胚胎植入前遺傳學(xué)篩查技術(shù)的應(yīng)用進展

岳佳，李永剛

（1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院生殖遺傳一科，昆明 650032）

一、胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（PGS）的定義及適應(yīng)癥

1990年，Handyside等［1］對1例性連鎖遺傳病夫婦的胚胎，應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增Y 染色體特異位點后成功對植入前的胚胎進行了遺傳學(xué)診斷，誕生一例健康女嬰。該技術(shù)被定義為胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD），即針對具有遺傳病患病風(fēng)險的夫妻，在體外受精（IVF）后取出胚胎6～8細胞時期的一個卵裂球進行遺傳學(xué)分析，以期獲得不受遺傳缺陷影響的胎兒。起初只有PCR 應(yīng)用于PGD，但隨著熒光原位雜交（FISH）技術(shù)的引入，也可對染色體拷貝數(shù)異常進行檢測。1993年，Munne等［2］首先提出對胚胎進行非整倍體的PGD，他們活檢出人卵裂期胚胎的一個細胞，用多色FISH 探針對其進行非整倍體篩查。1995年，報道了第一例通過非整倍體篩查后進行胚胎移植而分娩的活嬰。在IVF中，染色體數(shù)目異常的胚胎移植后會導(dǎo)致胚胎不能發(fā)育至足月，從而致使某些特殊不孕患者的活產(chǎn)率降低。因此，以期通過活檢卵裂期的一個細胞，并應(yīng)用FISH 技術(shù)進行染色體異?？截悢?shù)的篩查來改善IVF的妊娠結(jié)局。該方法被定義為胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（PGS）。

眾所周知，高齡女性的生育力降低大多與卵子的非整倍性相關(guān)。臨床研究表明，隨著女性年齡的增大，尤其是35歲后，卵子出現(xiàn)非整倍體的概率顯著增加。這也從一定程度上解釋了高齡女性無論在自然受孕還是IVF中妊娠率降低的原因。因此，從PGS的應(yīng)用目的來看，高齡女性被認為是PGS最大的受益者。此外，PGS也適用于反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、男性因素導(dǎo)致的不孕、女性本身攜帶三體的染色體以及卵子捐贈等，因為在這些女性中也發(fā)現(xiàn)了高發(fā)的胚胎非整倍體［3］。近來，在年輕女性中也發(fā)現(xiàn)存在高發(fā)的胚胎非整倍體，F(xiàn)ranasiak等［4］的研究表明，年齡在26歲以下的女性也有較高的胚胎非整倍性風(fēng)險，因此PGS也被用于年輕女性的非整倍體篩查。對于預(yù)后良好的年輕女性，通過PGS策略選擇優(yōu)質(zhì)的胚胎進行單胚胎移植（SET）能夠降低醫(yī)源性多胚帶來的風(fēng)險［5］。

二、PGS的應(yīng)用近況

當(dāng)前，根據(jù)歐洲生殖和胚胎協(xié)會（ESHRE）PGD小組的數(shù)據(jù)，植入前遺傳學(xué)非整倍體篩查在歐美發(fā)達國家的輔助生育領(lǐng)域中已逐漸大量使用。ESHRE收集的多中心數(shù)據(jù)表明1997～1998年，全球的生殖中心僅進行了116個PGS周期，而2006年，全球57個生殖中心共進行了3 900個PGS周期［6］。但根據(jù)2009年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，全球60個生殖中心僅進行了3551 個PGS 周期，有略微下降的趨勢［7］。

從理論上來說，選擇染色體數(shù)目正常的胚胎移植可以提高種植率和妊娠率，降低流產(chǎn)率，提高活產(chǎn)率，但實際情況可能并非如此，近些年來關(guān)于PGS的爭論從未停止過，且大有愈演愈烈之勢。Munne和Cohen贊成對符合PGS 指征的患者實行PGS。Munne等［8］對高齡婦女行PGS 的研究表明，盡管PGS沒有提高胚胎種植率，但提高了妊娠率和活產(chǎn)率。Gianaroli等［9］的研究表明實行PGS的高齡婦女，每個移植周期的種植率和妊娠率都有提高。PGS也能顯著降低高齡婦女的流產(chǎn)率。而荷蘭學(xué)者Mastenbroek等［10］通過一個大樣本、多中心、隨機雙盲的研究，發(fā)現(xiàn)408 名年齡35～41 歲的IVF婦女中，進行PGS（取單卵裂球活檢）反而明顯降低了活產(chǎn)率，而與流產(chǎn)率無關(guān)。在實驗組，60%的胚胎被檢查出為非整倍體，提示在對照組中可能也有相似的非整倍體率。小部分嵌合型胚胎可以在發(fā)育后期自我糾正，但多數(shù)以流產(chǎn)告終，兩組的臨床流產(chǎn)率相似而實驗組的活產(chǎn)率明顯降低，說明PGS對于高齡婦女只是干擾了胚胎的自然選擇，對妊娠結(jié)局并無益處。最近的一項對PGS研究的Meta分析也表明行PGS會顯著降低高齡婦女的活產(chǎn)率［11］。關(guān)于PGS在IVF中的負面影響，一些學(xué)者認為實驗設(shè)計以及方案存在缺陷和技術(shù)水平低下等問題是潛在的一個重要因素［12］。

三、PGS中活檢方法的應(yīng)用

1.極體活檢：極體是卵母細胞經(jīng)過兩次減數(shù)分裂排出的具有與其相對應(yīng)染色體組的單倍體細胞，不構(gòu)成胚胎發(fā)育的部分，因此認為通過極體活檢可以間接預(yù)測胚胎的非整倍性［3］。此外，在胚胎活檢被法律禁止的國家，例如德國、奧地利、瑞士和意大利，極體活檢是主要應(yīng)用的方法［13］。其優(yōu)勢還在于受精卵期尚未出現(xiàn)嵌合體，因此可以避免胚胎嵌合體導(dǎo)致的誤診，并且可以提供充足的時間進行遺傳學(xué)分析。關(guān)于極體活檢后的妊娠率和活產(chǎn)率早已有報道。ESHRE 的PGS 小組初步擬定了通過極體活檢來對高齡女性胚胎非整倍體進行篩查的方案，并在實驗中發(fā)現(xiàn)極體的非整倍性和胚胎是相近的，吻合率達到94%［14］。Christopikou等［15］通過對高齡女性D3期胚胎進行極體活檢和檢測后也發(fā)現(xiàn)，其對于預(yù)測胚胎的非整倍體準確率高達98%。因此提示，通過對卵裂期胚胎的極體進行活檢對于PGS是有效的。但最近，Salvaggio等［16］的一項研究表明，采用極體活檢對預(yù)測胚胎的非整倍性價值不大，并沒有達到預(yù)期的臨床效果。作者認為，其中一個重要的原因是極體活檢本身的局限性，即只能檢測母源性因素導(dǎo)致的非整倍體，而男性因素及受精前的環(huán)境因素也能導(dǎo)致約10%的胚胎非整倍體。此外，有研究認為在受精過程中兩個極體的存在可能與胚胎的定向發(fā)育相關(guān)聯(lián)［17］。過早地進行極體活檢可能會擾亂胚胎的定向分化，并在胚胎發(fā)育的晚期產(chǎn)生負面影響。

2.卵裂期活檢：卵裂期活檢是通過取胚胎發(fā)育至D3期的單個或兩個卵裂球進行活檢。該活檢方法普遍應(yīng)用于PGS，統(tǒng)計顯示，約90%的PGS周期中應(yīng)用了卵裂球活檢技術(shù)［18］。但目前的一項meta分析表明卵裂球活檢并不能改善PGS的妊娠結(jié)局，其中一個重要的原因是卵裂期胚胎中大量嵌合體的存在有可能導(dǎo)致誤診，產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果［11］。胚胎未分化前，約有65%～70%的胚胎存在嵌合體［19］。此外，胚胎活檢損傷、技術(shù)操作失誤及遺傳分析方法的局限性等技術(shù)缺陷都有可能導(dǎo)致PGS的誤診［11］。因此，越來越多的研究傾向于應(yīng)用囊胚期活檢代替卵裂期活檢。

3.囊胚期活檢：囊胚活檢已迅速成為一種更優(yōu)的方法應(yīng)用于非整倍體的篩查。澳大利亞的一家私人生殖中心首先采用了該方法，他們?nèi)∨咛プ甜B(yǎng)外胚層的細胞進行檢測并獲得了一例健康的嬰兒。相對于極體活檢和卵裂期活檢，囊胚期活檢可獲取更多的細胞進行遺傳學(xué)分析，可進行重復(fù)檢測。此外，由于胚胎在囊胚期含有非整倍體的風(fēng)險（38.8%）小于卵裂期（51%），因此采用囊胚期活檢能夠降低誤診率［20］。這可能是由于D2／D3期的嵌合體胚胎含有大量的非整倍體細胞，并且這些胚胎不能發(fā)育至囊胚期（由于部分非整倍體胚胎被自然淘汰）。如果胚胎中僅含有中等或低水平的嵌合體，那么當(dāng)其發(fā)育至囊胚期時會進行“修復(fù)”，以致大部分胚胎獲得正常的染色體型。Fragouli等［21］在研究中發(fā)現(xiàn)只有約1／3的囊胚存在嵌合體。Scott［22］在一項前瞻性隨機對照實驗中對囊胚期的胚胎進行了24條染色體的非整倍體篩查分析，并進行了新鮮胚胎的移植，結(jié)果表明該實驗組的臨床妊娠率為92%（12／13），高于對照組的臨床妊娠率60%（9／15）。近年來，大量的研究數(shù)據(jù)表明，相比于卵裂期活檢，囊胚活檢更能改善PGS的妊娠結(jié)局。但目前存在的爭議認為，對于高齡女性以及卵巢早衰的年輕女性，能發(fā)育至囊胚期的胚胎數(shù)量急劇減少，這就在一定程度上降低了植入率，并且有研究表明通過D3 期移植也能獲得正常的妊娠［23］。

四、PGS中診斷技術(shù)的應(yīng)用

1.熒光原位雜交技術(shù)：熒光原位雜交技術(shù)（FISH）作為一種較早應(yīng)用于胚胎植入前遺傳學(xué)篩查的技術(shù)，現(xiàn)已發(fā)展成熟。常規(guī)的FISH 技術(shù)可對5～14對染色體進行非整倍體篩查［24］。作為第一代PGS技術(shù)（PGS＃1）［25］，即主要應(yīng)用D3 期活檢結(jié)合FISH 檢測，已經(jīng)表明對改善IVF的妊娠結(jié)局沒有益處［11］。FISH 只能在同一時間對少數(shù)染色體進行檢測的局限性是導(dǎo)致不能改善PGS妊娠結(jié)局的一個重要原因。此外，沒有實驗數(shù)據(jù)證明何種探針組合是最有效的。事實上，探針的選擇具有很大的隨機性，并且沒有大量關(guān)于卵裂期胚胎23條染色體出現(xiàn)非整倍體頻率的實驗數(shù)據(jù)。在FISH 中每個探針的檢出率為92%～99%，因此在多探針的聯(lián)合應(yīng)用中，其誤診率是顯而易見的［26］。假設(shè)每個探針的檢出率為98%，那么8種探針的組合其錯誤率達到15%。該檢測方法存在較低的陽性預(yù)測值，這會導(dǎo)致很多有發(fā)育潛能的胚胎被錯誤排除，進而影響到PGS的效能。卵裂期存在大量的嵌合體也是導(dǎo)致FISH 誤診風(fēng)險增加的一個因素。FISH 檢測過程中涉及的細胞固定和信號重疊，是導(dǎo)致PGS診斷錯誤的因素，錯誤率在40%～50%［27］。由于FISH技術(shù)中存在的固有缺陷，因此逐漸被新發(fā)展的檢測技術(shù)所替代。

2.比較基因組雜交技術(shù)（CGH）：CGH 在PGS中的應(yīng)用從染色體檢測數(shù)目上彌補了FISH 的不足。CGH 能夠?qū)?4條染色體進行檢測，結(jié)合卵裂期活檢，是最早應(yīng)用于PGS 的染色體綜合分析技術(shù)。采用CGH 和FISH 技術(shù)分別對D3 期胚胎中同一時間段取出的兩個卵裂球進行檢測，其結(jié)果證實了CGH 的可靠性，并且應(yīng)用CGH 可將非整倍體胚胎的檢測率從30%提高至33%［28］。但CGH 需要的檢測分析時間較長（4d），超過了新鮮胚胎移植的時間（1～2d），因此需要進行胚胎凍存，而早期的凍存技術(shù)使胚胎的存活率降低，因此限制了CGH在PGS中的應(yīng)用。隨著玻璃化凍存（Vitrification）技術(shù)的發(fā)展，CGH 逐漸應(yīng)用于極體活檢和囊胚活檢。Fragouli等［29］應(yīng)用CGH 對極體和囊胚活檢后得到的妊娠率分別為21%和69.2%，提示CGH 結(jié)合囊胚活檢可以改善IVF 的妊娠結(jié)局。基于微陣列技術(shù)平臺的檢測技術(shù)使PGS不僅能夠?qū)?4條染色體的非整倍性進行檢測，并且縮短了檢測時間，自動化的結(jié)果判定更加客觀準確。目前，微陣列比較基因組雜交技術(shù)（aCGH）就是一種基于微陣列檢測技術(shù)的比較基因組雜交技術(shù)。與FISH 相比較，aCGH 無需進行細胞固定，并且能在同一時間對全染 色 體 組 進 行 檢 測。Gutierrez-Mateo 等［30］對aCGH 的有效性進行了研究，結(jié)果表明aCGH 比12種探針聯(lián)合FISH 多檢測出42%的異常染色體及13%的異常胚胎。而Scott等［31］進行的一項前瞻性隨機雙盲臨床實驗提到aCGH 能夠?qū)⒄`診率降低至4%，并且能夠提高種植率和分娩率。ESHRE PGS小組對aCGH 結(jié)合極體活檢的初期臨床實驗也表明了aCGH 在檢測合子非整倍性上的準確性［14］。此外，F(xiàn)iorentino等［32］的臨床研究中也報道了應(yīng)用aCGH 進行非整倍體篩查能得到70%的妊娠率。但aCGH 不能直接對單倍體和一些多倍體進行檢測，全基因組擴增中存在的等位基因脫扣和擴增偏倚現(xiàn)象可能會在一定程度上降低檢測效率。盡管如此，基于其較高的準確性和分辨率，aCGH 成為PGS＃2（第二代PGS）［25］主要的應(yīng)用技術(shù)。但大量的實驗數(shù)據(jù)證明，胚胎嵌合體的存在依然使部分具有發(fā)育潛能的胚胎被排除［14，31］，未來還需要進行一系列aCGH 結(jié)合各活檢時期的隨機臨床實驗來證實其有效性。

3.單核苷酸多態(tài)微陣列技術(shù)（SNP array）：SNP array是另一項有前景的微陣列檢測技術(shù)，該技術(shù)能對24條染色體進行綜合分析，其原理類似于aCGH。SNP微陣列技術(shù)不僅能夠檢測胚胎的非整倍性，還能對單基因缺失進行檢測，并且能夠提供基因型數(shù)據(jù)以生成每一個胚胎獨有的DNA 指紋。目前各實驗室還在對該項技術(shù)的實用性進行實驗驗證并已經(jīng)獲得了可觀的結(jié)果［31］。Schoolcraft等［33］在一項臨床實驗中，應(yīng)用SNPs結(jié)合囊胚活檢得到了73%的妊娠率。近期，Tobler等［34］比較了aCGH和SNP 在PGS中的妊娠率，分別為65%和60%，提示二者都能在很大程度上改善PGS的妊娠結(jié)局。但SNP還是表現(xiàn)出了一定的局限性，如高成本的儀器配置，其中包括高分辨率的掃描儀以及繁瑣的操作步驟。

4.二代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）：現(xiàn)有的遺傳學(xué)診斷技術(shù)僅能為PGS提供有限的分辨率和信息，很大程度上限制了非整倍體篩查與孟德爾遺傳病SNP 分型及新突變位點的綜合分析［35］。二代測序技術(shù)的出現(xiàn)為PGS提供了綜合性的單細胞非整倍體篩查。NGS技術(shù)具有高通量、低成本和速度快等一系列優(yōu)勢。Fiorentino等［36］近期將NGS應(yīng)用于PGS，證明了NGS具有臨床有效性和實用性。但無論是微陣列技術(shù)還是NGS，都必須基于PCR 技術(shù)，因此單細胞基因組擴增成為NGS技術(shù)的關(guān)鍵。多重置換擴增技術(shù)相對于其他的PCR 技術(shù)能夠提供更高的準確性，但依然存在大量的擴增偏倚。哈佛大學(xué)的一個研究團隊最近提出了MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）技術(shù)，即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)，該技術(shù)具有更高的擴增均一性［37］。MALBAC已被用于單個卵母細胞的基因測序［38］。第三代測序技術(shù)（de novo sequence），即單分子實時DNA 測序具有更高的檢測速度與較長的讀長，逐漸成為研究的熱點方向。

5.延遲監(jiān)測（time-lapse monitoring，TLM）技術(shù)：延遲監(jiān)測技術(shù)，即利用延時攝像技術(shù)對胚胎體外發(fā)育過程進行全程監(jiān)測，根據(jù)胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的分裂異常、核重現(xiàn)、多核等現(xiàn)象，初步評價囊胚形成能力和囊胚的染色體組成。常規(guī)的胚胎形態(tài)學(xué)評級方法僅限于在胚胎發(fā)育的某一時刻進行觀察評估，并且在操作過程中需要將胚胎暴露在變化的環(huán)境中。TLM 在IVF中應(yīng)用彌補了常規(guī)評級方法的不足，通過每5-20分鐘一次的圖像采集來對早期胚胎的發(fā)育進行連續(xù)評估，因此避免了依靠靜態(tài)觀察來 定義一個 動 態(tài) 過 程［39］。近 來，TLM 在IVF 中 的應(yīng)用使得無創(chuàng)性PGS（noninvasive-preimplantation genetic screening，NPGS）成為了可能，所謂無創(chuàng)性PGS，即不進行胚胎活檢的條件下篩選出染色體正常的胚胎進行移植［40］。TML 在PGS 中的應(yīng)用能夠篩選出具有良好發(fā)育潛能的胚胎，并獲得低比率的非整倍體胚胎。Meseguer等［41］在研究中提出，胚胎的形態(tài)發(fā)育動力學(xué)能夠為評估胚胎的發(fā)育潛能提供新的形態(tài)發(fā)育動力學(xué)標記（morphokinetic markers），以此來評估胚胎的生長發(fā)育潛能并為判斷胚胎的非整倍體提供依據(jù)。一項系統(tǒng)性的回顧分析顯示，幾個胚胎發(fā)育的動力學(xué)參數(shù)與后續(xù)移植的成功率有顯著的相關(guān)性，例如從受精到發(fā)育至第五天的時間間隔、兩次卵裂的時間間隔等［39］。Hong等［42］在研究中發(fā)現(xiàn)，胚胎出現(xiàn)非整倍體的風(fēng)險隨著囊胚出現(xiàn)胚泡的時間縮短而降低。而在另一項研究中，Basile等［43］應(yīng)用胚胎發(fā)育早期的幾項形態(tài)動力學(xué)參數(shù)建立模型來提高篩選出正常染色體數(shù)目胚胎的可能性。Campbell等［44］應(yīng)用TLM 建立了胚胎非整倍體風(fēng)險評估模型，利用該模型選擇低風(fēng)險的胚胎進行移植，得到了較低的非整倍率。在最近的一項研究中，通過比較TLM 聯(lián)合array CGH 的策略與常規(guī)的PGS方法，結(jié)果顯示兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用能夠獲得更高的種植率和妊娠率［45］。

五、PGS的發(fā)展前景

PGS發(fā)展至今已走過近20 年的歷程，在其發(fā)展的前15年中取受精后第3天卵裂期胚胎的1～2個細胞進行FISH 分析成為PGS的常規(guī)方法，但隨后幾年的幾項隨機控制實驗卻表明PGS不能在很大程度上改善IVF的妊娠結(jié)局，且在這些實驗中多采用種植率作為參考標準。因此，美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會（ASRM）、歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會（ESHRE）以及英國生育協(xié)會（BFS）等機構(gòu)認為沒有證據(jù)表明PGS在常規(guī)IVF 周期中的作用是積極的。盡管前期的臨床實驗并未給PGS帶來可觀的應(yīng)用前景，但也沒有阻礙PGS技術(shù)的發(fā)展，新遺傳分析技術(shù)的出現(xiàn)為PGS帶來了新的機遇與挑戰(zhàn)。目前，囊胚期活檢聯(lián)合aCGH 的全染色體組綜合分析成為PGS的主要發(fā)展趨勢，但依然需要考慮其中涉及的效力和成本問題。此外，PGS在IVF中的應(yīng)用更多的傾向于“以治療為目的”（intended to treat），因此在評估各活檢方法聯(lián)合遺傳分析方法的臨床效益時，應(yīng)賦予繼續(xù)妊娠率甚至健康嬰兒出生率更高的權(quán)重，并且同時考慮患者所負擔(dān)的醫(yī)療費用。未來需要進行更多的臨床實驗來確定胚胎植入前各篩查技術(shù)的有效性，或探究多方法的聯(lián)合應(yīng)用以改善IVF的妊娠結(jié)局。

［1］ Handyside AH，Kontogianni EH，Hardy K，et al.Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Yspecific DNA amplification［J］.Nature，1990，344：768-770.

［2］ MunnéS，Lee A，Rosenwaks Z，et al.Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos［J］.Hum Reprod，1993，8：2185-2191.

［3］ Ly KD，Agarwal A，Nagy ZP.Preimplantation genetic screening：does it help or hinder IVF treatment and what is the role of the embryo？［J］.J Assist Reprod Genet，2011，28：833-849.

［4］ Franasiak JM，F(xiàn)orman EJ，Hong KH，et al.The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner：a review of 15，169consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening［J］.Fertil Steril，2014，101：656-663.

［5］ Forman EJ，Hong KH，F(xiàn)erry KM，et al.In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer：a randomized controlled trial［J］.Fertil Steril，2013，100：100-107.

［6］ Goossens V，Harton G，Moutou C，et al.ESHRE PGD Consortium data collection IX：cycles from January to December 2006 with pregnancy follow-up to October 2007［J］.Hum Reprod，2009，24：1786-1810.

［7］ Moutou C，Goossens V，Coonen E，et al.ESHRE PGD Consortium data collection XII：cycles fromJanuary to December 2009with pregnancyfollow-up to October 2010［J］.Hum Reprod，2014，29：880-903.

［8］ MunnéS，Magli C，Cohen J，et al.Positive outcome after preimplantation diagnosis of aneuploidy in human embryos［J］.Hum Reprod，1999，14：2191-2199.

［9］ Gianaroli L，Magli MC，MunnéS，et al.Advantages of day 4 embryo transfer in patients undergoing preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy［J］.J Assist Reprod Genet，1999，16：170-175.

［10］ Mastenbroek S，Twisk M，van Echten-Arends J，et al.In vitro fertilization with preimplantation genetic screening［J］.N Engl J Med，2007，357：9-17.

［11］ Mastenbroek S，Twisk M，van der Veen F，et al.Preimplantation genetic screening：a systematic review and meta-analysis of RCTs［J］.Hum Reprod Update，2011，17：454-466.

［12］ Rubio C，Giménez C，F(xiàn)ernández E，et al.The importance of good practice in preimplantation genetic screening：critical viewpoints［J］.Hum Reprod，2009，24：2045-2047.

［13］ Dawson A，Griesinger G，Diedrich K.Screening oocytes by polar body biopsy［J］.Reprod Biomed Online，2006，13：104-109.

［14］ Geraedts J，Montag M，Magli MC，et al.Polar body array CGH for prediction of the status of the corresponding oocyte.Part I：clinical results［J］.Hum Reprod，2011，26：3173-3180.

［15］ Christopikou D，Tsorva E，Economou K，et al.Polar body analysis by array comparative genomic hybridization accurately predicts aneuploidies of maternal meiotic origin in cleavage stage embryos of women of advanced maternal age［J］.Hum Reprod，2013，28：1426-1434.

［16］ Salvaggio CN，F(xiàn)orman EJ，Garnsey HM，et al.Polar body based aneuploidy screening is poorly predictive of embryo ploidy and reproductive potential［J］.J Assist Reprod Genet，2014，31：1221-1226.

［17］ Hansis C，Grifo JA，Tang Y，et al.Assessment of beta-HCG，beta-LH mRNA and ploidy in individual human blastomeres［J］.Reprod Biomed Online，2002，5：156-161.

［18］ Harper JC，Coonen E，De Rycke M，et al.ESHRE PGD Consortium data collection X：cycles from January to December 2007 with pregnancy follow-up to October 2008［J］.Hum Reprod，2010，25：2685-2707.

［19］ Mertzanidou A，Wilton L，Cheng J，et al.Microarray analysis reveals abnormal chromosomal complements in over 70%of 14normally developing human embryos［J］.Hum Reprod，2013，28：256-264.

［20］ Fragouli E，Lenzi M，Ross R，et al.Comprehensive molecular cytogenetic analysis of the human blastocyst stage［J］.Hum Reprod，2008，23：2596-2608.

［21］ Fragouli E，Alfarawati S，Daphnis DD，et al.Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH，CGH and aCGH：scientific data and technical evaluation［J］.Hum Reprod，2011，26：480-490.

［22］ Scott RT . A prospective randomized controlled trialdemonstrating significantly increased clinical pregnancy rates following 24chromosome aneuploidy screening：biopsy and analysis on day 5 with fresh transfer［J］.Fertil Steril，2010，94（S2）.

［23］ Cedars MI.National reporting of in vitro fertilization success rates：how do we get patients useful information？［J］.Fertil Steril，2013，100：1210-1211.

［24］ Zhao Y，Brezina P，Hsu CC，et al.In vitro fertilization：four decades of reflections and promises［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1810：843-852.

［25］ Gleicher N，Kushnir VA，Barad DH.Preimplantation genetic screening（PGS）still in search of a clinical application：a systematic review［J］.Reprod Biol Endocrinol，2014，12：22.

［26］ Scriven PN，Bossuyt PM.Diagnostic accuracy：theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique［J］.Hum Reprod，2010，25：2622-2628.

［27］ Geraedts J，Montag M，Magli MC，et al.Polar body array CGH can be achieved within 12hours with an acceptable level of accuracy for prediction of the status of the corresponding oocyte［J］.Human Reprod，2011，26：3173-3180.

［28］ Keskintepe L，Sher G，Keskintepe M.Reproductive oocyte／embryo genetic analysis：comparison between fluorescence insitu hybridization and comparative genomic hybridization［J］.Reprod Biomed Online，2007，15：303-309.

［29］ Fragouli E，Katz-Jaffe M，Alfarawati S，et al.Comprehensive chromosome screening of polar bodies and blastocysts from couples experiencing repeated implantation failure［J］.Fertil Steril，2010，94：875-887.

［30］ Gutiérrez-Mateo C，Colls P，Sánchez-García J，et al.Validation of microarray comparative genomic hybridization for comprehensive chromosome analysis of embryos［J］.Fertil Steril，2011，95：953-958.

［31］ Scott RT，F(xiàn)erry K，Su J，et al.Comprehensive chromosome screening is highly predictive of the reproductive potential of human embryos：a prospective，blinded，nonselection study［J］.Fertil Steril，2012，97：870-875.

［32］ Fiorentino F，Spizzichino L，Bono S，et al.PGD for reciprocal and Robertsonian translocations using array comparative genomic hybridization ［J］. Hum Reprod，2011，26：1925-1935.

［33］ Schoolcraft WB，Treff NR，Stevens JM.Live birth outcome with trophectoderm biopsy，blastocyst vitrification，and singlenucleotide polymorphism microarray-based comprehensive chromosome screening in infertile patients［J］.Fertil Steril.2011，96：638-640.

［34］ Tobler KJ，Brezina PR，Benner AT，et al.Two different microarray technologies for preimplantation genetic diagnosis and screening，due to reciprocal translocation imbalances，demonstrate equivalent euploidy and clinical pregnancy rates［J］.J Assist Reprod Genet，2014，31：843-850.

［35］ Treff NR，F(xiàn)edick A，Tao X，et al.Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease［J］.Fertil Steril，2013，99：1377-1384.

［36］ Fiorentino F，Biricik A，Bono S，et al.Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos［J］.Fertil Steril，2014，101：1375-1382.

［37］ Zong C，Lu S，Chapman AR，et al.Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell［J］.Science，2012，338：1622-1626.

［38］ Hou Y，F(xiàn)an W，Yan L，et al.Genome analyses of single human oocytes［J］.Cell，2013，155：1492-1506.

［39］ Kaser DJ，Racowsky C.Clinical outcomes following selection of human preimplantation embryos with time-lapse monitoring：a systematic review［J］.Hum Reprod Update，2014，20：617-631.

［40］ Milachich T.New advances of preimplantation and prenatal genetic screening and noninvasive testing as a potential predictor of health status of babies［J］.Biomed Res Int，2014，2014：306505.

［41］ Meseguer M，Herrero J，Tejera A，et al.The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation［J］.Hum Reprod，2011，26：2658-2671.

［42］ Hong KH，F(xiàn)orman EJ，Prodoehl A，et al.Early times to cavitation are associated with a reduced prevalence of aneuploidy in embryos cultured to the blastocyst stage：A prospective blinded morphokinetic study［J］.Fertil Steril，2013，100：811.

［43］ Basile N，Nogales Mdel C，Bronet F，et al.Increasing the probability of selecting chromosomally normal embryos by time-lapse morphokinetics analysis［J］.Fertil Steril 2014，101：699-704.

［44］ Campbell A，F(xiàn)ishel S，Bowman N，et al.Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using noninvasive morphokinetics［J］.Reprod Biomed Online，2013，26：477-485.

［45］ Yang Z，Zhang J，Salem SA，et al.Selection of competent blastocysts for transfer by combining time-lapse monitoring and array CGH testing for patients undergoing preimplantation genetic screening：aprospective study with sibling oocytes［J］.BMC Med Genomics，2014，7：38.