槲皮素二水對多柔比星抗腫瘤的增效及減毒作用研究*

朱建立，葉啟霞，趙 陽，權松霞，溫戰(zhàn)迎，王巨才，何美霞

(1.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院藥理研究室，河南 鄭州 450052； 2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎內科，河南 鄭州 450052； 3.海南省食品藥品檢驗所，海南 海口 570216)

·實驗研究·

槲皮素二水對多柔比星抗腫瘤的增效及減毒作用研究*

朱建立1，葉啟霞1，趙 陽1，權松霞2，溫戰(zhàn)迎1，王巨才3，何美霞1

(1.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院藥理研究室，河南 鄭州 450052； 2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎內科，河南 鄭州 450052； 3.海南省食品藥品檢驗所，海南 ?？?570216)

目的：了解槲皮素二水與多柔比星(doxorubicin，ADM)聯合用藥后能否增強多柔比星的抗腫瘤作用，并且觀察槲皮素二水能否減低多柔比星對心臟的毒副作用。方法：增效作用采用槲皮素二水不同劑量與多柔比星聯合用藥，以荷動物移植性腫瘤肝癌(H22)小鼠模型觀察其對小鼠生命延長率的影響，以荷動物移植性肉瘤實體型(S180)小鼠模型來觀察其對抑瘤率的影響；減毒作用研究采用家兔多柔比星心肌損傷模型，觀察槲皮素二水治療后外周血心肌酶譜：肌酸激酶(CK)、CK同工酶MB亞型(CK-MB)、C-反應蛋白(CRP)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉氨酶(AST)的變化。結果：增效作用顯示槲皮素二水(100 μg/g)合用多柔比星與模型對照組對比，能明顯延長荷H22腹水瘤小鼠的生存時間，并對小鼠S180實體瘤有明顯抑制作用；與單用多柔比星組對比，抑制對荷H22腹水瘤小鼠的生存時間有延長趨勢,S180實體瘤作用顯著增強。減毒作用顯示槲皮素二水治療組與模型對照組對比， CK、CK-MB、CR、 LDH和AST均有降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結論： 槲皮素二水與多柔比星聯合用藥能明顯增強多柔比星對小鼠H22腹水瘤和S180實體瘤的抑制作用，并對多柔比星所致家兔心肌功能損傷有明顯保護作用。

槲皮素二水/藥效學；多柔比星/藥效學；腫瘤/藥物作用；增效作用；減毒作用

槲皮素及其衍生物是含有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于植物界，多以苷的形式存在于多種植物的根、莖、葉、果實中，如蕎麥、沙棘、山楂、洋蔥、槐米、三七、銀杏等，其中以槐米含量最高， 4%左右。近年來的研究表明：槲皮素及其衍生物有較強的抗腫瘤作用和較強的心血管保護作用[1-2]。多柔比星(doxorubicin，ADM)抗瘤譜較廣，在臨床上用于多種腫瘤的治療[3-4]，一般作為二線藥物，被認為是治療晚期乳腺癌的標準藥物，但其誘導的心肌毒性引起的高死亡率是腫瘤內科領域需要研究的重要課題。本研究采用體內抗動物移植性腫瘤的實驗方法，研究槲皮素衍生物之一槲皮素二水和ADM聯合用藥的抗腫瘤作用，以及槲皮素二水對ADM所致心肌毒性的減毒作用，以期為槲皮素及其衍生物更廣泛地應用于臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 瘤 株

小鼠移植性腫瘤模型包括肝癌(H22)和肉瘤實體型(S180)，由鄭州大學醫(yī)藥科學研究院藥理研究室接種傳代保種。

1.2 動 物

昆明種小鼠，SPF級，雄性，體質量18.0～22.0 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(豫)2005-0001。日本大耳白家兔，普通級，雌雄各半，體質量1.7～2.5 kg, 由河南省實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(豫)2005-0002。動物飼養(yǎng)溫度為(22±1)℃，12 h人工循環(huán)照明(早8點到晚8點為光照期)，自由攝食、飲水。

1.3 藥品與試劑

槲皮素二水， Sigma公司產品，批號Q0125；注射用鹽酸多柔比星，浙江海正藥業(yè)股份有限公司產品，批號100501。心肌酶譜檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，批號20101130。

1.4 對小鼠肝癌(H22)生命延長率影響的實驗

將小鼠隨機分為6組，每組動物10只。分別為：模型對照組[生理鹽水0.2mL/(只·d) ip], 單用ADM組[2.0μg /(g·d )ip][5], 單用槲皮素二水低劑量組 [20.0μg /(g·d )ip],槲皮素二水高劑量組[100.0μg /(g·d )ip][6], 槲皮素二水低劑量+ADM組[20.0μg /(g·d )ip +2.0μg /(g·d )ip]；槲皮素二水高劑量+ADM組[100.0μg /(g·d )ip +2.0 μg /(g·d )ip]。無菌抽取生長良好的第10天瘤源鼠腹水，以腹水︰生理鹽水1︰4比例稀釋，0.2 mL/只接種于受試鼠腹腔，次日開始按擬定計量用藥，連續(xù)用藥10 d ,停藥觀察60 d。用藥及停藥觀察期間記錄動物死亡情況，以如下公式計算生命延長率(%)。生命延長率=(給藥組平均存活天數-模型組平均存活天數)/模型組平均存活天數×100%。

1.5 對小鼠肉瘤(S180)抑瘤率影響的實驗

實驗分組同上。無菌剝離生長良好的第10天瘤源鼠實體瘤，以腹水︰生理鹽水1∶4比例稀釋制成瘤細胞懸液，按0.2 mL/只接種于受試鼠右側腋下皮下，次日開始用藥，連續(xù)用藥10d后停藥。停藥后第2天，體外測瘤體體積，計算抑瘤率(%)。抑瘤率=(模型組平均瘤體體積-給藥組平均瘤體體積)/ 模型組平均瘤體體積×100%。剝離瘤體稱量質量，計算抑瘤率(%)。抑瘤率=(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/ 模型組平均瘤重×100%。

1.6 對家兔ADM心肌損傷模型影響的實驗

心肌損傷模型的建立：取家兔12只，每只兔自耳緣靜脈注射ADM 10.0μg/g[7],2周后重復1次。將模型動物分為模型對照組和槲皮素二水組，每組6只。模型對照組以生理鹽水10.0 mL/兔ip,每周1次， 連續(xù)4周；槲皮素二水組以槲皮素二水藥液100.0 μg/g ip，每周1次，連續(xù)4周。第五周取家兔耳緣靜脈血檢測肌酸激酶(CK)、CK同工酶MB亞型(CK-MB)、C-反應蛋白(CRP)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉氨酶(AST)，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 對小鼠肝癌(H22)生命延長率的影響

各用藥組與模型對照組對比：單用ADM組、單用槲皮素二水高劑量組、槲皮素二水低劑量+ADM組、高劑量+ADM組小鼠生存時間明顯延長,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與單用ADM組對比：槲皮素二水低劑量+ADM組和高劑量+ADM組小鼠生存時間未見明顯延長，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組肝癌(H22)小鼠生存時間、生命延長率對比 ±s

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 對小鼠肉瘤(S180) 抑瘤率的影響

2.2.1 瘤體體積與抑瘤率

各用藥組與模型對照組對比：單用ADM組、槲皮素二水低劑量+ADM組、高劑量+ADM組呈現明顯抑瘤作用，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與單用ADM組對比：槲皮素二水高劑量+ADM組抑瘤作用呈現明顯增強，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

組 別劑量/(μg·g-1)瘤體體積/cm3抑瘤率/%模型對照組1.13±0.19單用ADM組2.00.74±0.2**34.5單用槲皮素二水低劑量組20.00.99±0.1912.4單用槲皮素二水高劑量組100.00.85±0.2524.8槲皮素二水低劑量+ADM組20.0+2.00.67±0.18**40.7槲皮素二水高劑量+ADM組100.0+2.00.48±0.10**#57.5

注：與模型對照組對比，**P<0.01；與單用ADM組對比，#P<0.05。

2.2.2 瘤體質量與抑瘤率

各用藥組與模型對照組對比：單用ADM組、槲皮素二水高劑量組、槲皮素二水低劑量+ADM組、高劑量+ADM組呈現明顯抑瘤作用，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與單用ADM組對比：槲皮素二水高劑量+ADM組抑瘤作用呈現明顯增強，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

組 別劑量/(μg·g-1))瘤體質量/g抑瘤率/%模型對照組2.43±0.23單用ADM組2.01.50±0.49**35.8單用槲皮素二水低劑量組20.02.06±0.4015.1單用槲皮素二水高劑量組100.01.71±0.57*29.7槲皮素二水低劑量+ADM組20.0+2.01.41±0.44**42.1槲皮素二水高劑量+ADM組100.0+2.00.98±0.20**#59.8

注：與模型對照組對比，*P<0.05,**P<0.01； 與單用ADM組對比，#P<0.05。

2.3 對家兔ADM心肌損傷的影響

治療組與模型對照組對比：心肌酶譜中CK、CK-MB、LDH和AST各指標均明顯下降，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

組 別CK/(U·L-1)CK-MB/(U·L-1)LDH/(U·L-1)CRP/(mg·L-1)AST/(U·L-1))模型對照組1785.0±229.52788.3±418.7617.3±104.11.45±0.1146.2±9.5槲皮素二水組1029.2±252.4**1995.8±464.3*516.2±82.5*1.43±0.1629.5±7.4*

注：與模型對照組對比，*P<0.05,**P<0.01。

3 討 論

多柔比星是蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，其分子中有脂溶性的蒽環(huán)配基，具有很強的藥理活性[8]。ADM對RNA的抑制作用最強。作為第二線藥物，如何提高其抗腫瘤活性是筆者的研究目標之一。另外，ADM使用的累積劑量一旦大于其限制劑量(>550 mg/m2)，由其誘導的心肌損傷就易導致患者心肌壞死，甚至出現充血性心力衰竭而發(fā)生死亡，特別是近年來ADM/PTX(紫衫醇)方案在晚期乳腺癌中的應用，心肌毒性反應率增加。ADM具有劑量依賴性的心臟毒性的特性限制了其臨床應用，因此從中草藥中尋找降低心臟毒性的藥物具有極重要的現實意義。

槲皮素的化學名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮,具有多種生物活性[9-10],如擴張冠狀動脈、降低毛細血管通透性和脆性、抗血小板聚集、抗病毒、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用。近年來,對槲皮素的研究結果引起了國內外學者越來越多的關注,特別是在槲皮素抗腫瘤和保護心肌作用方面作了大量的研究，發(fā)現槲皮素能抑制多種腫瘤細胞的增殖,誘導細胞凋亡；能逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥[11]。槲皮素的水溶性較差，而槲皮素二水的水溶性較好，考慮實驗中給藥方式為腹腔注射，故選用槲皮素二水來觀察其藥理活性。本研究發(fā)現：槲皮素二水(100 μg/g)合用ADM，能明顯延長荷H22腹水瘤小鼠的生存天數，對小鼠S180實體瘤有明顯抑制作用；與單用ADM組對比，抑制S180實體瘤作用顯著增強。有關槲皮素可增強其他抗腫瘤藥物作用的敏感性已有文獻報道，如槲皮素預處理的HL60和L1210白血病細胞能增強順鉑誘導的凋亡作用[12]。槲皮素發(fā)揮增效作用可能的機制是:提高腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性；使腫瘤細胞停留在對化療敏感的細胞周期;降低藥物在人體內及細胞內的降解速度；提高藥物對腫瘤組織的針對性分布及攝取率；提高正常組織對藥物副作用的抵抗力。本研究還發(fā)現:槲皮素二水對多柔比星導致的家兔心肌功能損傷有明顯保護作用。文獻報道:槲皮素能從不同角度保護心肌，如預先用槲皮素孵育體外培養(yǎng)的心肌細胞,可拮抗阿霉素對心肌細胞的損傷[13];槲皮素能防止藥物誘導的大鼠心肌線粒體酶如ATP酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶的變化,并能完全阻止DNR誘導的心肌線粒體外膜熒光的變化[14]。

綜上所述，槲皮素二水對多柔比星抗腫瘤作用有明顯的增效及減毒作用。這為新輔助化療的聯合用藥進一步研究奠定了一定的基礎，也表明開發(fā)槲皮素具有潛在的社會效益和經濟效益。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)11-0066-04

R284

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.11.32

何美霞,研究員,hmx@zzu.edu.cn

河南省公益科研院所預研項目 (09yy0036)

2015-06-09；

2015-09-09