產(chǎn)纖溶酶海洋放線菌的篩選及初步鑒定

董 超，米 陽，原晉波，史延茂

（1.河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050081；2.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130）

血栓導(dǎo)致的心腦血管病一般表現(xiàn)為心梗和中風(fēng)，現(xiàn)在臨床的治療方案以溶栓為主，溶栓藥物包括鏈激酶（streptokinase，SK）、尿激酶（urokinase，UK）、蚓激酶、葡激酶、組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，t-PA）和瑞替普酶，還有目前研究較熱的納豆激酶等，它們在不同方面存在一定缺陷，如有免疫反應(yīng)、對血液纖維蛋白專一性差、半衰期短或價(jià)格昂貴等[1]。納豆激酶雖然無上述缺點(diǎn)，但是由于出血傾向未有定論，目前還沒有藥品注冊登記[2]。尿激酶由于來源特殊，價(jià)格與成本差距較小，近年來已經(jīng)逐步退出市場。蚓激酶和蛇毒溶栓酶來自動(dòng)物，容易受養(yǎng)殖成本的影響。由于微生物發(fā)酵具有周期短、規(guī)模易擴(kuò)大、提取工藝可控等優(yōu)點(diǎn)，所以微生物發(fā)酵生產(chǎn)臨床的纖溶酶逐漸成為主流。陸地微生物中一些產(chǎn)纖溶酶的菌株包括：枯草芽孢桿菌（納豆芽孢桿菌）、假單胞菌、鏈霉菌、根霉、曲霉和蛹蟲草真菌等[3-4]。

海洋蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，絕大多數(shù)的海洋微生物還沒被人類認(rèn)識和培養(yǎng)。由于海洋的高鹽、低溫、低營養(yǎng)等特殊環(huán)境，海洋微生物的代謝途徑與陸地微生物差異較大，可以產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物[5]。本研究采用加入抑制劑和誘導(dǎo)劑的篩選方法，從秦皇島海域和天津海濱的海水和海泥樣本中，獲得了分布特征差異較大的菌株，并且得到了一株產(chǎn)纖溶酶的鏈霉菌菌株，對該菌株進(jìn)行了初步的鑒定。針對海洋微生物產(chǎn)物的多樣性和新型溶栓藥物的開發(fā)進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及化學(xué)試劑

牛纖維蛋白原：美國Sigma公司；凝血酶：石家莊市華瑞創(chuàng)新生物科技開發(fā)中心；注射用尿激酶：遼寧衛(wèi)星制藥廠有限責(zé)任公司；K2Cr2O7（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；青霉素、桿菌肽：華北制藥集團(tuán)股份有限公司；四環(huán)素：北京賽孚制藥股份有限公司；環(huán)丙沙星、慶大霉素：新鄉(xiāng)市常樂制藥責(zé)任有限公司。海水取自渤海灣，取樣參數(shù)見表1。海泥取自天津?yàn)I海新區(qū)海灣，取樣參數(shù)見表2。

表1 渤海灣海水樣本取樣參數(shù)Table 1 Seawater sampling parameters in Bohai Bay

表2 天津?yàn)I海新區(qū)海灣海泥樣本取樣參數(shù)Table 2 Seamud sampling parameters in Tianjin Binhai New District Bay

1.1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）海水培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH 7.0～7.2，用模擬海水配制，固體需要加瓊脂1.5%。

PB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0～7.2，固體需要加瓊脂1.5%。

高氏1號海水培養(yǎng)基：淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基用模擬海水配制。

蛋白酶篩選培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基加入0.5%的滅菌奶粉。

纖溶酶篩選培養(yǎng)基：纖維蛋白原80 mg溶于75 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中，凝血酶4 mg溶于5 mL同樣緩沖液中。將100 mL LB培養(yǎng)基化開，冷卻到50 ℃，先將纖維蛋白原溶液加入，攪拌，然后加入凝血酶，攪拌均勻。迅速倒平板，備用。

目標(biāo)菌株的搖床培養(yǎng)：海水LB培養(yǎng)液裝量50 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度24 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)3 d，得發(fā)酵液。

模擬海水配方：NaCl 26.73 g/L，MgCl22.26 g/L，MgSO43.24 g/L，CaCl21.15 g/L，NaHCO30.20 g/L，KCl 0.72 g/L，NaBr 0.06 g/L，H3BO30.05 g/L，LiNO30.0013 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

PW/10-002臺式保溫培養(yǎng)箱：重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；BX41顯微鏡：日本Olympus公司；SKY2102C搖床：上海蘇坤設(shè)備有限公司；MyCycler PCR儀：美國伯樂公司；DYCP-31C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 海水和海泥樣本的保存

海水取樣每瓶200 mL，先冷藏，然后每瓶分裝到50 mL滅菌離心管，取一瓶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其余液氮保存，以備重復(fù)或進(jìn)一步篩查。

1.3.2 樣本的預(yù)處理

從不同瓶的海水樣本中分別吸取1 mL，每10個(gè)瓶取10 mL，合并混勻，備用；海泥樣本或動(dòng)物帶泥沙分別稱質(zhì)量約10 g混合，再與模擬海水以質(zhì)量比1∶5混合，搖床振蕩30 min，備用。

1.3.3 樣本初篩

取海水樣本直接涂平板，取海泥樣本中加入0.1%吐溫-80，在25 ℃條件下培養(yǎng)。將各培養(yǎng)平板的菌株進(jìn)行初步分類（外觀、鏡檢）。

1.3.4 抑制細(xì)菌和真菌的樣本篩選[6]

取海水、海泥樣本分別加入滅菌的K2Cr2O7溶液使質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL、1 000 μg/mL、1 500 μg/mL、2 000 μg/mL、3 000 μg/mL，在25 ℃條件下振蕩8 h，涂平板，與1.3.3比較菌落數(shù)量的變化。

1.3.5 纖維蛋白的制備

在培養(yǎng)液中添加一定量的誘導(dǎo)底物，以利于目標(biāo)菌株的篩選。纖維蛋白的制備方法采用抗凝血漿凍融法[7]。

1.3.6 纖溶酶酶活的測定方法

纖溶酶活性測定方法參照改進(jìn)型瓊脂糖纖維蛋白平板法進(jìn)行測定[8]。

1.3.7 產(chǎn)蛋白酶的菌株條件篩選

將800 μg/mL K2Cr2O7處理的海泥樣本涂布于蛋白酶篩選培養(yǎng)基，25 ℃條件下培養(yǎng)2～5 d，觀察菌落透明圈。

1.3.8 產(chǎn)纖溶酶的菌株初篩

將纖維蛋白原220 mg和凝血酶11 mg加入模擬海水中配制成500 mL，加入1.3.7處理樣本的上清液5 mL，在25 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)7～10 d，取0.1 mL涂布于纖溶酶篩選培養(yǎng)基的平板，觀察菌落透明圈。

1.3.9 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩

將1.3.7篩選得到有透明圈的菌落分別劃線接種到纖溶酶篩選培養(yǎng)基中，觀察菌落透明圈。

1.3.10 產(chǎn)纖溶酶菌株的菌落特征

將復(fù)篩所得的產(chǎn)纖溶酶菌株接入LB培養(yǎng)液中，25 ℃、140 r/min，培養(yǎng)15～18 h；同時(shí)接入LB固體培養(yǎng)基內(nèi)，25 ℃，培養(yǎng)1～5 d，鏡檢。分別在顯微鏡下觀察液體內(nèi)菌絲和固體培養(yǎng)的菌株生長狀態(tài)。

1.3.11 菌株生理生化鑒定

參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》鑒定方法進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.12 菌株的16S rRNA鑒定

16S rRNA序列的測定由寶生物工程（大連）有限公司完成。將拼接好的序列于CNBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast對比得到相近菌株，根據(jù)同源性選取模式菌株通過MEGA 5.1用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap檢測1 000次[9]。

1.3.13 目標(biāo)菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)

MY0504的發(fā)酵液用0.45 μm濾膜過濾除菌，得到透明發(fā)酵濾液。采用3類菌株進(jìn)行發(fā)酵濾液的抑菌試驗(yàn)。致病菌：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌；益生菌：納豆芽孢桿菌、酵母菌；霉菌：黃曲霉、木霉、黑曲霉。實(shí)驗(yàn)方法按照牛津杯抑菌法[10]。

1.3.14 常用抗生素對目標(biāo)菌株的抑制作用

將MY0504菌株的孢子用接種環(huán)挑取少部分在10 mL無菌水中稀釋，高速搖勻，備用。將100 mL PB培養(yǎng)基化開降溫到45 ℃左右，加入2 mL備用的孢子菌液，搖勻，鋪平板。配制青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、桿菌肽溶液，取10 μL點(diǎn)到上述平板上，24 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，測定抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本的直接涂布菌落特點(diǎn)

海水和海泥樣本的總體菌落分布和菌落特征如表3所示。海水的樣本直接涂布后，第2天可見芽孢類細(xì)菌，其生長速度快，菌落大，顏色分別是無色和棕紅色；第3天可見小的細(xì)菌菌落，菌落小而圓，透明，鏡檢為弧菌。再繼續(xù)培養(yǎng)到5～6 d，在細(xì)菌菌落外出現(xiàn)白色霉菌菌絲；未見到放線菌落。海泥的樣本菌落數(shù)在106稀釋涂布后，菌落以芽孢類細(xì)菌為主，可能由于稀釋倍數(shù)太高，所以沒發(fā)現(xiàn)其他細(xì)菌、霉菌和放線菌。

表3 海水和海泥樣本的直接涂布菌落分類情況Table 3 Colonies classification of seawater and seamud samples by direct spreading method

由表3可知，芽孢類細(xì)菌是海洋樣本中的主要菌群，這可能與采樣區(qū)域距海岸較近、并且水深在10多米左右有關(guān)，該菌群推測應(yīng)該是陸地微生物的海洋水域延伸。霉菌由于對碳源挑剔，喜歡酸性環(huán)境，所以在海洋樣本中較少；放線菌類由于太少，在海水直接涂布情況下不能篩出。針對海洋微生物的篩選，首先要去除陸地微生物的延伸擴(kuò)散影響，然后采取誘導(dǎo)或富集手段，才能得到目標(biāo)微生物。海泥樣本的芽孢菌菌落數(shù)大約是海水的106～107倍。

2.2 海泥樣本加入抑制劑后的篩選結(jié)果

圖1 重鉻酸鉀對海泥菌落數(shù)量的抑制作用Fig.1 The suppression effect of potassium dichromate on the quantity of colony from sea mud

海泥樣本直接涂布數(shù)量太多，加入抑制劑K2Cr2O7后的菌落數(shù)量變化如圖1所示。由圖1可知，菌落數(shù)量隨著K2Cr2O7質(zhì)量濃度增高，菌落數(shù)呈近似級數(shù)降低，在K2Cr2O7質(zhì)量濃度500 μg/mL時(shí)菌落數(shù)量降至原來的25%左右。本實(shí)驗(yàn)采取800 μg/mL K2Cr2O7的質(zhì)量濃度來降低菌落數(shù)量，海泥樣本的菌落數(shù)可以降低到原來的5%左右。K2Cr2O7的抑菌效果與高氧化還原電位有關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道K2Cr2O7的含量達(dá)到2.5%時(shí)處理18 h，芽孢桿菌均可以被殺滅，但是對放線菌等的抑菌效果較小[11]。

2.3 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選結(jié)果

通過海泥樣本的蛋白酶平板篩選，發(fā)現(xiàn)3類菌株具有透明圈，通過鏡檢和外觀分辨，基本確定為表3中的兩種芽孢菌和弧形菌具有蛋白酶活性，結(jié)果見圖2。

圖2 牛奶蛋白平板菌落的生長狀況Fig.2 The growth state of colonies in milk-protein plate

由圖2可知，將單菌落菌株在纖溶酶平板上劃線培養(yǎng)，均沒有纖維蛋白溶解圈，這說明產(chǎn)蛋白酶的菌株均不能產(chǎn)纖溶酶。同時(shí)也從側(cè)面證明了酪蛋白篩選平板只能用作產(chǎn)蛋白酶菌株篩選，不能用于產(chǎn)纖溶酶菌株的篩選，而用纖維蛋白篩選平板比較合適。

2.4 產(chǎn)纖溶酶菌株的條件篩選

海泥樣本通過K2Cr2O7篩選后，芽孢桿菌數(shù)量大幅度減少，并在模擬海水的高鹽環(huán)境中長時(shí)間培養(yǎng)后，一些不耐高鹽環(huán)境的菌落被排除，這將有助于海洋菌株的篩選。纖維蛋白通常是相同二級結(jié)構(gòu)的多肽鏈，不同動(dòng)物之間的血纖肽可能氨基酸序列有差別，但是其支架結(jié)構(gòu)的連接鍵大同小異，這也是纖溶酶的作用位點(diǎn)[12]。由于海水環(huán)境營養(yǎng)匱乏，采取加入纖維蛋白誘導(dǎo)物，可能會(huì)提高篩選得到分泌纖溶酶菌株的幾率。

結(jié)果顯示，在纖維平板培養(yǎng)4 d后長出了不同于先前菌落的似放線菌株，命名為MY0504，并且菌落邊緣有明顯的透明圈，結(jié)果見圖3（照片為培養(yǎng)平板的背部圖），上部為MY0504菌株的透明圈，下部棕紅色為棕紅色芽孢菌株，周邊無透明圈，說明不能產(chǎn)生纖溶酶。

目標(biāo)菌株MY0504在LB培養(yǎng)基上生長旺盛，結(jié)果見圖4。該試驗(yàn)證明采用添加抑制劑除去非目標(biāo)菌株和附加纖維蛋白誘導(dǎo)目標(biāo)菌株培養(yǎng)兩種方法相結(jié)合，從海泥樣本中可以篩選得到產(chǎn)纖溶酶的微生物菌株。目標(biāo)菌株的篩選采用單一手段比較困難，一般都要采取兩種以上的附加方法，可以大大提高目標(biāo)菌株的篩選幾率[13]。

圖3 纖維蛋白平板的菌落生長狀況Fig.3 The growth state of colonies in fibrin plate

圖4 MY0504在LB培養(yǎng)基上的生長狀況Fig.4 The growth state of strain MY0504 in LB culture

2.5 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 分離株MY0504的生理生化特性Table 4 Biochemical and physiological characteristics of isolated strain MY0504

通過系列實(shí)驗(yàn)測定[14-15]，該菌株培養(yǎng)條件為溫度15～40 ℃，pH 6～14，NaCl 1%～10%。其他生理生化指標(biāo)見表4。由表4可知，該菌株基本不利用淀粉和纖維素等碳源，可以利用銨基做氮源，分解碳源的酶系較少，分解氮源的酶相對較多。

2.6 電鏡觀察

圖5 MY05054菌株孢子絲的電鏡圖Fig.5 Electron micrographs of strain MY0504 spores

目標(biāo)菌株MY0504的孢子絲電鏡觀察結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，目標(biāo)菌株MY0504孢子表面光滑，無刺有褶皺；孢子絲無螺旋，但是有分支。由菌絲狀態(tài)可以確定該菌株不屬于諾卡氏菌屬、動(dòng)孢菌屬、間孢囊菌屬和多形態(tài)放線菌屬，應(yīng)該屬于鏈霉菌屬或北里孢菌屬[16]。

2.7 目標(biāo)菌株的分子生物學(xué)鑒定

目標(biāo)菌株MY0504的16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果電泳圖見圖6。由圖6可知，其基因序列包含1 406 bp。菌株菌株MY0504測序結(jié)果見圖7，序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行Blast，對比發(fā)現(xiàn)菌株MY0504與鏈霉菌屬（Streptomyces）菌株高度相關(guān)，認(rèn)定該菌株屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），該菌株與S.albusNBRC 13689、S.canescens、S.canescens1、S.coelicolor、S.albidoflavus、S.limosus有較近的親緣關(guān)系。

圖6 MY0504菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification results of strain MY0504

圖7 菌株16S rDNA 用NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences from strain isolates using the Neighbor-Joining method

2.8 目標(biāo)菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3類菌都在牛津杯周圍正常生長，沒有任何抑菌圈出現(xiàn)，說明MY0504基本不產(chǎn)抗生素。該菌株發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶，如果發(fā)酵液中含有抗生素成分，會(huì)影響其藥物開發(fā)應(yīng)用，所以該菌株不產(chǎn)抗生素成分利于菌株在纖溶酶方面的開發(fā)應(yīng)用。

2.9 常用抗生素對目標(biāo)菌株的抑制作用

抗生素周邊某一直徑的抑菌圈表示對藥物敏感，小于或沒有說明該菌株對抗生素有抗性。采用Kirby-Bauer的檢測方法，參照各抗生素的敏感直徑得出MY0504的敏感程度如表5所示。由表5可知，該菌株對這5種抗生素比較敏感，所以該菌株的實(shí)驗(yàn)開發(fā)等是相對安全的，不會(huì)引起不可控制的感染等，這也利于該菌株的纖溶酶發(fā)酵應(yīng)用。

表5 菌株MY0504對常用抗生素的敏感程度Table 5 The sensitivity of strain MY0504 to general antibiotics

3 結(jié)論

本研究采用低營養(yǎng)、長時(shí)間的培養(yǎng)，同時(shí)只提供纖維蛋白做為營養(yǎng)誘導(dǎo)物，篩選得到了產(chǎn)纖溶酶的鏈霉菌菌株MY0504。

通過16S rRNA鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)和電鏡觀測，綜合鑒定MY0504屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）菌株，該菌株與S.albusNBRC 13689、S.canescens、S.canescens1、S.coelicolor、S.albidoflavus、S.limosus有較近的親緣關(guān)系。

通過抗生素抑制法發(fā)現(xiàn)，該菌株基本不產(chǎn)抗生素成分，同時(shí)對常用抗生素比較敏感，所以采用MY0504菌株開發(fā)纖溶酶是比較合適的。

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