋一抗，4°C孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，10分鐘/次。 用含有5% BSA的抗體稀釋液按照1∶10000 的比例稀釋二抗， 室溫孵育1小時(shí)后，TBST洗膜3次，10分鐘/次。 加ECL-Plus發(fā)光底物，于暗室曝光，膠片顯影和定影。 掃描圖片后用蛋白質(zhì)定量分析軟件統(tǒng)計(jì)。

NP-40裂解液成分為：50 mM/L Tris-base,150 mM/L NaCl, 15 mM/L EDTA, 1% NP-40，PH 8.0。 聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液組成為：250 mmol/L甘氨酸、25 mmol/L Tris-Base, 0.1% SDS，pH 8.3。轉(zhuǎn)膜緩沖液組成如下：39 mmol/L甘氨酸，48 mmol/L Tris-Base，0.037% SDS，20%甲醇，pH 8.3。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件 （SPSS11.5 for Windows） 處理。 數(shù)據(jù)采用單因變量雙因素方差（Univariate Analyses of Variance）分析。 各組間差異性檢驗(yàn)的顯著性水平定為P < 0.05。

3 結(jié)果

3.1 OGTT 和FINs

如圖1-A所示：與Con組相比，IR組小鼠血糖峰值明顯升高，峰值出現(xiàn)時(shí)間點(diǎn)明顯后移，且峰值后血糖恢復(fù)速度顯著下降，并且120 min 時(shí)仍不能恢復(fù)至血糖基礎(chǔ)水平。

如圖1-B所示：HC組與NC組相比， 血糖峰值明顯升高，峰值時(shí)間點(diǎn)明顯延遲，且血糖恢復(fù)到基礎(chǔ)水平的速度明顯下降（尤其是30～60 min時(shí)間段），并且在120 min時(shí)仍不能恢復(fù)至正常水平。HE組與HC組相比，血糖峰值明顯下降，峰值時(shí)間點(diǎn)前移，且在峰值出現(xiàn)后血糖恢復(fù)到基礎(chǔ)水平的速度明顯增加。 NE組與NC組相比，雖然血糖峰值以及峰值時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化， 但在15～30 min時(shí)間段，NE組小鼠血糖恢復(fù)至基礎(chǔ)水平的速度增加。

如圖1-C所示：IR組FIN較其對(duì)照組顯著性增加了52.7%（P < 0.05）。

如圖1-D及統(tǒng)計(jì)結(jié)果 （數(shù)據(jù)未列出） 所示：HC組FINs較NC組顯著增加44.40%（P < 0.01）；HE組FINs較HC組顯著降低20.80%（P < 0.05）。

圖1 各組小鼠OGTT和FINs比較

3.2 胰島β細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

高倍鏡下觀察各組動(dòng)物胰島β細(xì)胞團(tuán)面積及形態(tài)變化， 如圖2所示：HC組小鼠胰島β細(xì)胞團(tuán)面積較NC組顯著增加，且細(xì)胞團(tuán)邊緣模糊，界限不清，伴有炎癥浸潤(rùn)發(fā)生； 而HE組小鼠胰島β細(xì)胞團(tuán)面積較HC組顯著減小，炎癥浸潤(rùn)癥狀減緩。

3.3 小鼠骨骼肌GSK3β mRNA表達(dá)和GSK3β蛋白及其磷酸化表達(dá)

圖2 胰島β細(xì)胞團(tuán)面積及形態(tài)比較（40 ×）

骨骼肌組織GSK3β mRNA、 蛋白表達(dá)及pGSK3 βSer9蛋白表達(dá)如圖3、圖4所示：

圖3 各組小鼠骨骼肌GSK3β mRNA水平比較

骨骼肌細(xì)胞GSK3β mRNA結(jié)果（圖3）顯示：NE組較NC組GSK3β mRNA表達(dá)增加40.00% （P < 0.05）；HE組較HC組GSK3β mRNA表達(dá)增加37.5%（P < 0.01）；而HC組較NC組小鼠骨骼肌GSK3β mRNA表達(dá)顯著下降60%（P < 0.05）。

圖4 各組小鼠骨骼肌GSK3β蛋白和pGSK3βSer9蛋白磷酸化水平比較

骨骼肌GSK3β蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖4-A）顯示：飲食和運(yùn)動(dòng)兩個(gè)主效應(yīng)以及其交互作用對(duì)GSK3β蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性影響。NE組較NC組、HE組較HC組GSK3β蛋白表達(dá)分別增加36.11%、16.60%， 但無(wú)顯著性差異（數(shù)據(jù)未列出）。 HC組較NC組GSK3β蛋白表達(dá)降低69.30%，亦無(wú)顯著性差異。而骨骼肌pGSK3βSer9蛋白表達(dá)結(jié)果（圖4-B）顯示：飲食和運(yùn)動(dòng)兩個(gè)主效應(yīng)及其交互作用對(duì)pGSK3βSer9蛋白表達(dá)均有顯著性影響， 且與其mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。 運(yùn)動(dòng)主效應(yīng)分析顯示：NE組和HE組pGSK3βSer9蛋白表達(dá)較其安靜對(duì)照組分別增加20.01%（P < 0.05）、7.60%（P < 0.01）； 飲食主效應(yīng)分析顯示： 與NC組相比，HC組pGSK3βSer9蛋白表達(dá)降低1.19%（P < 0.05）。

3.4 小鼠骨骼肌β-catenin mRNA表達(dá)和β-catenin蛋白及其磷酸化表達(dá)

小鼠骨骼肌組織β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)及pβ-cateninSer33/37Thr41蛋白表達(dá)見(jiàn)圖5、圖6：

圖5 各組小鼠骨骼肌β-catenin mRNA水平比較

圖6 各組小鼠骨骼肌β-catenin 蛋白和pβ-cateninSer33/37Thr41蛋白磷酸化水平比較

骨骼肌細(xì)胞β-catenin mRNA結(jié)果（圖5）顯示：NE組 較NC 組β-catenin mRNA 表 達(dá) 降 低15.00%（P <0.05）；HE組較HC組β-catenin mRNA表達(dá)降低61.9.0%（P < 0.01）； 而比較HC組和NC組小鼠骨骼肌β-catenin mRNA 表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，HC 組表達(dá)顯著增加60%（P <0.05）。

骨骼肌β-catenin蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖6-A）所示：飲食和運(yùn)動(dòng)兩個(gè)主效應(yīng)及其交互作用對(duì)骨骼肌細(xì)胞βcatenin蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性影響。 HC組較NC組βcatenin蛋白表達(dá)增加16.21%；HE組較HC組β-catenin蛋白表達(dá)降低11.10%， 均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 骨骼肌pβcateninSer33/37Thr41蛋白表達(dá)結(jié)果（圖6-B）顯示：飲食和運(yùn)動(dòng)兩個(gè)主效應(yīng)對(duì)pβ-cateninSer33/37Thr41蛋白表達(dá)有顯著性影響， 但其交互作用對(duì)pβ-cateninSer33/37Thr41蛋白無(wú)顯著影響，與其mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。 飲食主效應(yīng)分析顯示：HC組與NC組相比，pβ-cateninSer33/37Thr41蛋白表達(dá)增加19.23%（P < 0.05）。 運(yùn)動(dòng)主效應(yīng)分析顯示：與其安靜對(duì)照組比較，HE組pβ-cateninSer33/37Thr41蛋白表達(dá)降低25.8%（P < 0.01）。

4 討論

4.1 Wnt信號(hào)通路與高脂飲食誘導(dǎo)IR發(fā)生的關(guān)系

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路參與機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)、 增殖、分化、移動(dòng)和細(xì)胞極性等過(guò)程[12]，該通路失調(diào)時(shí)可誘發(fā)多種癌癥以及糖脂代謝的紊亂。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該通路的異常與肥胖、IR和T2DM等代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[5,13]。

研究發(fā)現(xiàn)激活狀態(tài)下的Wnt 信號(hào)通路可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子（C/EBPα）和過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ（Peroxisome Proliferator-activated Receptor γ, PPARγ）的表達(dá)而抑制小鼠脂肪前體細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞[14]。另外，Wnts對(duì)胰島β細(xì)胞的形態(tài)和功能有重要調(diào)節(jié)作用，Wnt誘導(dǎo)葡萄糖刺激胰島素分泌和胰島β細(xì)胞的增殖[15]。 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路可調(diào)節(jié)胰高血糖素基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，增加GLP-1表達(dá)，從而直接促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖而減少其凋亡[16]。

人類遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Wnt10b基因突變而導(dǎo)致功能缺失的雜合子與肥胖發(fā)生有密切關(guān)系[17]，同樣，LRP5基因的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）也與肥胖有關(guān)[18]。 多個(gè)研究證實(shí)Wnt通路中轉(zhuǎn)錄因子7類似物2 （Transcription Factor 7-Like 2,TCF7L2）編碼基因的多態(tài)性增加了人群對(duì)T2DM的易感性[19-22]。 而完全敲除TCF7L2基因的小鼠，出生后短時(shí)間內(nèi)即死亡， 尸檢發(fā)現(xiàn)其小腸絨毛間小囊缺少增生性小室，表明腸內(nèi)L細(xì)胞分泌GLP-1的功能受損[23]，導(dǎo)致胞內(nèi)GLP-1對(duì)Wnt信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)異常， 影響胰島β細(xì)胞的生理功能[24]。

近年多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)蛋白GSK3β和β-catenin與IR發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞基因GSK3β敲除（β-GSK-3β-/-）的小鼠可通過(guò)改善機(jī)體糖耐受能力及促進(jìn)β細(xì)胞增殖而抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的IR[9,25]，而對(duì)骨骼肌細(xì)胞，GSK3β蛋白過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GSK3β蛋白過(guò)高表達(dá)可導(dǎo)致小鼠糖耐量受損， 這與由IR導(dǎo)致T2DM的患者機(jī)體GSK3β蛋白表達(dá)水平升高是一致的[26]。且最近有研究表明GSK3作為胰島素受體的下游信號(hào)分子之一，在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著負(fù)調(diào)控作用， 其抑制劑（CT 99021和CT 20026） 在治療IR及T2DM等代謝性疾病中發(fā)揮著重要作用。 Ye等采用RNA干擾技術(shù)沉默βcatenin時(shí)， 發(fā)現(xiàn)β-catenin作為PI3-Akt-GSK3β信號(hào)通路一個(gè)重要的下游信號(hào)分子，可調(diào)控機(jī)體血清IGF-1生理功能，與IR和T2DM的發(fā)生密切相關(guān)[27]。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠高脂飲食10周建立IR動(dòng)物模型。 與Con組小鼠相比，IR組小鼠的OGTT、FINs 及胰島β細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，10周高脂飲食可成功誘導(dǎo)小鼠IR發(fā)生。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)生IR的小鼠骨骼肌GSK3β基因和GSK3βSer9蛋白磷酸化表達(dá)下調(diào)， 而β-catenin基因、 β-catenin-Ser33/37和β-catenin Thr41蛋白磷酸化表達(dá)上調(diào)。

綜上，Wnt信號(hào)通路及其信號(hào)傳導(dǎo)通路的多個(gè)信號(hào)分子 （如Wnt10b、LRP5、TCF7L2、GSK3β 和β-catenin)在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控中發(fā)揮重要作用， 與IR的發(fā)生密切相關(guān)。

4.2 Wnt信號(hào)通路與有氧運(yùn)動(dòng)改善IR的關(guān)系

運(yùn)動(dòng)調(diào)控機(jī)體骨骼肌組織的多個(gè)代謝和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，既可以引起基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的短時(shí)變化，也可以使蛋白質(zhì)代謝率發(fā)生長(zhǎng)期適應(yīng)性變化， 因此在IR等代謝性疾病的預(yù)防及治療中發(fā)揮重要作用， 但其中的分子機(jī)制尚不完全清楚。 本實(shí)驗(yàn)6周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，OGTT、FINs及胰島β細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示：6周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著增強(qiáng)機(jī)體葡萄糖代謝能力，提高機(jī)體胰島素敏感性，部分逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)期高脂飲食誘導(dǎo)的機(jī)體糖耐量受損狀況，改善IR癥狀。 小鼠骨骼肌基因及蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：相較HC組小鼠，HE組小鼠骨骼肌GSK3β基因和GSK3β-Ser9蛋 白 磷 酸 化 表 達(dá) 增 加， 而β-catenin 基 因、 βcatenin-Ser33/37和β-catenin-Thr41蛋白磷酸化表達(dá)降低。提示有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路及影響該通路的關(guān)鍵信號(hào)分子表達(dá)而抑制和改善高脂飲食誘導(dǎo)的IR發(fā)生。

GSK3β是Wnt信號(hào)通路上的一個(gè)重要信號(hào)分子，當(dāng)GSK3β被蛋白激酶B（PKB/Akt）激活后可使下游信號(hào)分子β-catenin發(fā)生磷酸化。 β-catenin調(diào)控細(xì)胞骨架及黏附生理過(guò)程，在骨的形成和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由此推測(cè)運(yùn)動(dòng)或機(jī)械力刺激可能對(duì)GSK3β和β-catenin的表達(dá)具有調(diào)控作用。 目前，運(yùn)動(dòng)對(duì)組織細(xì)胞GSK3β和β-catenin的表達(dá)及活性影響尚存爭(zhēng)議。 出現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因還不清楚， 推測(cè)可能與實(shí)驗(yàn)所采用的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、 運(yùn)動(dòng)方式、 運(yùn)動(dòng)時(shí)間及選用動(dòng)物種屬等因素有關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn)人類骨骼肌的收縮活動(dòng)可調(diào)節(jié)GSK3和βcatenin分子的生物活性。 當(dāng)以75%和125%的最大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)時(shí)， 股外側(cè)骨骼肌細(xì)胞GSK3α上Ser21位點(diǎn)的磷酸化水平升高，其活性均降低了30%，而GSK3β的活性卻無(wú)明顯變化， 推測(cè)運(yùn)動(dòng)可能部分影響GSK3蛋白的活性；而β-catenin在Ser33/37及Thr41位點(diǎn)的磷酸化水平降低并伴隨活性下降50%～60%[11]。 但Wojtaszewski等研究發(fā)現(xiàn)，50%和75%最大負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)可使GSK3α活性增強(qiáng)[28]。還有研究表明運(yùn)動(dòng)并不能引起GSK3α在Ser21位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，僅增加了GSK3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化水平，且對(duì)其活性無(wú)影響[29]。 另有研究發(fā)現(xiàn)，在一次極限運(yùn)動(dòng)時(shí)， 不論是紅肌纖維還是白肌纖維，β-catenin在Ser33/37及Thr41位點(diǎn)均發(fā)生完全去磷酸化； 且其去磷酸化程度隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增大升高，活性也顯著增加，但與運(yùn)動(dòng)時(shí)間無(wú)密切關(guān)聯(lián)[9]。提示β-catenin的磷酸化與運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌消耗糖原高度相關(guān)， 而糖原的消耗量正是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的一個(gè)指標(biāo)。 還有研究發(fā)現(xiàn)，受試者接受為期8周力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及力量-速度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后， 只有力量-速度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組受試者的骨骼肌細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)量上調(diào)，而力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組未出現(xiàn)顯著變化[30]。 Baltgalvis等選用Apc（Min/+）小鼠進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組小鼠息肉組織內(nèi)β-catenin的磷酸化水平較其對(duì)照組升高3.3倍， 證明有氧運(yùn)動(dòng)可抑制機(jī)體腸息肉細(xì)胞腫瘤的發(fā)生[31]。

本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可改變小鼠骨骼肌組織GSK3β和β-catenin基因及蛋白磷酸化表達(dá)水平， 顯著激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路。 而激活的Wnt信號(hào)通路可抑制脂肪的形成及促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，調(diào)控機(jī)體糖脂代謝等。 這可能是信號(hào)分子GSK3β和β-catenin通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)改善IR的分子機(jī)制之一。

此外，Wnt信號(hào)通路可與細(xì)胞內(nèi)多個(gè)胰島素信號(hào)通路發(fā)生相互作用， 而信號(hào)分子GSK3β和β-catenin作為諸多通路“交叉點(diǎn)”發(fā)揮生理效能。研究發(fā)現(xiàn)Wnt可以激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 （Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）信號(hào)通路而促進(jìn)機(jī)體蛋白翻譯和細(xì)胞生長(zhǎng)。 一磷酸腺苷活化蛋白激酶 （AMP-activated Protein Kinase, AMPK）和GSK3作用于結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物蛋白2（Tuberous Sclerosis Complex 2, TSC2），使其發(fā)生磷酸化[32]。 有研究認(rèn)為長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可以抑制細(xì)胞mTOR信號(hào)通路活性， 抑制mTOR及其下游信號(hào)分子核糖體S6激酶1（S6K1）的表達(dá)，通過(guò)顯著上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子α（PGC-1α）的表達(dá)而提高細(xì)胞線粒體能量代謝， 增強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，從而改善機(jī)體IR[33，34]。 本實(shí)驗(yàn)同組人員檢測(cè)小鼠6周有氧運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞mTOR及S6K1的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與上述研究結(jié)果一致。 近年多項(xiàng)研究已證實(shí)有氧運(yùn)動(dòng)激活A(yù)MPK信號(hào)通路可改善機(jī)體IR癥狀[35，36]。 另有研究認(rèn)為GSK3抑制胰島素效能的途徑可能有以下兩種：（1）通過(guò)磷酸化糖原合酶抑制其活性；（2）通過(guò)磷酸化胰島素受體1 （Insulin Receptor Substrate-1, IRS-1）使其降解，從而減少與胰島素受體的相互作用，并抑制葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。 GSK3也是經(jīng)典胰島素信號(hào)通路磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B （PI3K/PKB） 的下游信號(hào)分子， 而近年來(lái)研究已證實(shí)有氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)該通路提高機(jī)體胰島素敏感性，預(yù)防和治療IR[37，38]。因此Wnt信號(hào)分子GSK3β和β-catenin可能通過(guò)與多個(gè)胰島素信號(hào)通路的交互作用發(fā)揮生理功能， 這可能是它們通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)改善IR的另一種分子機(jī)制。

5 結(jié)論

6周有氧運(yùn)動(dòng)可增加小鼠骨骼肌組織GSK3β基因和GSK3β-Ser9蛋白磷酸化表達(dá)， 降低其下游信號(hào)βcatenin基因和β-catenin-Ser33/37、β-catenin-Thr41蛋白磷酸化表達(dá)。表明有氧運(yùn)動(dòng)可調(diào)控Wnt通路關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)，顯著性激活此通路，從而發(fā)揮其抑制機(jī)體脂肪細(xì)胞生成，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖等生理功能，部分緩解高脂飲食誘導(dǎo)的IR。 本研究結(jié)果為有氧運(yùn)動(dòng)提高機(jī)體胰島素敏感性而改善IR分子生物學(xué)機(jī)制研究及臨床治療代謝性疾病提供理論依據(jù)。

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