補(bǔ)肺益腎方聯(lián)合舒肺貼對(duì)COPD大鼠肺臟Jagged1/notch1通路的影響*

李 亞，田燕歌，董玉瓊，李琳琳，王明航，毛 靜，王麗麗，羅 珊

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥呼吸藥理實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450000； 2.河南中醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究所，河南 鄭州450046； 3.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸病研究室，河南 鄭州450000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)肺益腎方聯(lián)合舒肺貼對(duì)COPD大鼠肺臟Jagged1/notch1通路的影響*

李 亞1，田燕歌2，董玉瓊3，李琳琳2，王明航3，毛 靜3，王麗麗3，羅 珊3

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥呼吸藥理實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450000； 2.河南中醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究所，河南 鄭州450046； 3.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸病研究室，河南 鄭州450000)

目的：評(píng)價(jià)補(bǔ)肺益腎方聯(lián)合舒肺貼對(duì)慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)穩(wěn)定期大鼠肺臟Jagged1/notch1通路的影響。方法：大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、舒肺貼組、補(bǔ)肺益腎組、補(bǔ)肺益腎聯(lián)合舒肺貼組和氨茶堿組。采用熏煙和細(xì)菌感染制備COPD模型。分別于第0,8,20周觀察肺功能，第20周檢測肺jagged1、notch1 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型對(duì)照組大鼠肺潮氣量(tidal volume，VT)、呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)及肺臟Jagged1、Notch1基因及蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。各治療組VT、PEF、Jagged1、Notch1基因和蛋白較模型對(duì)照組升高，以聯(lián)合組升高明顯(P<0.05)。結(jié)論：補(bǔ)肺益腎聯(lián)合舒肺貼可調(diào)控肺組織Jagged1、Notch1基因及蛋白表達(dá)，參與細(xì)胞分化過程，作用優(yōu)于單獨(dú)使用補(bǔ)肺益腎方或舒肺貼。

慢性阻塞性肺疾病/中醫(yī)藥療法；補(bǔ)肺益腎方；舒肺貼；Jagged1/notch1

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種嚴(yán)重危害公眾健康的重大疾病，目前已成為我國第三大致死原因，僅次于中風(fēng)和缺血性心臟病[1]。COPD以持續(xù)存在的氣流受限為特征，表現(xiàn)為肺功能的進(jìn)行性下降[2]。近年來，中醫(yī)藥(包括內(nèi)、外治法)在COPD穩(wěn)定期的治療作用逐漸受到重視。前期研究表明：補(bǔ)肺益腎方(專利號(hào)：ZL.201110117578.1)、舒肺貼(專利號(hào)：ZL.20081004933 2.3)，及其聯(lián)合可改善COPD患者臨床癥狀，減少急性加重次數(shù)等[3-6]，但作用機(jī)制尚不明確。Notch通路在肺和氣道上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞分化和細(xì)胞分泌中起重要作用，可抑制杯狀細(xì)胞化生和黏液分泌，減緩COPD發(fā)展進(jìn)程[7]。本研究以COPD穩(wěn)定期大鼠模型為研究對(duì)象，觀察肺組織Jagged1/notch1通路基因和蛋白的變化，探討補(bǔ)肺益腎方聯(lián)合舒肺貼治療COPD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)SD大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。

1.2 菌 株

肺炎克雷伯桿菌，菌株號(hào)46114，中國生物制品檢驗(yàn)鑒定所提供，使用前配成6×108菌落形成單位/mL的混懸液。

1.3 藥品與試劑

補(bǔ)肺益腎方由人參、黃芪、枸杞、五味子、淫羊藿等組成，舒肺貼由白芥子、延胡索、干姜等組成，均由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室提供；氨茶堿片，0.1 g/片，山東新華制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)H37020630。紅旗渠牌過濾嘴香煙，烤煙型，焦油量10 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量11 mg，河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。Jagged1(批號(hào)SC-8303)、Notch1(批號(hào)SC-9170)、β-actin(批號(hào)SC-130657)，HRP-兔抗IgG(批號(hào)SC-292373)由美國Santa Cruz公司提供。TRIzol REAGENT(批號(hào)15596-026)、SuperScipt Ⅲ First-Stand Synthesis SuperMix for qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)11752-050)、SYBR Green試劑盒(批號(hào)C11744)，由美國Invitrogen公司提供。Jagged1、Notch1 mRNA和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。Jagged1(產(chǎn)物長度170bp)：5′-CAG TGG CTT GGG TCT GTT GCT T-3′(上游)，5′-TGT GTT GGC TCC GTG TTT CTC G -3′(下游)。Notch1(產(chǎn)物長度128bp)：5′-CTT CGT GCT CCT GTT CTT TGT G -3′(上游)，5′-GTT CTC TCC GCT TCT TCT TGC T -3′(下游)。GAPDH(產(chǎn)物長度252bp)：5′-TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3′(上游), 5′-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3′(下游)。

1.4 動(dòng)物分組與模型的建立

采用隨機(jī)數(shù)字表法將72只大鼠分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、補(bǔ)肺益腎組、舒肺貼組、補(bǔ)肺益腎聯(lián)合舒肺貼組(簡稱聯(lián)合組)、氨茶堿組，每組12只。采用香煙熏吸聯(lián)合反復(fù)感染肺炎克雷伯桿菌法建立COPD穩(wěn)定期大鼠模型[8]。香煙熏吸：第1～2周，8支/次，2次/d；第3～12周，15支/次，3次/ d；30 min/次，每次熏吸間隔 3 h，共12周。第1～8周，造模大鼠經(jīng)鼻腔滴入肺炎克雷伯桿菌混懸液0.1 mL，5 d 1次。

1.5 給藥與處理

選擇大椎、雙側(cè)肺俞、雙側(cè)腎俞共5個(gè)穴位。輕度麻醉大鼠，穴位部位采用Na2S(80 g/L)脫毛，面積約1.5 cm×1.5 cm。將0.1 g舒肺貼藥物貼敷于穴位處，以醫(yī)用膠帶固定。第9～20周，每周一、四進(jìn)行穴位貼敷，4～6 h/次。貼敷以發(fā)紅或起泡但不潰爛為度。若有皮膚損傷，碘酒消毒，用紗布固定以防感染。肺俞、腎俞若一側(cè)穴位破損，則貼敷健側(cè)；若兩側(cè)皆破損且至下次貼敷時(shí)仍未結(jié)痂或愈合，暫停貼敷1次；若間隔2次或2次以上仍無法貼敷者，被淘汰。自第9周第1天起，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組以 2 mL生理鹽水灌胃聯(lián)合模擬穴位貼敷(輕度麻醉,脫毛,用空白膠帶貼于大椎、雙側(cè)肺俞、雙側(cè)腎俞)，補(bǔ)肺益腎組以補(bǔ)肺益腎方[4.44 g/(kg·d)，下同]灌胃聯(lián)合模擬穴位貼敷，舒肺貼組用生理鹽水2 mL灌胃聯(lián)合舒肺貼穴位貼敷，聯(lián)合組以補(bǔ)肺益腎方灌胃聯(lián)合舒肺貼穴位貼敷，氨茶堿組以氨茶堿[2.3 ng/(g·d)]灌胃聯(lián)合模擬穴位貼敷，至第20周末結(jié)束，每日灌胃2次。每周稱量大鼠體質(zhì)量以調(diào)整給藥劑量。藥物劑量采用等效劑量換算公式計(jì)算。公式為D大鼠=D人×(HI大鼠/HI人) × (W人/W大鼠)2/3。D為劑量，HI為體型系數(shù)，W為體質(zhì)量。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 潮氣量、呼氣峰流速

分別于第0，8，20周結(jié)束時(shí)測定肺功能，觀測肺潮氣量(tidal volume，VT)、呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

1.6.2 Jagged1和notch1 mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。取肺組織50 mg，用TRIzol法進(jìn)行總RNA提取，使用SuperScipt Ⅲ First-Stand Synthesis SuperMix for qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min； 95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40cycles；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s。

1.6.3 Jagged1和notch1蛋白表達(dá)

采用免疫印跡法(Western-blotting)測定。取100～200 mg肺組織提取蛋白，測定蛋白濃度，用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 50 g/L的牛血清白蛋白封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗30 ℃孵育1 h，洗滌，繼之于暗室內(nèi)用ECL發(fā)光液進(jìn)行熒光檢測，并將條帶曝于X光片上，用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行膠片掃描并分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠VT、PEF對(duì)比

第8周結(jié)束時(shí)，COPD大鼠VT、PEF均較空白對(duì)照組降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第20周結(jié)束時(shí)，模型對(duì)照組VT、PEF變化較正常對(duì)照組降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，補(bǔ)肺益腎組、聯(lián)合組及氨茶堿組VT 較模型組升高(P<0.05)，補(bǔ)肺益腎組及聯(lián)合組PEF較模型組升高(P<0.01，P<0.05)。見表1。

組 別動(dòng)物數(shù)VT/mL0周8周20周PEF/(mL·s-1)0周8周20周空白對(duì)照組121.54±0.061.68±0.07**1.71±0.04**15.89±1.1116.57±0.14**16.78±0.39**模型對(duì)照組101.51±0.051.45±0.051.42±0.1315.26±1.0411.85±0.1411.74±0.71舒肺貼組101.51±0.041.46±0.111.54±0.1116.12±0.8711.96±0.2313.23±0.37補(bǔ)肺益腎組111.51±0.091.46±0.071.57±0.07*16.22±2.1512.01±0.1813.53±0.67*聯(lián)合組121.54±0.081.48±0.081.61±0.05*16.39±1.4611.88±0.3014.19±0.36**氨茶堿組101.52±0.081.50±0.061.55±0.08*15.87±1.2911.79±0.1312.97±0.75

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組大鼠肺組織Jagged1mRNA和Notch1mRNA表達(dá)對(duì)比

模型對(duì)照組Jagged1mRNA、Notch1mRNA較空白對(duì)照組明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，舒肺貼組、補(bǔ)肺益腎組、聯(lián)合組及氨茶堿組均較模型對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；與氨茶堿組對(duì)比，補(bǔ)肺益腎組、聯(lián)合組Jagged1mRNA、Notch1mRNA均增高(P<0.05，P<0.01)；補(bǔ)肺益腎組、聯(lián)合組Jagged-1mRNA、Notch1mRNA較舒肺貼組升高(P<0.05，P<0.01)；聯(lián)合組較補(bǔ)肺益腎組升高(P<0.05)。見表2。

組 別動(dòng)物數(shù)Jagged1mRNANotch1mRNA空白對(duì)照組61.000±0.000**1.000±0.000**模型對(duì)照組60.442±0.0470.463±0.015舒肺貼組61.436±0.063**1.561±0.079**補(bǔ)肺益腎組61.633±0.052**△1.740±0.041**△△聯(lián)合組61.865±0.034**△△#1.885±0.017**△△#氨茶堿組61.398±0.121**#▲▲1.490±0.059**##▲▲

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01；與補(bǔ)肺益腎組對(duì)比，#P<0.05，##P<0.01；與舒肺貼組對(duì)比，△P<0.05，△△P<0.01；與聯(lián)合組對(duì)比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

2.3 各組大鼠肺組織Jagged1和Notch1蛋白表達(dá)對(duì)比

模型對(duì)照組Jagged1、Notch1蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；舒肺貼組、補(bǔ)肺益腎組、聯(lián)合組Jagged1、Notch1蛋白表達(dá)均較模型對(duì)照組升高(P<0.01,P<0.05)；氨茶堿組Notch1蛋白表達(dá)較模型組升高(P<0.05)。見表3。

組 別動(dòng)物數(shù)Jagged1/β-ActinNotch1/β-Actin空白對(duì)照組60.714±0.052**0.733±0.032**模型對(duì)照組60.504±0.0380.599±0.013舒肺貼組60.644±0.056*0.710±0.008*補(bǔ)肺益腎組60.663±0.028*0.747±0.002**聯(lián)合組60.677±0.034*0.757±0.015**氨茶堿組60.611±0.0330.697±0.053*

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

慢性阻塞性肺疾病屬中醫(yī)學(xué)“肺脹”“喘證”等范疇。李建生教授認(rèn)為“正虛積損”為COPD的主要病機(jī)，正虛多為氣虛、陽虛，或陰陽虛損，表現(xiàn)于肺、脾、腎，而以肺為初始并以腎為基，肺腎氣虛兼見痰瘀互結(jié)為其主要證候，治療當(dāng)以補(bǔ)肺益腎佐以化痰祛瘀[9-10]。補(bǔ)肺益腎方由人參、黃芪、山茱萸、枸杞子等組成，具有補(bǔ)肺益腎、化痰祛瘀、止咳平喘等功效。該治療方法的穴位貼敷屬冬病夏治，是針對(duì)COPD特點(diǎn)，在夏季人體陽氣最旺盛之時(shí)，將辛溫藥物貼敷于相應(yīng)腧穴，借助外界溫?zé)嶂畾?，以達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)整氣血、祛除體內(nèi)沉積之寒氣，減少冬天反復(fù)發(fā)作的目的。選用白芥子、細(xì)辛等辛溫發(fā)散之品，貼敷于肺俞、腎俞、大椎等穴位，可開宣肺氣、透達(dá)經(jīng)絡(luò)。補(bǔ)肺益腎方、舒肺貼及其聯(lián)合治療COPD穩(wěn)定期有良好的臨床療效[3-6]。本組資料顯示：舒肺貼、補(bǔ)肺益腎方及其聯(lián)合，以及氨茶堿治療可改善COPD大鼠肺功能，以補(bǔ)肺益腎方聯(lián)合舒肺貼改善尤為顯著。

Notch通路包括4個(gè)成員(Notch1～4)，通過與相鄰細(xì)胞表面配體(Jaggedl，2和Delta l，3，4)相互作用傳遞Notch信號(hào)，參與多種細(xì)胞、組織分化，與肺和氣道上皮細(xì)胞成熟、分化密切相關(guān)。Notch1可直接參與調(diào)節(jié)肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞分化，Notch1的活化決定了細(xì)胞向分泌型或非分泌型細(xì)胞分化[11-12]。研究[13]顯示：吸煙者和COPD患者氣道上皮Jagged1、notch2基因表達(dá)明顯下調(diào)。

此外，Notch信號(hào)通路在T淋巴細(xì)胞分化、增殖、變異中也具有重要作用，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。Notch受體的活化可促進(jìn)淋巴前體細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞方向分化，Notch通路可調(diào)控T淋巴細(xì)胞活性，其活化可阻斷促凋亡核受體蛋白Nur77的活性，從而抑制T淋巴細(xì)胞凋亡[14]。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)還可調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞的聚集及其病理功能[15]。本研究資料顯示，COPD大鼠肺組織Jagged1、Notch1基因及蛋白表達(dá)明顯降低，補(bǔ)肺益腎方聯(lián)合舒肺貼治療可明顯改善Jagged1、Notch1基因表達(dá)，優(yōu)于單純補(bǔ)肺益腎方、舒肺貼和氨茶堿，且補(bǔ)肺益腎方改善較舒肺貼和氨茶堿顯著，而在Jagged1、Notch1蛋白表達(dá)方面，雖有類似的趨勢(shì)，但各組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，補(bǔ)肺益腎方聯(lián)合舒肺貼可能通過Jagged1/notch1通路調(diào)控肺上皮細(xì)胞和/或T淋巴細(xì)胞的分化、增殖等而發(fā)揮相關(guān)作用，且較單純補(bǔ)肺益腎方或舒肺貼顯著，但該通路通過何種細(xì)胞發(fā)揮作用尚不十分清楚，需要進(jìn)行細(xì)胞水平方面的深入研究。

[1]Yang G, Wang Y, Zeng Y, et al. Rapid health transition in China, 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010[J]. Lancet, 2013, 381(9882):1987-2015.

[2]Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease (updated 2015)[EB/OL]. (2015-02-18)[2015-04-02]http://www.goldcopd.org/uploads/users/files/GOLD_Report_2015_Feb18.pdf.

[3]Li SY, Li JS, Wang MH,et al.Effects of comprehensive therapy based on traditional Chinese medicine patterns in stable chronic obstructive pulmonary disease: a four-center, open-label, randomized, controlled study [J].BMC Complement Altern Med, 2012(12): 197.

[4]李素云,李建生, 余學(xué)慶, 等. 舒肺貼治療慢性阻塞性肺疾病療效觀察[J]. 陜西中醫(yī), 2009, 30(4):391-392.

[5]張盼奎, 余學(xué)慶,李建生, 等.舒肺貼治療慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期47例[J].中醫(yī)研究, 2013, 26(2):50-52.

[6]Li JS, Li SY, Yu XQ, et al.Bu-Fei Yi-Shen granule combined with acupoint sticking therapy in patients with stable chronic obstructive pulmonary disease: A randomized, double-blind, double-dummy,active-controlled,4-center study[J]. J Ethnopharmacol, 2012, 141(2):584-591.

[7]Tsao PN, Wei SC, Wu MF, et al.Notch signaling prevents mucous metaplasia in mouse conducting airways during postnatal development[J].Development, 2011, 138(16):3533-3543.

[8]Li Y, Li SY, Li JS, et al.A rat model for stable chronic obstructive pulmonary disease induced by cigarette smoke inhalation and repetitive bacterial infection[J].Biol Pharm Bull, 2012, 35(10): 1752-1760.

[9]李建生.正虛積損為慢性阻塞性肺疾病的主要病機(jī)[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2011, 26(8):1710-1713.

[10]王至婉, 李建生, 余學(xué)慶, 等. 基于文獻(xiàn)的COPD穩(wěn)定期證候要素分布規(guī)律的研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2008, 35(4):513-514.

[11]張謙慎, 常立文, 劉漢楚, 等.Notch信號(hào)與大鼠肺發(fā)育的關(guān)系研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2004, 33(3):339-342.

[12]Guseh JS, Bores SA, Stanger BZ, et al.Notch signaling promotes airway mucous metaplasia and inhibits alveolar development[J].Development,2009,136(10):1751-1759.

[13]Tilley AE, Harvey BG, Heguy A, et al.Down-regulation of the Notch Pathway in Human Airway Epithelium in Association with Smoking and Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J].Am J Respir Crit Care Med, 2009, 179(6):457-466.

[14]Tan JB,Visan I,Yuan JS,et al.Requirement for Notch1 signals at sequential early stages of intrathymic T-cell development [J].Nature Immunol, 2005, 6(7):671-679.

[15]Sandy AR, Stoolman J, Malott K, et al.Notch signaling regulates T cell accumulation and function in the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Immunol, 2013, 191(4):1606-1613.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)11-0059-05

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.11.30

李亞(1980-)，男(漢族)，河南夏邑人，河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥藥理(呼吸)實(shí)驗(yàn)室講師，博士，2013年赴美國密歇根州立大學(xué)研修，主要從事中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)疾病研究。

王明航，副教授，博士，wmh107hn@163.com

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81302921)；國家中醫(yī)藥管理局國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(xiàng)(JDZX2012030)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A360594)

2015-08-17；

2015-09-25