超聲波輔助復(fù)合酶法提取枸杞多糖工藝研究

王杉杉，馬韻升，姚 剛，劉圣鵬，虞鳳慧，魏 征*

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股股份有限公司，山東 濱州 256500）

枸杞（Lycium barbarum）子為茄科植物枸杞的干燥成熟果實(shí)[1]，能滋補(bǔ)肝腎、益精明目，用于腰膝酸痛、眩暈耳鳴[2]。枸杞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，關(guān)于其營(yíng)養(yǎng)成分的報(bào)道[2-3]也很多，枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是枸杞中的主要活性成分之一，是一種水溶性蛋白多糖，已經(jīng)被研究證實(shí)具有提高免疫力、抗癌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗脂肪肝等功效[4-8]，具有很好的發(fā)展前景。

目前，枸杞多糖的提取主要采用熱水浸提法，該方法比較簡(jiǎn)單，易于操作，但提取效率低，且較高的溫度容易破壞多糖結(jié)構(gòu)，降低其生物活性[9]。酶法可以分解植物細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的成分，從而促進(jìn)胞內(nèi)有效成分的溶出[10-12]；超聲輔助浸提則可利用超聲波的空化效應(yīng)及機(jī)械剪切作用來(lái)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，同時(shí)強(qiáng)化傳質(zhì)，以達(dá)到提高有效成分收率的目的[13-14]。這兩種方法因其提取條件溫和、提取效率高、提取時(shí)間短及綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)受到越來(lái)越多的關(guān)注。如果將二者結(jié)合，一方面可利用超聲增強(qiáng)復(fù)合酶的活性，提高其破壁效率；另一方面可通過(guò)超聲強(qiáng)化傳質(zhì)過(guò)程，促進(jìn)多糖溶解，有效縮短浸提時(shí)間，提高多糖得率[15-18]。

本試驗(yàn)采用超聲波輔助復(fù)合酶法對(duì)枸杞多糖提取工藝進(jìn)行研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)枸杞多糖的料液比、提取溫度、超聲時(shí)間、復(fù)合酶添加量進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得一個(gè)得率高、品質(zhì)好的枸杞多糖提取條件，從而為枸杞多糖的工業(yè)生產(chǎn)、開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：寧夏；脂肪酶（200000U/g）、果膠酶（200000U/g）：蘇柯漢濰坊生物工程有限公司；蛋白酶（200 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；纖維素酶（20 000 U/g）：實(shí)驗(yàn)室自制（畢赤酵母工程菌發(fā)酵）；無(wú)水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸（分析純）：萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-6M大型低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)科技有限公司；752N-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康有限公司；KQ-250B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市融化儀器制造有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：上海浦東物理光學(xué)儀器銷(xiāo)售部。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞多糖提取工藝流程

枸杞粉末→乙醇脫脂→超聲波輔助復(fù)合酶浸提→沸水浴滅酶→離心→Sevage法除蛋白→濃縮→冷凍干燥→枸杞多糖粗品

1.3.2 枸杞多糖提取操作要點(diǎn)

緩沖溶液的配制：分別配制0.1 mol/L的檸檬酸及檸檬酸鈉溶液，并按比例配成pH 4.6的緩沖溶液。

復(fù)合酶液配制：稱(chēng)取等質(zhì)量的脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶和果膠酶，加入10倍體積的緩沖溶液，40 ℃水浴活化20 min。

將枸杞置于陰涼處，自然晾干，將其粉碎。精確稱(chēng)取粉碎的枸杞粉末30 g，加入10倍體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，于80 ℃水浴脫脂1 h，冷卻、離心、收集濾餅備用。按照不同的料液比、提取溫度、提取時(shí)間、復(fù)合酶（脂肪酶/蛋白酶/纖維素酶/果膠酶1∶1∶1∶1）添加量設(shè)計(jì)試驗(yàn)，在180 W超聲功率條件下進(jìn)行超聲波輔助復(fù)合酶提取，沸水浴滅酶10 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，過(guò)濾，Sevage法除蛋白，上清液進(jìn)行減壓濃縮至原體積的1/5，冷凍干燥得到枸杞多糖粗品。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取在105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，置于50 mL燒杯中加蒸餾水溶解，并全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，另取10 mL該溶液于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精密吸取0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸5.0 mL，在旋轉(zhuǎn)均勻器上小心混勻，冷卻后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處，以試劑空白溶液為參比，1 cm比色皿測(cè)吸光度值，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.4 樣品多糖含量測(cè)定

取干燥枸杞多糖供試品，按實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將其稀釋至合適倍數(shù)，精確吸取待測(cè)液2 mL置于25 mL比色管，按照方法1.3.3顯色，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算葡萄糖的質(zhì)量，計(jì)算樣品中多糖含量。多糖含量的計(jì)算公式如下：

式中：C為供試液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，μg/mL；D為樣品液的稀釋因素：F為換算因子；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.5 多糖得率的計(jì)算

枸杞多糖的得率計(jì)算公式如下：

式中：Y為枸杞多糖得率，%；m1為枸杞多糖質(zhì)量，g；m0為粗多糖質(zhì)量，g。

1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

料液比的確定：分別設(shè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL），在超聲功率180 W，提取溫度為55 ℃，復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取40 min，考察不同料液比對(duì)多糖得率的影響。

提取溫度的確定：分別設(shè)定提取溫度為35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃，在超聲功率180 W，料液比為1∶40（g∶mL），復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取40 min，考察不同提取溫度對(duì)多糖得率的影響。

超聲時(shí)間的確定：分別設(shè)定提取時(shí)間為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，在超聲功率180 W，料液比為1∶40（g∶mL），提取溫度為55 ℃，復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取，考察不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。

復(fù)合酶添加量：分別設(shè)定復(fù)合酶（脂肪酶/蛋白酶/纖維素酶/果膠酶1∶1∶1∶1）添加量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，在超聲功率180 W，料液比為1∶40（g∶mL），提取溫度為55 ℃條件下提取50 min，考察不同復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響。

1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、提取溫度（C）和復(fù)合酶添加量（D）4個(gè)因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以枸杞多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定枸杞多糖提取的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 枸杞多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for polysaccharide from Lycium barbarum extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

采用硫酸-苯酚法測(cè)定不同質(zhì)量的葡萄糖在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在葡萄糖含量0～0.12 mg范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程為y=8.002 1x-0.015 5，擬合系數(shù)R2=0.998 1，表明葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 各單因素對(duì)枸杞多糖提取效果的影響

2.2.1 料液比對(duì)提取效果的影響

不同料液比條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid liquid ratio on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

從圖2可以看出，當(dāng)料液比＜1∶40（g∶mL）時(shí)，枸杞多糖得率隨著料液比的升高而升高，可能是當(dāng)料液比較低時(shí)，溶液黏稠度較大，超聲波處理時(shí)，不易形成空化現(xiàn)象；當(dāng)料液比為1∶40（g∶mL）時(shí)，枸杞多糖得率達(dá)到31.132%；之后隨著料液比的升高反而會(huì)使枸杞多糖得率降低，可能是隨著溶劑用量的增大，溶液中底物與酶的質(zhì)量濃度也隨之下降，有效反應(yīng)碰撞減少。因此，選擇料液比1∶40（g∶mL）最佳。

2.2.2 提取溫度對(duì)提取效果的影響

不同提取溫度條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，枸杞多糖得率隨著溫度的升高而升高；當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，枸杞多糖得率達(dá)到42.621%；之后隨著溫度繼續(xù)升高，枸杞多糖得率顯著降低。溫度影響酶的活性，適當(dāng)?shù)纳邷囟瓤梢蕴岣呙傅幕钚?，提高枸杞多糖得率，但?dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，活性急速下降，而使枸杞多糖得率降低。因此，選擇提取溫度為55 ℃最佳。

圖3 溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

不同超聲時(shí)間條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

從圖4可以看出，超聲時(shí)間＜50 min時(shí)，枸杞多糖隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；超聲時(shí)間為50 min時(shí)，枸杞多糖得率39.742%；當(dāng)＞50 min時(shí)，枸杞多糖得率反而下降，可能因?yàn)槌晻r(shí)間較長(zhǎng)，超聲波提供的能量過(guò)高，此條件下多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，得率降低。因此，選擇超聲時(shí)間為50 min。

2.2.4 復(fù)合酶添加量對(duì)提取效果的影響

不同復(fù)合酶添加量條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖5所示。

圖5 復(fù)合酶添加量對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.5 Effect of compound enzymes addition on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

由圖5可以看出，枸杞多糖得率隨著酶添加量的增加而增大；當(dāng)酶添加量為0.6%時(shí)，枸杞多糖得率達(dá)到45.362%；當(dāng)酶添加量＞0.6%時(shí)，隨著酶添加量的增大而變得緩慢，可能因?yàn)榇藭r(shí)酶用量在底物質(zhì)量濃度一定時(shí)達(dá)到飽和。因此，選擇復(fù)合酶添加量為0.6%。

2.3 提取枸杞多糖的最佳工藝確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)料液比、浸提時(shí)間、提取溫度、復(fù)合酶添加量進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 枸杞多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for polysaccharide from Lycium barbarum extraction conditions optimization

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各因素影響枸杞多糖得率得主次關(guān)系順序?yàn)樘崛囟龋˙）＞料液比（A）＞復(fù)合酶添加量（D）＞超聲時(shí)間（C）。最佳工藝條件為A2B1C2D1，即料液比為1∶40（g∶mL），提取溫度50 ℃，超聲時(shí)間50 min，復(fù)合酶添加量0.5%。并在此最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，枸杞多糖得率達(dá)到58.910%，高于正交試驗(yàn)表中最大多糖得率52.372%，故可以認(rèn)為該組合為超聲波輔助熱水浸提法提取枸杞多糖的最佳提取工藝。由表3可知，各因素對(duì)結(jié)果影響均不顯著。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，寧夏枸杞多糖的提取受料液比，提取溫度，超聲時(shí)間，復(fù)合酶添加量4個(gè)因素影響較大，且各因素水平數(shù)據(jù)之間存在一定的梯度差。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞多糖最佳提取工藝條件為料液比1∶40（g∶mL），浸提溫度50 ℃，超聲時(shí)間50 min，復(fù)合酶添加量0.5%。在此最佳條件下，枸杞多糖平均得率為58.910%。

利用超聲輔助復(fù)合酶法提取枸杞多糖具有節(jié)約時(shí)間、能耗低、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)枸杞多糖提供理論依據(jù)。

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