線粒體自噬調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

王志舒 譚曉榮 劉洹洹

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

線粒體自噬調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

王志舒 譚曉榮 劉洹洹

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

線粒體為細(xì)胞正常生命運(yùn)動(dòng)提供能量和物質(zhì)；然而各種因素會(huì)導(dǎo)致線粒體損傷，衰老及功能紊亂，它們是細(xì)胞潛在的危險(xiǎn)因素，必需及時(shí)清除，線粒體自噬可以起到這一作用，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于惡劣環(huán)境時(shí)，線粒體自噬可通過降解線粒體補(bǔ)充生命必需物質(zhì)，從而度過危機(jī)維持生存。另外線粒體自噬會(huì)在某些情況下通過降解正常線粒體來維持線粒體質(zhì)量和數(shù)量的平衡。不同生物中具有不同的線粒體自噬途徑和機(jī)制，酵母中主要通過Atg32磷酸化調(diào)控線粒體自噬；哺乳動(dòng)物中則存在分別由Parkin-PINK1、Nix、FUNDC1等不同蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬調(diào)控機(jī)制；植物線粒體自噬的研究主要集中在擬南芥，其途徑及具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。綜述了近年來酵母、動(dòng)物和植物中線粒體自噬的作用機(jī)制及調(diào)控因子等方面的研究進(jìn)展。

線粒體自噬；酵母；哺乳動(dòng)物；植物

1 自噬

1.1 自噬的過程及分類

自噬具有保守性，存在于大部分真核細(xì)胞中。營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧化脅迫、鹽脅迫或感染等不利條件，均會(huì)誘導(dǎo)自噬發(fā)生。根據(jù)包裹物和運(yùn)輸方式的不同，可以將自噬分為巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）、分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperonemediated autophagy），后面提到的自噬均指巨自噬。其大概過程是，首先在胞質(zhì)中形成一個(gè)獨(dú)立的雙層膜結(jié)構(gòu)——吞噬泡，在各種蛋白質(zhì)的協(xié)助下延伸，最終包裹胞質(zhì)，向溶酶體（動(dòng)物）或液泡（植物和酵母）移動(dòng)并與其融合，所包裹的物質(zhì)在水解酶的作用下降解成小分子物質(zhì)，再釋放到胞質(zhì)中被重新利用［1，2］。根據(jù)其對(duì)降解對(duì)象的選擇性，可分為非選擇性自噬和選擇性自噬。前者非選擇性的降解胞質(zhì)中的成分，后者選擇性的降解細(xì)胞器和蛋白質(zhì)。選擇性自噬主要包括Cvt（Cytoplasm to vacuole targeting）途徑、線粒體自噬（Mitophagy）、過氧化酶體自噬（Peroxisome）等。

1.2 線粒體自噬

線粒體是胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源，包括超氧陰離子（O2.-）、過氧化氫（H2O2）等。當(dāng)線粒體受到ROS攻擊，其DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)損傷時(shí)，線粒體的電子傳遞鏈發(fā)生異常，可能會(huì)導(dǎo)致ROS的進(jìn)一步積累及線粒體損傷。受損、衰老、功能紊亂的線粒體破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，可能導(dǎo)致ATP無法水解，產(chǎn)生過量ROS，并釋放死亡相關(guān)蛋白［3］，非常危險(xiǎn)，必需及時(shí)清除，而線粒體自噬正好可以實(shí)現(xiàn)這一功能。

線粒體自噬是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，能夠維持線粒體質(zhì)量和數(shù)量的平衡，在饑餓及惡劣條件下維持細(xì)胞生存，并具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等功能［4］。例如，線粒體分裂時(shí)產(chǎn)生的一些子代線粒體膜電位較低，功能紊亂，會(huì)優(yōu)先被線粒體自噬降解［5］。線粒體自噬可以通過清除一部分線粒體而維持細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量和質(zhì)量的平衡。線粒體自噬不僅清除受損的線粒體，也會(huì)降解正常的線粒體，當(dāng)細(xì)胞處于惡劣環(huán)境時(shí)，線粒體數(shù)量過多會(huì)加重運(yùn)行的負(fù)擔(dān)，此時(shí)會(huì)降解正常的線粒體而維持生存［6］。

在酵母、植物和動(dòng)物中，均存在線粒體自噬，其誘導(dǎo)和調(diào)控機(jī)制有相似之處也各有不同。酵母線粒體自噬始于位于液泡附近的自噬體組裝位點(diǎn)/自噬吞噬前體（Pre-autophagosomal structure/Phagophore assembly site，PAS），且PAS只存在于酵母中，通過磷酸化自噬相關(guān)基因ATG32（AuTophaGy（ATG）-related genes），使PAS定位到特定線粒體。哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞中Nix具有相似于ATG32的作用，且與ATG32具有相似序列，介導(dǎo)體細(xì)胞受損線粒體降解和網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中線粒體的清除。同時(shí)PINK1和E3連接酶Parkin以及FUNDC1也可以調(diào)控受損線粒體清除途徑［7］。不同條件下線粒體自噬的誘導(dǎo)方式不同，不同類型細(xì)胞中的線粒體自噬機(jī)制也不同。對(duì)于植物中的線粒體自噬的研究還很少。研究表明擬南芥中也存在TOR基因，且對(duì)自噬起負(fù)調(diào)控作用［8］，但是線粒體自噬調(diào)控因子尚不清楚。另有研究表明氧化脅迫不僅誘導(dǎo)小麥根細(xì)胞發(fā)生巨自噬，而且會(huì)誘導(dǎo)其發(fā)生線粒體自噬，降解受損及產(chǎn)生過量ROS的線粒體，而這可能是細(xì)胞在氧化脅迫條件下生存的策略之一［9］。目前植物線粒體自噬相關(guān)機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究［4］。

2 線粒體自噬調(diào)控機(jī)制

2.1 酵母線粒體自噬調(diào)控機(jī)制

酵母線粒體自噬主要由ATG32介導(dǎo)，ATG32是酵母線粒體外膜蛋白，由529個(gè)氨基酸組成，推測(cè)具有單一的跨膜結(jié)構(gòu)，其N端和C端分別暴露在胞質(zhì)和線粒體間質(zhì)中［10］。ATG32與ATG8、 ATG11相互作用，構(gòu)成啟動(dòng)聚合體，啟動(dòng)線粒體自噬，尤其在氮饑餓條件下，ATG32-ATG11作用增強(qiáng)，誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生［11］。ATG32是酵母線粒體自噬所特有的，作為一種受體蛋白，ATG32磷酸化使線粒體自噬特異性的降解受損或多余的線粒體［4，11，12］。ATG32的敲除并不能影響非選擇性自噬、Cvt途徑、過氧化酶體自噬的發(fā)生，但完全抑制線粒體自噬的發(fā)生。線粒體受損后，線粒體膜ATG32上Ser-114與Ser-119磷酸化，尤其是Ser-114的磷酸化，介導(dǎo)了ATG32-ATG11復(fù)合體的形成和線粒體自噬。ATG32與 ATG11結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物，可以募集線粒體到PAS，一般認(rèn)為ATG32-ATG11的結(jié)合是線粒體降解的第一步。在募集線粒體過程中，ATG32同時(shí)與ATG8相互作用，其作用是促進(jìn)吞噬膜包裹線粒體［13］。酵母雙雜交和免疫沉淀反應(yīng)試驗(yàn)證明ATG32可以與ATG11和ATG8結(jié)合。ATG11是選擇性自噬中的一種銜接蛋白，與自噬小體上的受體蛋白識(shí)別定位。ATG8與吞噬泡的擴(kuò)張有關(guān)，而LC3（Light Chain 3）是ATG8在哺乳動(dòng)物中的同系物，且LC3參與自噬體膜來源和目標(biāo)識(shí)別過程［14］，ATG8與LC3分別與ATG19和p62結(jié)合，類似于酵母中的ATG8-PE的作用［15，16］。在ATG32 N-端裸露在胞質(zhì)的區(qū)域有一段WXXI/L/V序列（又稱為WQAI結(jié)構(gòu)域）［17］是ATG8結(jié)合域，同樣存在于ATG19、p62［18-20］。

2005年，已報(bào)道ATG11C端的第4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域與ATG19相互作用介導(dǎo)Cvt途徑的發(fā)生［21］，且其在真核生物中沒有同源序列［22］。2011年，Yoshimasa等［23］證明在線粒體自噬中，ATG11同一區(qū)域與磷酸化的ATG32相互作用，介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，通過控制ATG32磷酸化酶的活性或定位可以調(diào)控線粒體自噬。但是關(guān)于ATG32磷酸化酶還沒有相關(guān)的報(bào)道。當(dāng)ATG32缺失時(shí)，在利用非發(fā)酵性碳作為碳源時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)正常，且胞內(nèi)ROS水平不變，這意味著存在另一條不依賴于ATG32的線粒體自噬途徑［22］。

2.2 哺乳動(dòng)物線粒體自噬調(diào)控機(jī)制

2.2.1 Parkin和PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬機(jī)制 帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）相關(guān)基因中有兩個(gè)與線粒體自噬相關(guān)的基因，PINK1（PTEN-induced putative kinase protein 1，PINK1）和Parkin，分別由PARK2和PARK6編碼［24］，它們介導(dǎo)多細(xì)胞動(dòng)物中多種類型細(xì)胞線粒體自噬［25］，且更傾向于清除去極化線粒體。

PINK1介導(dǎo)有缺陷的線粒體清除。在正常線粒體中，PINK1（64 kD）的表達(dá)量維持在很低的水平；PINK1在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，由581個(gè)氨基酸組成，其N端有與線粒體識(shí)別的區(qū)域線粒體靶向序列（mitochondrial targeting sequences，MTS）、TM、Kinase［13］；PINK1通過與線粒體外膜上線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶（translocase outer menbrane，TOM）復(fù)合物作用，進(jìn)入線粒體膜間腔，隨后與內(nèi)膜上的TIM（translocase inner menbrane）復(fù)合物作用，并且迅速的被內(nèi)膜上的早老素相關(guān)菱形蛋白（Presenilin-associated rhomboidlike protein，PARL）分解，這個(gè)過程使具有極性的線粒體中PINK1的水平較低，抑制線粒體自噬在正常線粒體中進(jìn)行［26］。而當(dāng)線粒體受損或功能障礙時(shí)，線粒體膜電勢(shì)減弱，PINK1不能與TOM正常結(jié)合，但仍能與線粒體外膜的結(jié)合，大量的在線粒體外膜上聚集，并且從胞質(zhì)中募集Parkin到線粒體膜上。

Parkin是由PARK6基因（又稱為PARKIN基因）編碼的含有465個(gè)氨基酸的E3泛素連接酶。它介導(dǎo)受損線粒體的清除（線粒體自噬），在PINK1誘導(dǎo)途徑下游起作用。Parkin過量表達(dá)產(chǎn)物聚集在線粒體外膜，使多種外膜蛋白泛素化，如線粒體融合蛋白（mitochondrial fusion proteins和mitofusin）MFN1、MFN2。Parkin能夠通過介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MFN1、 MFN2的降解阻止線粒體的融合，從而使去極化線粒體與正常線粒體區(qū)分開［27］，其主要作用是去極化線粒體的識(shí)別。同時(shí)Parkin也可以使蒼蠅中MARF（mitochondrial assembly regulatory factor） 和 VDAC1（voltage dependent anion channel 1）［28，29］等蛋白泛素化，但MARF和VDAC1的降解過程還不清楚。

當(dāng)PINK1在線粒體外膜積累時(shí)，Parkin可以與3種PINK1的異構(gòu)體結(jié)合，具體的分子機(jī)理還不清楚。但采用系列突變?cè)囼?yàn)證明PINK1通過磷酸化Parkin（目前還沒有證據(jù)證明PINK1可以直接使Parkin磷酸化）［30，31］和加強(qiáng)E3泛素連接酶的功能［32］控制Parkin在特定線粒體上的聚集。隨后，Parkin使線粒體外膜蛋白泛素化，泛素化的蛋白被受體蛋白p62識(shí)別，p62標(biāo)記在去極化的線粒體上，LC3通過與p62結(jié)合定位于去極化的線粒體上，使其被自噬小泡包裹。p62的作用至今還具有爭(zhēng)議性，Huang等［33］證明p62的敲除使線粒體自噬減弱，稱p62是Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬中所必需的，但其他途徑誘導(dǎo)的線粒體自噬中是否具有相同的作用還有待于進(jìn)一步研究證明。與此同時(shí)，Ambra1與Parkin結(jié)合，并作用于PI3KIII，在識(shí)別的線粒體周圍形成新的吞噬泡，隨后的吞噬泡的延展與LC3相關(guān)［34，35］。

2.2.2 FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬機(jī)制 Liu和Chen等［36］2012年發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體自噬的受體分子FUNDC1。FUNDC1由155個(gè)氨基酸組成，在果蠅到人類的大部分哺乳動(dòng)物中具高度保守性。通過分餾法和FUNDC1抗體的免疫染色法確定FUNDC1位于線粒體上，并且具有3個(gè)α-螺旋，是一種跨膜蛋白。其中膜外的N端氨基序列中包含一段保守LIR（LC3-interaction region）：Y（18）xxL（21），可以與LC3相互作用，介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的線粒體自噬。通過LIR保守結(jié)構(gòu)域突變或敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此結(jié)構(gòu)域失活后能夠抑制FUNDC1與LC3的相互作用和線粒體自噬發(fā)生。為進(jìn)一步了解FUNDC1與LC3相互作用和線粒體自噬調(diào)控機(jī)制，通過大量的光譜分析發(fā)現(xiàn)LIR中的Tyr 18 是一個(gè)可磷酸化位點(diǎn)，而且低氧條件下磷酸化水平降低。推測(cè)在正常情況下，F(xiàn)UNDC1能被Src激酶磷酸化。低氧情況下，Src激酶的活性降低，導(dǎo)致FUNDC1磷酸化水平降低，從而促進(jìn)其與LC3相互作用和線粒體自噬。

2.2.3 Nix介導(dǎo)線粒體自噬機(jī)制 Nix是Bcl-2家族中的一種類NIP3蛋白（NIP3-like protein X，NIX，又稱為BNIP3L）。Nix可以作為一種線粒體受體蛋白與ATG8的同系物L(fēng)C3和GABARAP（receptorassociated protein）［37］相互作用。在哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞的成熟過程中，Nix介導(dǎo)的線粒體自噬對(duì)于線粒體的移除起到至關(guān)重要的作用［7］，是一種不可或缺的物質(zhì)，它的功能類似于酵母線粒體自噬中的ATG32，但又不盡相同。ATG32的N端有一段WXXI/L/V序列，Nix的N端也存在一段WXXL序列。Nix的WXXL結(jié)構(gòu)域可以與ATG8同系物連接，特別是與LC3和GABARAP作用時(shí)，Nix的結(jié)合程度更強(qiáng)。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，Nix通過自身LC3結(jié)合域使GABARAP-L1聚集到受損線粒體，在紅細(xì)胞中，Nix：LC3/GABARAP結(jié)合受阻，線粒體自噬增強(qiáng)［37］。

Nix可以引起細(xì)胞死亡和自噬。Nix最初的發(fā)現(xiàn)源于它與BNIP3的cDNA具有56%的相似性。Nix在功能上也與BNIP3具有相似性，它們的C端跨膜域通過與BCL2和BCL-XL作用，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。當(dāng)然也有不同之處［38］。對(duì)于Nix的功能，目前主要有3種假說。一是Nix引起線粒體去極化，激活自噬清除線粒體。有證據(jù)支持這種假說：體外培養(yǎng)Nix缺陷網(wǎng)織紅細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)線粒體的清除受阻［39］。第二，Nix具有一種新功能，募集自噬相關(guān)的組分；獨(dú)立于它的另一種功能，使線粒體去極化。Nix與酵母中其他的自噬相關(guān)蛋白不具同源性［40］，而且在真核細(xì)胞中，Nix缺陷并不能減弱自噬強(qiáng)度，但卻使線粒體與自噬泡的識(shí)別受阻［41］。第三，Ivan Dikic認(rèn)為Nix作為一種銜接蛋白，可以與LC3互作，將相關(guān)的蛋白募集到線粒體［42］，并與自噬體膜的延伸有關(guān)［37］。Zhang等［42］通過小鼠實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論支持Nix受體假說，并進(jìn)一步說明起作用的功能域中具有3個(gè)連續(xù)的疏水氨基殘基并且側(cè)端帶電。最后一種假說中，Nix在細(xì)胞死亡和自噬這兩個(gè)過程中共同作用［43］。

2.3 植物線粒體自噬調(diào)控機(jī)制通路

目前，植物自噬、線粒體自噬研究較多地集中于擬南芥和簡(jiǎn)單藻類。植物在營(yíng)養(yǎng)饑餓時(shí)通過自噬降解一些物質(zhì)緩解壓力［44］；自噬可調(diào)控細(xì)胞死亡以應(yīng)對(duì)病原體免疫反應(yīng)［45］。當(dāng)植物細(xì)胞受到氧化脅迫時(shí)會(huì)通過自噬降解特定的蛋白，同時(shí)通過線粒體自噬降解一部分線粒體緩解胞內(nèi)氧化脅迫［8］。在小麥根中，氧化脅迫不僅引起非選擇性自噬也可引起線粒體自噬［4］。植物中參與線粒體自噬的蛋白及因子尚不清楚，但已知擬南芥中不具有明顯的ATG11、ATG32和ATG33同源物［4］。但最新研究在擬南芥中發(fā)現(xiàn)ATG11，且證明ATG11（也可能是ATG101）在巨自噬和線粒體自噬中為ATG1/13復(fù)合體起到重要的支架連接作用，ATG11缺乏植株提前衰老且對(duì)C和固定C缺乏異常敏感［46］?，F(xiàn)在已知的植物中存在ATG8、ATG3、ATG6等自噬相關(guān)蛋白，但目前只發(fā)現(xiàn)一種與線粒體自噬相關(guān)的蛋白——ATG4。一些線粒體毒性物質(zhì)尤其是抗霉素A處理可導(dǎo)致植物體內(nèi)ATG4表達(dá)大幅度增加（最高達(dá)6倍），由此推測(cè)ATG4在線粒體自噬中具有一定的作用［46］。ATG4是自噬小泡膜蛋白［47］，在植物細(xì)胞受到氧化脅迫時(shí)，ATG4識(shí)別受損線粒體，使自噬小泡定位到特定線粒體上，但ATG4的受體蛋白仍不清楚。ATG4是一種半胱氨酸蛋白酶，可以通過剪切和去脂作用調(diào)節(jié)ATG8蛋白的脂化修飾。已發(fā)現(xiàn)在擬南芥ATG4存在兩個(gè)拷貝——AtAtg4a和AtAtg4b。AtAtg8在擬南芥中具有9個(gè)拷貝（AtAtg8a-i）［48］，這兩種AtAtg4對(duì)9個(gè)AtAtg8的不同處理過程現(xiàn)在還不清楚。目前為止，植物線粒體自噬調(diào)控機(jī)制尚未明確，但根據(jù)已知的酵母或哺乳動(dòng)物線粒體自噬過程推測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)

人類多數(shù)癌癥、腫瘤［45］、肌肉性疾病［45］、神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機(jī)理與線粒體是否穩(wěn)定有關(guān)?，F(xiàn)已證明帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病的發(fā)病與線粒體功能紊亂有關(guān)。線粒體是細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞存活、死亡的重要調(diào)控器。線粒體損傷使ROS積累、ATP產(chǎn)生異常，并進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體DNA損傷，發(fā)生功能紊亂。線粒體自噬可清除功能紊亂的線粒體，以減弱細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，降低細(xì)胞癌化率，避免細(xì)胞凋亡、壞死。線粒體自噬機(jī)理的研究可為現(xiàn)階段癌癥、腫瘤、神經(jīng)變性等疾病提供新的治療方向，如可通過調(diào)控線粒體自噬而防止或減輕病變。已有研究證明，通過誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生，促使腫瘤細(xì)胞死亡是一種可行的腫瘤治療方案，如低強(qiáng)度超聲波可在姜黃素存在條件下誘導(dǎo)線粒體自噬，從而促進(jìn)鼻咽癌CNE2細(xì)胞死亡［49］。利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞治療腫瘤是近年來新的研究方向，而Vazquez-Martin發(fā)現(xiàn)線粒體自噬參與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程，從而為通過調(diào)控線粒體自噬治療腫瘤提供了又一思路［26］。由于不同的因素誘導(dǎo)的線粒體自噬具有不同的途徑，在不同組織發(fā)生的線粒體自噬的機(jī)制也不盡相同。但具體的誘導(dǎo)信號(hào)通路還未明確，有待進(jìn)一步的深入研究。近幾十年來，已逐漸弄清酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的線粒體自噬調(diào)控機(jī)制，而植物中的研究尚處于探索階段，線粒體自噬是否參與植物免疫反應(yīng)及植物抗病，尚待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances in the Regulation Mechanism of Mitophagy

Wang Zhishu Tan Xiaorong Liu Huanhuan
（College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

Mitochondria provide energy and materials for cells， while a variety of factors can lead to damage， aging and dysfunction of mitochondria， and they are potentially dangerous for the cells and must be cleared promptly. Mitophagy can fulfill above task and maintain cell homeostasis. Under some severe conditions， mitophagy supplies living-essentials by degrading mitochondria and helps the cells survive. Additionally mitophagy may play a role in controlling the quantity and quality of mitochondria through degrading some normal mitochondria. There are different pathways and mechanisms in different organisms. In yeast， mitophagy is mainly regulated by phosphorylation of Atg32. In mammals， mitophagy is protein-mediated by Parkin-PINK1， Nix and FUNDC1 respectively. Research on mitophagy in plants is mainly focused on Arabidopsis thaliana only， and the mechanism is not well understood yet. Here we review the research advances in mitophagy in yeast，mammals and plants， with focus on the mechanisms and factors involved.

mitophagy；yeast；mammal；plant

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.005

2014-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（.31201409）

王志舒，女，碩士，研究方向：植物自噬；E-mail：15038138706@163.com

譚曉榮，女，博士，副教授，研究方向：活性氧和自噬相關(guān)研究；E-mail：tanxr2012@gmail.com