微透析技術(shù)在骨科的應(yīng)用

張朕，王丹，朱澤興，張樹明，喬林

1.同濟(jì)大學(xué) 附屬楊浦醫(yī)院，上海 200090；2.第二炮兵總醫(yī)院a.藥劑科；b.骨科；北京 100088

微透析技術(shù)（microdialysis，MD）作為一種成熟、可靠的技術(shù)，依賴其自身優(yōu)勢，經(jīng)過半個世紀(jì)的發(fā)展，已在臨床前實驗、藥物開發(fā)、臨床監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛發(fā)展和應(yīng)用。目前，F(xiàn)DA和CE已批準(zhǔn)其應(yīng)用于人類心肌、腦組織、肺和一些腫瘤的研究[1]。

MD 的快速發(fā)展與其先天的一些優(yōu)勢不可分割。單根微透析探針植入所造成的創(chuàng)傷僅相當(dāng)于留置針，加上其多點取樣、連續(xù)監(jiān)測、極少量的體液丟失等優(yōu)勢，可配合多種檢測設(shè)備實時監(jiān)測使用，取得目標(biāo)物純度高，使人類的體內(nèi)組織化學(xué)測定成為可能，而且在任何器官中都可行。經(jīng)過近50 年的發(fā)展，目前MD 相關(guān)文獻(xiàn)近20 萬篇，廣泛涉及心、腦、肺、肝、膽、腎、眼、耳、骨、肌肉、血液、皮膚、胚胎、前列腺等組織[1]。

同樣，MD 在骨科也得到了非常廣泛的應(yīng)用。1996 年，Thorsen 把MD 應(yīng)用于脛骨干骺端骨組織代謝檢測。2003 年，Stolle 開創(chuàng)性地在骨皮質(zhì)中利用MD探針檢測抗菌藥物局部濃度，次年他又將應(yīng)用范圍擴(kuò)大到松質(zhì)骨，與傳統(tǒng)方法對比后，證實MD 在骨組織中的應(yīng)用是可行的。2007年B?geh?j撰文，正式把其作為一種研究方法進(jìn)行系統(tǒng)的歸納總結(jié)[2]。微透析探針還可以作為局部用藥的途徑，應(yīng)用于實驗中[3-6]。在此，我們就MD 在骨科的應(yīng)用做簡要總結(jié)，希望對大家有所幫助。

1 骨科基礎(chǔ)方面

MD技術(shù)在局部取樣方面有獨特的優(yōu)勢，特別是在局部代謝產(chǎn)物和藥物濃度方面，但將MD 引入骨科基礎(chǔ)進(jìn)行廣泛的研究則相對較晚，Thorsen 等在1996 年研究應(yīng)力刺激下人骨組織前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）釋放時首次把該技術(shù)引入基礎(chǔ)研究，他們把MD 探針置于脛骨干骺端骨質(zhì)較為疏松的部位，發(fā)現(xiàn)在應(yīng)力刺激下，人脛骨近端的PGE2增長了2.5～3.5 倍，證實PGE2 與動態(tài)機械運動有明確關(guān)系。Korth 等在研究外科止血帶對骨骼肌能量代謝的影響時，通過MD 配合高效液相色譜，發(fā)現(xiàn)在使用止血帶30 min 后，目標(biāo)肢體的葡萄糖水平下降了40%，而乳酸和次黃嘌呤的水平則上升了200%以上，膽堿水平也有大幅增加，而再灌注后葡萄糖的水平可以快速回升，但乳酸和次黃嘌呤的水平卻持續(xù)增加，證實了松止血帶后并不能及時有效地緩解肢體缺血情況，該實驗結(jié)果認(rèn)為缺血反而會加重[7]。Mikkelsen 利用MD 檢測非甾體抗炎藥（NSAID）的同時，把其也作為一種局部用藥的途徑，發(fā)現(xiàn)距離用藥點1 cm 遠(yuǎn)處PGE2 的水平下降了85%，4 cm 處則下降了30%～50%，證明NSAID 類藥物可以有效抑制PGE2分泌，在活體身上解釋了NSAID類藥物的作用機理[6]。隨后，Britt 和Mackey 等分別進(jìn)一步證實了這一結(jié)論，并認(rèn)為運動誘導(dǎo)的自適應(yīng)性（exercise-induced adaptive increase）同時被抑制了[8-9]。在研究運動對成骨的影響時，Keitaro 等利用MD 監(jiān)測運動前后72 h 間志愿者骨堿性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase，BAP）和1 型C 肽膠原蛋白（procollagen type 1 C-peptide，P1P）的水平，發(fā)現(xiàn)BAP水平無明顯變化，而P1P 在24 h 有明顯增高，標(biāo)志著體內(nèi)膠原纖維形成加強[10]。為了減小MD 應(yīng)用于人體骨骼肌的誤差，Patrik針對該條件對相對回收率隨時間變化做出校正，經(jīng)過4～6 個月的監(jiān)測，得出了MD長時間應(yīng)用在人骨骼肌中，其相對回收率是穩(wěn)定的結(jié)論，并認(rèn)為低強度的運動對其沒有影響，但會因具體項目和場合而異[11]。

2 慢性損傷方面

MD 在慢性損傷方面的應(yīng)用主要集中于對肌筋膜疼痛綜合征（myofascial pain syndromes，MPS）的研究。2004 年，Lars 等研究斜方肌慢性疼痛（trapezius myalgia，TM）時發(fā)現(xiàn)，患者肌肉內(nèi)5-羥色胺（5-HT）和谷氨酸水平與疼痛強度、壓痛閾值（pressure pain threshold，PPT）、無氧代謝密切相關(guān)。2005 年，Shah 利用MD 在活體研究MPS 評價了該類患者骨骼肌的生化環(huán)境，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)子、緩激肽（bradykinin，BKN）、降鈣素基因相關(guān)肽、P 物質(zhì)、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素（IL）1β、血清素和去甲腎上腺素的水平均高于正常人，而pH值卻顯著低于正常人。另一項研究中，又發(fā)現(xiàn)該類患者斜方肌間隙內(nèi)的鉀離子水平相對于正常人恢復(fù)到正常水平的時間明顯延長，而白介素6 和乳酸脫氫酶的水平則保持正常。Gerdle 在2008 年發(fā)現(xiàn)2 種激肽類物質(zhì)——BKN 和血管舒張素（kallidin，KAL）——也參與了痛覺過敏，他將TM 組和頸椎相關(guān)的疼痛分開觀察，并設(shè)對照組，發(fā)現(xiàn)在20 min的低強度運動和休息后，KAL和BKN 均明顯增高，KAL 最高見于頸椎組，而TM 組還是明顯高于對 照，TM 組 的BKN 則明顯高于其他2 組[12]。2011 年，Ghafouri 針對N-十六酰胺乙醇（N-palmitoylethanolamide，PEA）和N-硬脂酰乙醇胺（N-stearoylethanolamide，SEA）進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)它們在TM 患者斜方肌中的濃度同樣明顯高于正常人[13]。Larsson和Sj?gaard 認(rèn)同以上觀點，前者針對體力勞動8 h后的MPS 患者，而且發(fā)現(xiàn)肌電圖（EMG）結(jié)果、工作強度評定結(jié)果、精神緊張度似乎與這些代謝物質(zhì)的變化沒有明顯關(guān)聯(lián)[14-15]。然而Gerd 似乎不全認(rèn)同這些觀點，他在European Journal of Pain上撰文認(rèn)為，針對斜方肌慢性疼痛的患者，在安靜休息4 h 后，結(jié)果示PGE2和谷氨酸的水平與正常人并無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 創(chuàng)傷骨科方面

在骨創(chuàng)方面，Yvonne 把MD 運用到Wistar 大鼠股骨創(chuàng)傷后24 h 細(xì)胞因子和生長因子的監(jiān)測中，測定其總蛋白、IL-6的濃度，其中總蛋白的含量是不斷下降的，5 h 后趨于平緩，而IL-6 在傷后即有明顯增長，12～15 h 達(dá)到高峰，傷后24 h 后則已低于130 pg/mL，作者還試圖檢測TGFβ1，但沒有成功，IL-6和TGF-β1為骨折愈合早期的標(biāo)志性細(xì)胞因子，通過對其的檢測，讓我們在分子水平上對骨折愈合初期變化有進(jìn)一步了解[16]。在研究不同等級的創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)液代謝變化時，St?lman 引入了MD 來檢測滑囊膜的炎性物質(zhì)，如葡萄糖、乳酸、PGE2 等，發(fā)現(xiàn)冷敷和局部加壓可以有效降低滑囊膜的炎性反應(yīng)，PGE2的變化與溫度密切相關(guān)，低溫還可以有效降低乳酸水平[17]；同時還發(fā)現(xiàn)，注射酮咯酸類藥物對降低PGE2 的水平有明顯作用，而嗎啡在這方面沒有明顯反應(yīng)[18]。機體對創(chuàng)傷的反應(yīng)是一個大課題，但基于分子水平代謝的變化了解并不全面，”中間過程”是模糊的，而MD為我們提供了一種簡單可行的方法。

4 關(guān)節(jié)外科方面

St?lman 針對關(guān)節(jié)發(fā)表的一系列MD 應(yīng)用文章中，對關(guān)節(jié)鏡手術(shù)后滑囊膜的物質(zhì)代謝進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)鏡前交叉韌帶（ACL）重建術(shù)后，以簡單關(guān)節(jié)鏡術(shù)和對側(cè)大腿的脂肪組織為對照，ACL 組常規(guī)術(shù)前應(yīng)用嗎啡，術(shù)后低溫和加壓處理，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)鏡組滑囊膜乳酸、糖代謝水平術(shù)后相對于對照組明顯增高，相對于ACL 組無明顯差異，但PGE2 明顯低于ACL 組，作者認(rèn)為ACL 重建術(shù)較關(guān)節(jié)鏡術(shù)并未增加炎癥反應(yīng)[19]。而且關(guān)節(jié)鏡術(shù)后，滑囊膜的糖代謝和PGE2 水平均上升，同時疼痛感也明顯加重，他們認(rèn)為這兩者呈正相關(guān)關(guān)系。H?gbergy 也得出了同樣的結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)術(shù)后應(yīng)用類鴉片類藥物可減輕葡萄糖和PGE2 的水平。他還研究了兒茶酚胺類物質(zhì)對膝關(guān)節(jié)鏡術(shù)后滑囊膜的影響，并利用微透析探針局部用藥，發(fā)現(xiàn)實驗組乳酸均成倍增長，腎上腺素可有效降低葡萄糖和血流水平[4]。2010 年，Helmark 針對早期骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）做了一系列研究，他在超聲引導(dǎo)下，向關(guān)節(jié)內(nèi)和滑膜臨近組織放置微透析探針，并在微透析灌流液中添加放射性標(biāo)記葡萄糖，檢測幾種關(guān)節(jié)炎相關(guān)物質(zhì)——軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、軟骨蛋白多糖核心蛋白（cartilage-specific proteoglycan core protein，CSPCP）和葡萄糖-半乳糖化吡啶啉（glucosyl-galactosyl-pyridinoline，Glc-Gal-PYD），結(jié)果顯示COMP 和Glc-Gal-PYD 在關(guān)節(jié)內(nèi)明顯高于滑膜周圍組織，CSPCP未見明顯差異，他們認(rèn)為利用MD對骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行檢測切實可靠，并有良好的應(yīng)用前景[5]。在另一組實驗中，他們將31名OA 患者隨機分為運動組（NEx）和非運動組（Ex），在3 h 鍛煉后，發(fā)現(xiàn)Ex組關(guān)節(jié)內(nèi)IL-10的水平明顯高于NEx組，而IL-6 和IL-8 在2 組中均增高，Ex 組的COMP 則明顯低于NEx組，證明軟骨保護(hù)類抗炎藥可能對OA患者是有益的[6]。目前對于股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機制，有人認(rèn)為不單單是因為股骨頭動脈血供較差引起，靜脈回流受阻造成骨內(nèi)高壓也可能是一種機制。依據(jù)這一學(xué)說，B?geh?j 和Lorenzen 利用MD 對股骨頭的缺血進(jìn)行研究。B?geh?j 在骨質(zhì)上開直徑略大于MD 探針的洞，以便微透析探針置入檢測，完善MD 應(yīng)用于監(jiān)測股骨頭缺血的方法[2,20]；此后，他又配合體外實驗進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)由于在股骨開洞略大于微透析探針，期間會存在一個間隙，加上放置探針時的操作，會對實驗結(jié)果初期產(chǎn)生影響，但認(rèn)為在一個平衡期后，實驗結(jié)果是真實、可靠的[21]。Lorenzen則在研究股骨頭表面置換術(shù)的手術(shù)入路時引進(jìn)了MD，股骨頭表面置換術(shù)入路的選擇主要有后側(cè)入路和前外側(cè)入路2 種，但哪種入路對術(shù)后血液供應(yīng)影響最小卻沒有客觀的依據(jù)。Lorenzen 在術(shù)中把MD探針直接放置在股骨頭的上象限，通過術(shù)后觀察發(fā)現(xiàn)，后入路較前外側(cè)入路缺血更為嚴(yán)重，而2 種入路在血流方面沒有區(qū)別[22]。

5 骨科感染方面

在治療糖尿病足方面，Traunmüller 用MD 評價糖肽類抗生素達(dá)托霉素對糖尿病足患者發(fā)炎的皮下脂肪和骨組織的滲透能力，認(rèn)為每日1 次靜脈注射6 mg/kg體重的達(dá)托霉素，可在足皮下脂肪和跖骨達(dá)到有效濃度，可有效治療糖尿病足和骨髓炎[23]。他用相同方法對另一種唑烷酮類的抗生素利奈唑胺做了相關(guān)評價，認(rèn)為每日2 次靜脈注射600 mg 可有效治療糖尿病足和骨髓炎[24]。隨后Schintler 對大劑量的磷霉素做了類似研究，靜脈注射100 mg/kg 體重的磷霉素，其在跖骨中可以達(dá)到有效濃度，同樣是治療糖尿病足感染的良藥[25]。2014年，T?ttrup利用MD分析頭孢類抗生素頭孢呋辛在豬皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的藥代動力學(xué)，在游離血漿、表皮、松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨4組目標(biāo)物中，5 h 后分別取得了6013±1339、3222±1086、2232±635 和952±290 μg/mL 的結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)頭孢呋辛在松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的代謝明顯不同，并認(rèn)為骨組織對于頭孢呋辛可以認(rèn)為是一種隔室[26]。在研究抗菌藥物方面，MD 是非常成熟的技術(shù)，也是一個非常好的工具。

6 顯微外科方面

MD應(yīng)用于懷疑缺血的部位，可盡早判斷局部組織血供。早在1998 年，R?jdmark 就開創(chuàng)性地將MD應(yīng)用于游離皮瓣的缺血監(jiān)測，開啟了MD 在游離皮瓣研究中的應(yīng)用，并成功地發(fā)現(xiàn)了血栓和血腫的發(fā)生。Udesen在對橫行下腹直肌肌皮瓣的監(jiān)測中明確指出，當(dāng)皮瓣發(fā)生缺血時，葡萄糖下降而乳酸丙酮酸水平是上升的，這種差別有統(tǒng)計學(xué)意義，而在再灌注結(jié)束后，這些變化均可恢復(fù)正常，在1 例因動脈血栓形成導(dǎo)致的失敗病例中發(fā)現(xiàn)，其中葡萄糖濃度低到不可檢測，乳酸濃度增高后因缺少葡萄糖而停止，丙酮酸的濃度在非常高的水平。作者從而得出結(jié)論：MD可以用于監(jiān)測游離皮瓣早期缺血，使早期手術(shù)成為可能。2004 年，Set?l?在豬模型上系統(tǒng)、科學(xué)地證實了以上結(jié)論，并指出靜脈性缺血要比動脈性缺血乳酸水平更低，乳酸丙酮酸比值和乳酸葡萄糖比值更高，利用這些發(fā)現(xiàn)可以判斷缺血的性質(zhì)[27]。同理，MD 還被應(yīng)用于頜面部皮瓣[28]和腓骨游離皮瓣的監(jiān)測[29]。在研究頜面部皮瓣時，由于其特殊性，面部自覺、不自覺的活動可能對皮瓣的預(yù)后包括疤痕大小造成影響，因此在整形手術(shù)中常用鎮(zhèn)靜劑，于是Silvia利用MD和氧分壓評價了右美托咪啶應(yīng)用于游離肌皮瓣移植術(shù)后，發(fā)現(xiàn)右美托咪啶在再灌注和局部組織代謝上對肌皮瓣無不良影響，認(rèn)為可以應(yīng)用于頜面部游離皮瓣移植術(shù)后肌肉鎮(zhèn)靜[30]。

7 脊柱方面

目前，MD在神經(jīng)外科從臨床前階段到臨床階段都得到廣泛應(yīng)用，已有多篇相關(guān)綜述。同樣，在脊髓方面的研究也有大量文獻(xiàn)，大部分是關(guān)于神經(jīng)疼痛代謝方面的。Brodin 利用MD 對貓脊髓后角釋放P物質(zhì)進(jìn)行研究，將MD 引入脊髓研究方面[31]。Parrot提出把毛細(xì)管電泳分離-激光誘導(dǎo)熒光檢測（CELIFD）與MD 配合，檢測人脊髓后角的γ-氨基丁酸、丙氨酸、左旋天門冬氨酸在圍手術(shù)期的變化，認(rèn)為該檢測方法準(zhǔn)確且高效，較其他方法有獨特優(yōu)勢[32]。MD還可用于檢測神經(jīng)鞘內(nèi)天門冬氨酸、谷氨酸或一氧化氮，Hsieh發(fā)現(xiàn)其中的酮咯酸類藥物可以在脊髓損傷后引發(fā)這2 種物質(zhì)的濃度升高，對小鼠脊髓干缺血起到保護(hù)作用[33]。MD 探針還可置入脊髓，檢測其細(xì)胞外液目標(biāo)物質(zhì)的水平，Tsai 通過檢測小鼠脊髓損傷前后細(xì)胞外液維生素C 的濃度來評價脊髓損傷，發(fā)現(xiàn)損傷后小鼠脊髓細(xì)胞外液中維生素C 的濃度是逐漸增高的[34]。他噴他多是一種通過激動μ型阿片受體和抑制去甲腎上腺素再攝取的鎮(zhèn)痛藥，在研究其對脊髓性疼痛的作用效果時，Thomas 將MD探針置入小鼠脊髓，檢測到他噴他多提升了脊髓內(nèi)去甲腎上腺素的水平而對5-HT沒有明顯影響，成功地抑制去甲腎上腺素再攝取[35]。Okon在研究急性脊髓挫傷與擠壓傷后不同代謝產(chǎn)物的反應(yīng)時，把MD探針與脊髓成30°角深7 mm 置于豬脊髓T9、T10 水平，發(fā)現(xiàn)挫傷后乳酸和丙酮酸的水平在近中心的部位均上升，葡萄糖則保持穩(wěn)定，在持續(xù)給予擠壓后，乳酸水平有短暫上升，葡萄糖和丙酮酸水平快速下降，認(rèn)為這一現(xiàn)象可能與脊髓干血運受阻有關(guān)[36]。

8 骨腫瘤方面

Ekstr?m 對大劑量甲氨蝶呤治療股骨惡性纖維組織瘤采用連續(xù)瘤內(nèi)微透析技術(shù)，認(rèn)為這是一種研究癌癥藥物治療局部藥物暴露與療效關(guān)系的非常有用的方法。Thompson 對馬法蘭ILI（isolated limb infusion）治療肢體惡性腫瘤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)馬法蘭峰值和濃度在血漿中明顯高于皮下和瘤內(nèi)，認(rèn)為腫瘤對馬法蘭并沒有優(yōu)先攝取，而腫瘤的反應(yīng)與馬法蘭的濃度有直接關(guān)系，他們認(rèn)為MD 非常適合ILI 用藥的檢測[37]。Brunner 總結(jié)了MD 在腫瘤方面的應(yīng)用，并與影像學(xué)方法和傳統(tǒng)方法做了對比，認(rèn)為MD 在化療藥物的開發(fā)中同樣具有廣泛前景[38]。

MD作為一項技術(shù)已走過半個世紀(jì)，在很多方面得到廣泛應(yīng)用，但其臨床應(yīng)用更多是在神經(jīng)外科方面，而且已經(jīng)非常成熟。以上我們總結(jié)了MD 在骨科方面的應(yīng)用。MD 的一些先天優(yōu)勢，如微創(chuàng)、定位取樣、多點監(jiān)測、連續(xù)取樣、多種檢測手段，可以讓我們更深入地了解”中間過程”，通過MD 進(jìn)行分子水平的檢測，在骨科仍具有眾多應(yīng)用前景。

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