2種復(fù)方制劑對中華鱉非特異性免疫功能的作用效果

周冬仁，羅毅志，葉雪平，潘曉藝，陳建明，沈斌乾

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州313001）

中華鱉分布于中國、日本、越南北部、韓國、泰國等，浙江地區(qū)中華鱉養(yǎng)殖主要以日本品系及太湖品系為主。中華鱉生長緩慢，抗病力強，對自然生活環(huán)境要求較高。在人工養(yǎng)殖條件下，受到高密度、水質(zhì)惡化、溫室等條件的影響，鱉抗病力下降，病害嚴重。目前，腮腺炎、白底板、胃穿孔、紅底板等疾病在中華鱉生產(chǎn)中較為常見［1］。養(yǎng)殖戶高頻度、高劑量使用各類化學(xué)藥物和抗生素，使病害得到一定程度的扼制，但對養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量安全造成了負面影響，不利于中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，在探索治療手段的同時，提高中華鱉自身的免疫力和抗病力，也是解決中華鱉病害防控的有效途徑之一。

中華鱉屬于低等爬行綱動物，沒有完善的免疫系統(tǒng)，非特異性免疫在系統(tǒng)發(fā)育上比特異性免疫早，與高等脊椎動物相比，中華鱉在防御疾病時更依賴于非特異性免疫。中華鱉的非特異性免疫功能不僅是防御疾病的第一道屏障，更在整個免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用［2］。目前，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的免疫增強劑有甘草多糖、酵母細胞壁、脂多糖、黃芪多糖、穿心蓮提取物、半胱胺等。中草藥提取物及多糖能增強水產(chǎn)動物的非特異性免疫功能，作為免疫增強劑目前已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖［3］。覃川杰等［4］研究表明，茯苓多糖對中華鱉的非特異性免疫功能有增強作用。孟兆娜等［5］研究表明，復(fù)方中藥添加劑可以增強鏡鯉血清轉(zhuǎn)氨酶及紅細胞抗氧化酶活性。施偉達等［6］研究表明，植物免疫增強劑對中華鱉肝臟SOD和CAT 酶活性的改善有明顯作用。為評價芪草多糖、金蓮免疫散復(fù)方制劑對中華鱉非特異性免疫功能的影響，筆者于2013年年末在湖州中湖農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司進行了2種復(fù)方制劑對中華鱉幾種非特異性免疫功能的影響試驗，以期為中草藥復(fù)方制劑在中華鱉養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 中華鱉及飼養(yǎng)池

試驗中華鱉為孵出的同一批稚鱉。在同一個溫室大棚內(nèi)隨機選取9個條件相同的飼養(yǎng)池，每池放養(yǎng)1 000只。每個飼養(yǎng)池面積25m2，池深1．2m，池底呈圓鍋底狀，中間為排污口，水深0．7 m，中央設(shè)8m2的石棉瓦投食臺。

1．2 中草藥免疫制劑

芪草多糖：以黃芪多糖、甘草多糖、金銀花為主要原料配制。金蓮免疫散：以金銀花、穿心蓮、大青葉和虎杖等的提取物為主要原料配制。將原料70℃烘干12h，粉碎至80目，按配方比例配制后混勻，由浙江省淡水水產(chǎn)研究所生物制劑廠提供。

1．3 飼養(yǎng)管理

隨機將9個飼養(yǎng)池分為3組，對照組：飼喂商品稚鱉飼料（CP47）；芪草多糖組：飼喂商品稚鱉飼料＋芪草多糖2g／kg；金蓮免疫散組：飼喂商品稚鱉飼料＋金蓮免疫散2g／kg。中華鱉放養(yǎng)后，先用商品稚鱉飼料馴食3 周后正式試驗，試驗期60d。投喂飼料均為現(xiàn)用現(xiàn)配的軟顆粒，開始時粒徑為1．5mm，30d后粒徑為2mm。每天喂食2次，試驗初期投飼率約為體重的6%，30d后降為4%。試驗期間，每周從中間排污口少量排出污水，并加注新水，換水約10%。水溫控制在31℃左右。

1．4 血清采集及指標測定

試驗61d時每池隨機撈取中華鱉3只，用丁香酚麻醉后擦干體表水分，用止血鉗拉住頭部，手術(shù)剪剪開頸部血管，采取血液儲存于采血管內(nèi)，于37℃放置2h，待血清完全析出后置于4℃冰箱中備用。

血清超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性：采用黃嘌呤氧化酶法測定。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）和堿性磷酸酶（AKP）活性：用試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）測定。溶菌酶（Lysozyme）活性：溶菌酶標準品購于SIGMA 公司，用0．1 mol／L PBS 將微球菌（南京建成生物技術(shù)研究所）配制成0．2mg／mL 菌懸液，每個樣品取血清0．05mL加入到3．0mL 菌懸液中混勻，立即在550nm 下測定A0值；然后在28℃水浴中溫育30min，置于4℃冰浴8 min 終止反應(yīng)，再測定550nm下的A 值計算溶菌酶活性。

溶菌酶活性＝（A0－A）／A。

1．5 抗菌力測定

腹腔注射嗜水氣單胞菌菌液濃度為1×109cfu／mL，每只中華鱉注射劑量為0．1 mL，放養(yǎng)于同樣規(guī)格的缸中，每天觀察死亡情況，觀察15d，統(tǒng)計死亡率，計算攻毒存活率。每個平行試驗做3組，每組15只。

攻毒存活率＝（1－死亡數(shù)／總數(shù)）×100%。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以均值±標準誤（Mean±SE）表示。用SPSS11．5 軟 件 進 行 單 因 子 方 差 分 析（One－way ANOVA），檢驗不同組間各指標是否存在顯著性差異，若有顯著差異（P＜0．05），則作Duncan 氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2．1非特異性免疫酶的活性

從表1看出，中華鱉的堿性磷酸酶活性金蓮免疫散組為8．44 U／mL，顯著高于對照組；芪草多糖組為7．79U／mL，與對照組和金蓮免疫散組間差異均不顯著。超氧化物歧化酶活性金蓮免疫散組、芪草多糖組分別為112．88 U／mL 和116．54 U／mL，均顯著高于對照組，金蓮免疫散組與芪草多糖組間差異不顯著。谷胱甘肽過氧化物酶活性各組間差異不顯著。溶菌酶活性金蓮免疫散組、芪草多糖組均為0．85IU／mL，均顯著高于對照組，金蓮免疫散組與芪草多糖組間差異不顯著。

表1 試驗各組中華鱉非特異性免疫酶的活性Table 1 Effect of two compound preparations on nonspecific immune enzyme activity of T．Sinensis

表2 試驗各組中華鱉攻毒15d內(nèi)的存活率Table 2 Survival rate of different treatments within 15dof T．Sinensis

2．2 抗菌力

從表2看出，金蓮免疫散組中華鱉15d內(nèi)的平均存活率為71．11%，芪草多糖組為68．89%，對照組為55．33%，金蓮免疫散組、芪草多糖組分別比對照組高15．78百分點和13．56百分點，但各組間差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

1）超氧化物歧化酶（SOD）是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，是反映動物機體非特異性免疫功能的重要生理指標。超氧化物歧化酶廣泛存在于生物體內(nèi)，是一切需氧有機體清除超氧陰離子自由基、保護機體免受傷害的一種關(guān)鍵金屬酶，其活性與動物的免疫水平密切相關(guān)，是重要的抗氧化酶之一［7］。試驗結(jié)果表明，在飼料中添加復(fù)方中草藥制劑后，中華鱉血清中超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組（P＜0．05），但金蓮免疫散組和芪草多糖組間差異不顯著（P＞0．05）。

2）溶菌酶（Lysozyme）又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase）或N－乙 酰 胞 壁 質(zhì) 聚 糖 水 解 酶（N－acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶［8］。主要通過破壞細胞壁，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解，溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活［9］。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，測定中華鱉的溶菌酶活性，可以在一定程度上反映其非特異性體液免疫狀態(tài)。試驗結(jié)果表明，飼料中添加復(fù)方制劑金蓮免疫散、芪草多糖能顯著（P＜0．05）提高溶菌酶的活性。

3）谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）是機體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶。趙燕等［10］研究表明，口服半胱胺能提高中華鱉谷胱甘肽過氧化物酶的活性。王宏芳等［11］研究表明，松茸多糖能提高小鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶的活性。試驗結(jié)果表明，金蓮免疫散和芪草多糖復(fù)方制劑對中華鱉谷胱甘肽過氧化物酶活性無顯著影響，具體原因有待于進一步試驗證實。

4）堿性磷酸酶（AKP）是一組同功酶，可作為判斷水產(chǎn)動物免疫能力的參考指標。試驗結(jié)果表明，金蓮免疫散能顯著提高中華鱉的堿性磷酸酶活性，芪草多糖也能提高其活性。與劉巖等［12］用甘露糖醛酸多糖注射對蝦，王明華等［13］用中草藥煎液投喂日本沼蝦的結(jié)果一致。表明，金蓮免疫散、芪草多糖對中華鱉具有免疫增強作用。

5）試驗結(jié)果表明，金蓮免疫散組、芪草多糖組的攻毒存活率分別比對照組高15．78 百分點和13．56百分點，證明金蓮免疫散、芪草多糖制劑能提高中華鱉的非特異性免疫功能。

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