煉油廢水中異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選

武文麗，顏家保，紀南南，曹曉詩，胡茜茜，吳 優(yōu)

（武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081）

煉油廢水中異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選

武文麗，顏家保，紀南南，曹曉詩，胡茜茜，吳 優(yōu)

（武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081）

從煉油廢水活性污泥中篩選出一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6。對篩選菌株進行了生理生化實驗和菌種鑒定，考察了碳源種類、培養(yǎng)基的m（C）∶m（N）、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響；并對其NH3-N去除性能進行了考察。經(jīng)鑒定，該菌為鮑曼不動桿菌，適宜的培養(yǎng)條件為：以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度30℃、初始pH 9.0、m（C）∶m（N）=10、接種量2.0%。在此條件下培養(yǎng)20 h，可將NH3-N質(zhì)量濃度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L，平均NH3-N去除速率為11.79 mg/（L·h）。WY6菌可在32 h內(nèi)將實際煉油廢水的NH3-N質(zhì)量濃度由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達98.4%，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

煉油廢水；氨氮；異養(yǎng)硝化-好氧反硝化；菌種篩選

煉油廢水含有烴類化合物及其衍生物、酚類、雜環(huán)化合物、硫化物和氨氮等多種污染物，廢水量大，組分復(fù)雜，難降解有機物多，COD含量較高［1］。煉油廢水一般采用隔油—氣浮—生化的處理工藝［2］，COD去除效果較好，但廢水中NH3-N的脫除效果常常不穩(wěn)定，生化過程硝化率低，造成生化后出水ρ（NH3-N）超標，不得不增加生物接觸氧化池和生物曝氣濾池等裝置進一步處理，提高了廢水的處理成本。煉油廢水生物處理系統(tǒng)的硝化率較低有多方面原因，最主要的可能是某些毒性有機物對自養(yǎng)硝化菌的抑制。而異養(yǎng)硝化菌能利用有機碳源，可消除有機物的抑制作用，從而提高煉油廢水的硝化效果，并達到同時脫碳脫氮的目的。

本工作從煉油廢水生物處理活性污泥中分離得到異養(yǎng)硝化-好氧反硝化高效菌，對篩選菌株進行了生理生化實驗和菌種鑒定，考察了碳源種類、培養(yǎng)基的m（C）∶m（N）、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響；并對其NH3-N去除性能進行了考察，旨在為煉油廢水的新型生物脫氮技術(shù)提供依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 材料和儀器

活性污泥：取自中國石化武漢分公司煉油廢水生化處理裝置。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，pH=7.1～7.5，加蒸餾水定容至1 L。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：丁二酸鈉9.54 g，Na2HPO4·12H2O 8.0 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO40.1 g，F(xiàn)eSO40.01 g，微量元素儲備液2 mL，pH=7.0～7.3，用蒸餾水定容至1 L。

微量元素儲備液：組成見文獻［3］。

反硝化培養(yǎng)基：用0.15 g KNO3替代（NH4）2SO4，其余組分同異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基。

實際廢水：中國石化武漢分公司排水車間氣浮隔油后的煉油廢水，COD=600～800 mg/L，ρ（NH3-N）=60～80 mg/L，pH=8～9。

所用試劑除酵母提取物、蛋白胨外，其余均為分析純。

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；QYC21型恒溫搖床：上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；752N型紫外-可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；1-14型小型離心機：德國SIGMA公司。SA3500-85型雙目顯微鏡：北京泰克儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的富集和篩選

取少量活性污泥接種于LB培養(yǎng)基中活化，然后轉(zhuǎn)接至異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中多次馴化，對馴化后的菌液進行梯度稀釋，采用平板劃線法進行純化，得到異養(yǎng)硝化菌株；對篩選出的菌株進行硝化性能測試，將硝化能力較好的菌株再接種至好氧反硝化培養(yǎng)基中多次馴化，再經(jīng)分離純化得到同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的菌株。

1.2.2 菌種鑒定

選取篩選得到的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能最好的一株細菌作為高效菌，進行菌種鑒定和特性研究：依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［4］進行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗；用溶菌酶-CTAB-蛋白酶K法［5］提取DNA，委托北京鼎國生物技術(shù)有限公司進行16S rDNA序列分析。

1.2.3 培養(yǎng)條件的選擇

將篩選所得高效菌接入LB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的菌液離心，收集菌體，再用無菌水洗滌2次，然后將菌體重懸浮于無菌水中，調(diào)節(jié)菌體濃度，使菌液于600 nm處的光密度約等于1，制成菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將菌懸液按一定接種量（φ，%）接種至以NH3-N為唯一氮源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，ρ（NH3-N）=212.02 mg/L，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)，分別考察碳源種類、m（C）∶m（N）、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響。

1.2.4 煉油廢水中NH3-N的降解

將篩選得到的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌按一定接種量接種于100 mL氣浮后的實際煉油廢水中，考察菌株在最佳培養(yǎng)條件下對實際廢水中NH3-N的去除效果。

1.3 分析方法

細菌生長量采用光密度法測定［6］；ρ（NH3-N）采用納氏試劑分光光度法測定［7］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種鑒定

經(jīng)分離純化，獲得12株同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的菌株。選取1株硝化和反硝化綜合性能最好的菌株（命名為WY6）進行研究。在異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上，WY6菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊，無水溶性色素產(chǎn)生，革蘭氏染色呈陰性。該菌不能水解淀粉和明膠，產(chǎn)生H2S；甲基紅反應(yīng)呈陽性，而二乙酰反應(yīng)、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖產(chǎn)酸實驗呈陰性。WY6菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色菌體的顯微鏡照片見圖1。

菌株WY6通過16S rDNA測序后，將所得堿基序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，并用MEGA 5.0軟件計算序列的系統(tǒng)進化距離，構(gòu)建菌株WY6的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。由圖2可見，在進化過程中與菌株WY6親緣關(guān)系最近的均為鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）。結(jié)合WY6的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征，將其鑒定為鮑曼不動桿菌。

圖1 WY6菌的菌落形態(tài)（a）和革蘭氏染色菌體（b）的顯微鏡照片

圖2 菌株WY6的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 培養(yǎng)條件

2.2.1 碳源

WY6為異養(yǎng)硝化菌，可以利用培養(yǎng)基或廢水中的有機碳源。在m（C）∶m（N）=8、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，將WY6分別接種至以葡萄糖、蔗糖、乳糖、丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，考察碳源種類對NH3-N去除效果的影響。碳源種類對ρ（NH3-N）的影響見圖3。由圖3可見：分別以丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源時，ρ（NH3-N）下降速率最快，以蔗糖為碳源時居中，以葡萄糖、乳糖為碳源時最慢；當(dāng)以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)時間為26 h時，ρ（NH3-N）由212.02 mg/L 降至8.52 mg/L。這可能是因為WY6菌能直接利用丁二酸鈉和檸檬酸鈉，而以葡萄糖、乳糖為碳源時，還原性糖與氨類物質(zhì)在高壓蒸汽滅菌時會在高溫條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，部分生成難以利用的大分子物質(zhì)的緣故［8］。因此，WY6菌適宜的碳源為丁二酸鈉，這與陳趙芳等［9-10］的研究結(jié)果類似。

圖3 碳源種類對ρ（NH3-N）的影響

2.2.2 m（C）∶m（N）

Joo等［11］的研究結(jié)果表明，m（C）∶m（N） 是影響異養(yǎng)硝化菌NH3-N去除效果的重要因素。在以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，m（C）∶m（N）對ρ（NH3-N）的影響見圖4。由圖4可見：m（C）∶m（N）越高，NH3-N去除效果越好，反之則越差；當(dāng)m（C）∶m（N）大于10時，3條ρ（NH3-N）去除曲線幾乎重合。說明有機碳源是WY6菌生長的限制性因素，碳源越豐富越有利于NH3-N的去除。因此在后續(xù)實驗中，m（C）∶m（N）取為10。

圖4 m（C）∶m（N）對ρ（NH3-N）的影響

2.2.3 培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)溫度主要影響微生物酶的活性，從而影響其生長和代謝［12］。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）=10、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，培養(yǎng)溫度對ρ（NH3-N）的影響見圖5。

圖5 培養(yǎng)溫度對ρ（NH3-N）的影響

由圖5可見：培養(yǎng)溫度為20～30 ℃時，隨培養(yǎng)溫度的升高，NH3-N去除效果變好；當(dāng)培養(yǎng)溫度進一步升高至37 ℃時，NH3-N去除效果變差。這可能是由于酶的活性受到一些抑制，使NH3-N的去除速率放緩。由此可見，WY6菌適宜的培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.2.4 接種量

接種量的大小影響細菌在培養(yǎng)基中的生長繁殖速率，采用較大的接種量可以縮短細菌達到對數(shù)生長期的時間，但接種量過大容易引起溶氧不足，而且也不經(jīng)濟；相反，接種量過小則會延長細菌的延滯期。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）= 10、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1的條件下，接種量對ρ（NH3-N）的影響見圖6。由圖6可見，接種量在2.0%～10.0%范圍內(nèi)的NH3-N去除效果相差不大?？紤]到方法的經(jīng)濟性，將WY6菌接種量定為2.0%。

圖6 接種量對ρ（NH3-N）的影響

2.2.5 初始pH的影響

溶液酸堿度是影響硝化作用的重要因素［13］。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）=10、培養(yǎng)溫度為30 ℃、接種量為2.0%的條件下，初始pH對ρ（NH3-N）的影響見圖7。

圖7 初始pH對ρ（NH3-N）的影響

由圖7可見：初始pH在4.0～9.0范圍內(nèi)時，提高初始pH可加快NH3-N的去除，即弱堿性區(qū)間內(nèi)的NH3-N去除速率較中性及弱酸性區(qū)間快，這是由于弱酸性不利于細菌的生長，導(dǎo)致NH3-N的去除速率緩慢；在初始pH為9.0、培養(yǎng)時間為20 h時，ρ（NH3-N）由245.46 mg/L 降至9.71 mg/L，平均NH3-N去除速率為11.79 mg/（L·h）。實驗結(jié)果表明，WY6菌適宜的初始pH與實際廢水的pH較為接近，方便該菌的實際應(yīng)用。

2.3 WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果

在最佳條件下，WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果見圖8。由圖8可見：WY6菌能很快適應(yīng)實際廢水環(huán)境，且接種量為0.5%和2.0%時NH3-N的去除效果相當(dāng)；當(dāng)接種量為0.5%時，煉油廢水經(jīng)32 h處理后，ρ（NH3-N）由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達98.4%。該菌表現(xiàn)出良好的硝化能力和潛在的應(yīng)用前景。

圖8 WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果

3 結(jié)論

a）通過硝化培養(yǎng)基富集、馴化，從煉油活性污泥中篩選出一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6，經(jīng)鑒定為鮑曼不動桿菌。

b）菌株WY6的適宜培養(yǎng)條件為：以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 9.0、培養(yǎng)基的m（C）∶m（N）=10、接種量2.0%。在此條件下培養(yǎng)20 h，可將NH3-N質(zhì)量濃度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L，NH3-N平均去除速率為11.79 mg/（L·h）。

c）WY6菌對實際煉油廢水具有良好的NH3-N去除能力，可在32 h內(nèi)將NH3-N質(zhì)量濃度由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達98.4%，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

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（編輯 葉晶菁）

Screening of Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification Strain from Refinery Wastewater

Wu Wenli，Yan Jiabao，Ji Nannan，Cao Xiaoshi，Hu Xixi，Wu You
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

A heterotrophic nitrif i cation-aerobic denitrif i cation bacteria strain WY6 was isolated from activated sludge in the refinery wastewater treatment system. The WY6 was characterized and identified by physiological and biochemical experiments. The effects on nitrif i cation ability of the strain were studied，such as carbon source，m（C）∶m（N） of the medium，culture temperature，initial pH and inoculation amount. And its NH3-N removal ability was also investigated. The identif i cation results show that WY6 is a strain of Acinetobacter baumannii，and the suitable culture conditions for it are as follows：using sodium succinate as carbon source，culture temperature 30 ℃，initial pH 9.0，m（C）∶m（N）=10，inoculation amount 2.0%. When the ref i nery wastewater has treated under these conditions for 20 h，the NH3-N mass concentration can be decreased from 245.46 mg/L to 9.71 mg/L with 11.79 mg/（L·h） of average ammonia removal speed. After treated for 32 h by strain WY6，the NH3-N mass concentration of the actual ref i nery wastewater can be decreased from73.74 mg/L to 1.15 mg/L with 97.8% of NH3-N removing rate，which shows a good application prospect.

refinery wastewater；ammonia nitrogen；heterotrophic nitrification-aerobic denitrification；strain screening

X172

A

1006-1878（2015）04-0354-05

2015 - 03 - 18；

2015 - 04 - 29。

武文麗（1990—），女，甘肅省白銀市人，碩士生，電話 18971048322，電郵 121135637@qq.com。聯(lián)系人：顏家保，電話 18062689295，電郵 yanjb9198@126.com。

武漢科技大學(xué)研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金重點項目（JCX0006）；武漢科技大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310488009）。