端粒延長過程影響因素研究新進展

趙丹丹， 徐 慧， 彭劍雄

(中南大學(xué) 湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系， 長沙 410013)

端粒延長過程影響因素研究新進展

趙丹丹， 徐 慧， 彭劍雄

(中南大學(xué) 湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系， 長沙 410013)

端粒作為染色體的保護結(jié)構(gòu)，在維持染色體穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)完整上起著重要作用。而端粒酶具有過延長端粒的功能，是維持端粒長度的重要酶復(fù)合體。端粒酶延長端粒的過程是一個涉及多種因子多個環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程。主要涉及端粒自身結(jié)構(gòu)相關(guān)調(diào)節(jié)以及端粒酶相關(guān)的調(diào)節(jié)。端粒酶相關(guān)調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)系統(tǒng)中最重要的組成部分。包括TR自身結(jié)構(gòu)的影響，調(diào)節(jié)因子對TERT啟動子的調(diào)節(jié)等。

端粒;端粒酶;GQ;TPP1/POT1;TERRA;hTR;hTERT

端粒是位于真核細胞染色體末端的“帽子”結(jié)構(gòu)，其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。隨著細胞的分裂，端粒會不斷縮短直至危急長度。端粒的不斷縮短可以導(dǎo)致3種結(jié)果：細胞衰老，凋亡，攜帶不穩(wěn)定基因繼續(xù)分裂。端粒酶對端粒長度的維持是極為重要的。端粒酶延長端粒是一個涉及多因子，多水平的復(fù)雜過程，并受到多方面因素的調(diào)節(jié)，其中主要包括端粒的自身結(jié)構(gòu)的影響，端粒酶的相關(guān)調(diào)節(jié)以及DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的相關(guān)調(diào)節(jié)。端?；蚨肆Ｃ府惓Ｅc腫瘤的發(fā)生發(fā)展，DNA的損傷修復(fù)均有著密切關(guān)系。因此，了解端粒延長過程的影響因素能夠為以端粒，端粒酶為靶點的藥物研究及治療策略提供理論基礎(chǔ)和研究方向。

1 端粒自身結(jié)構(gòu)的影響

1.1 GQ結(jié)構(gòu)的影響

G-四聯(lián)體(G-quadruplex，GQ)是端粒3′單鏈懸突形成的堆疊結(jié)構(gòu)，可以保護染色體末端的穩(wěn)定性。在復(fù)制過程中，如果端粒末端的這種GQ空間結(jié)構(gòu)不能被有效打開會阻礙復(fù)制叉的移動，進而阻礙端粒末端的復(fù)制[1]。在染色體末端的延長及保護機制中，GQ對多種酶也都有調(diào)節(jié)作用，包括端粒酶。GQ可以通過加強端粒保護蛋白1(protection of telomere1，POT1)/ 三肽基肽酶Ⅰ(Tripeptidyl-peptidase 1，TPP1)對單鏈端粒DNA(single-stranded telomeric DNA，ssTEL)的競爭結(jié)合作用從而阻礙端粒酶延長端粒。POT1/TPP1對折疊或非折疊的GQ結(jié)構(gòu)均有競爭結(jié)合作用。在折疊的GQ結(jié)構(gòu)中，TOP1可以與其臨近的序列結(jié)合，從而阻止復(fù)制蛋白A(ReplicationproteinA,RPA)的結(jié)合。而在打開的GQ結(jié)構(gòu)中，POT1則通過包裹ssTEL阻礙RPA的結(jié)合[2]。

1.2 TPP1/POT1相關(guān)調(diào)節(jié)

POT1是端粒延長過程中端粒酶依賴的激活或抑制因子，而TPP1正是通過影響POT1的募集狀態(tài)，在端粒的延長過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外，TPP1通過提高端粒酶的持續(xù)合成能力提高延長效率。POT1-TPP1與引物結(jié)合，可以降低引物解離率并提高引物-模板移位效率，增加端粒酶與端粒的循環(huán)結(jié)合次數(shù)，從而提高端粒酶的持續(xù)合成能力[3]。RNA模板與引物的配對數(shù)目也會影響端粒酶的持續(xù)合成能力。增加引物與RNA模板臨近區(qū)的配對長度可以增加端粒酶與端粒的循環(huán)結(jié)合次數(shù)[4]。另外，研究發(fā)現(xiàn)TPP1-POT1二聚體對ssDNA的親和力要比單獨TOP1的親和力高[5]。TPP1-POT1還可以結(jié)合于端粒酶持續(xù)延長抑制位點，阻止抑制因子的干擾。

1.3 TERRA調(diào)節(jié)

TERRA是端粒轉(zhuǎn)錄的一段長的無編碼RNA，通過與TR模板堿基互補配對從而抑制端粒酶延長端粒的作用[6]。另外，它還可以通過與人異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A1(hnRNPA1)的相互作用進而阻礙端粒酶對端粒的延長。hnRNPA1通過與TERRA的結(jié)合可以釋放3′懸突末端[7]，促進RPA募集到端粒末端，從而完成RPA與POT1/TPP1的轉(zhuǎn)換。但研究發(fā)現(xiàn)，當hnRNPA1過表達卻會通過與端粒末端的引物區(qū)結(jié)合的方式抑制端粒酶的功能。因此，hnRNPA1與TERRA的平衡對端粒酶的功能有著重要影響。MRE11是作用于端粒3′G懸突末端的一種核酸酶。賴氨酸特異性去甲基酶1(lysine-specific demethylase 1，LSD1)與MRE11相互作用可以激活MRE11核酸酶活性，分解裸露狀態(tài)的端粒3′G懸突末端。并且隨著TERRA水平的升高，LSD1對MRE11的作用會進一步加強[8]。

2 端粒酶的相關(guān)調(diào)節(jié)

2.1 hTR的相關(guān)調(diào)節(jié)

哺乳動物端粒酶RNA(telomerase RNA, TR)二級結(jié)構(gòu)包含幾個高度保守結(jié)構(gòu)域：模板區(qū)(CR1)，假結(jié)區(qū)(CR2/CR3)[9]，反式激活模序(CR4/CR5), CR6/CR7區(qū)(H/ACA模序)。CR2/CR3易于結(jié)合抑制性寡核苷酸，封閉CR2/CR3可以有效抑制端粒酶活性。H/ACA 3′末端環(huán)的頂端包含Cajal盒(CAB)模序[10]，在TCAB1(端粒酶Cajal小體蛋白1)介導(dǎo)下與Cajal結(jié)合，使其局限于小體內(nèi)[11]。在小體內(nèi)端粒酶RNP可以整套傳遞到端粒上，在端粒延長過程中起著重要作用。CR4/5是由3個螺旋結(jié)構(gòu)的莖/莖環(huán)組成的Y字形結(jié)構(gòu)，對端粒酶的激活有著重要作用。在青鳉魚的研究中發(fā)現(xiàn)，在與TERT結(jié)合的過程，CR4/5內(nèi)部的這種鏈接方式可以提供一個靈活的支架，用于改變其空間構(gòu)象以便更好地與TERT結(jié)合[12]。其中P6.1對TERT的結(jié)合和端粒酶的活性的作用最為重要。值得注意的是P6.1的莖空間構(gòu)象而非莖堿基序列在TERT的結(jié)合及端粒酶的活性中起著重要作用[12]。近來，在酵母的研究中又發(fā)現(xiàn)了一個新的功能區(qū)TeSS，此區(qū)也具有保守性，位于莖-環(huán)IVc的末端。TeSS通過與Est2和Est3相互作用，使其穩(wěn)定的作用于假結(jié)區(qū)或模板區(qū)，從而在端粒酶的激活及全酶作用的發(fā)揮過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。

2.2 TERT的相關(guān)調(diào)節(jié)

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase , TERT)轉(zhuǎn)錄水平對酶活性的調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的，而hTERT啟動子則是端粒酶的調(diào)節(jié)機制中的重要位置。據(jù)報道，在多種腫瘤細胞中hTERT啟動子的熱突變點為C228T 和C250T[14-16]。hTERT啟動子的甲基化也能上調(diào)hTERT的表達，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細胞中TERT CpG島的甲基化能夠提高TERT的表達水平[17]。TERT調(diào)節(jié)方式主要有以下幾種。

2.2.1 腫瘤抑制因子的調(diào)節(jié)作用。p53、p63TAα、p63TAy、p73α和p73β為腫瘤抑制因子p53家族成員。這些腫瘤抑制因子通過不同的途徑抑制啟動子的轉(zhuǎn)錄，對于hTERT的轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)上都有著重要意義。最近研究發(fā)現(xiàn)，p53介導(dǎo)的抑制作用并不依賴于SP1，而是通過下調(diào)c-myc表達或者依賴E-盒/E2F途徑來調(diào)節(jié)hTERT的表達水平[18]。p63Taα是唯一一個依賴于SP1發(fā)揮抑制作用的因子，p63Taα通過與SP1結(jié)合，阻礙SP1與hTERT啟動子上的SP1結(jié)合位點[18]。p63TAγ介導(dǎo)的抑制作用完全依賴于E2F位點，誘導(dǎo)E2F突變能有效地抑制p63TAγ介導(dǎo)的hTERT啟動子抑制作用。p73α和p73β介導(dǎo)的抑制作用不依賴于SP1，E盒和E2F位點，而是受核酸因子Y 亞基(Nuclear Factor Y subunits，NF-YB)的調(diào)節(jié)。p73β對hTERT的抑制作用依賴于NF-YB2，而NF-YB1和NF-YB2共同調(diào)節(jié)p73α的抑制作用。

2.2.2 MYC相關(guān)途徑。MYC通過與TERT-34位E盒結(jié)合激活TERT，上調(diào)TERTmRNA表達水平。在免疫生發(fā)中心，近成熟的B細胞或培養(yǎng)的T細胞也可以通過MYC增加TERTmRNA表達量來激活酶活性。由于MYC是SRC，YES和FYN激酶的下游靶基因。所以在T/B細胞激活的早期其表達水平就已上調(diào)，再由MYC作用于TERT的啟動子區(qū)，從而激活端粒酶。c-myc/max與Mnt/max作用相反，體內(nèi)通過兩者間的平衡來調(diào)節(jié)hTERT的轉(zhuǎn)錄水平。c-myc與E盒結(jié)合后通過改變hTERT啟動子處染色體的構(gòu)象，增加染色體DNA的可接近性，并誘導(dǎo)H3K9，H4K16的乙酰化從而促進hTERT的轉(zhuǎn)錄。而Mnt作用則相反，Mnt通過與c-myc競爭性結(jié)合E盒，Mnt與E位結(jié)合后改變啟動子所在區(qū)段染色體構(gòu)型增加其密度，并誘導(dǎo)H3K9，H4K16的去乙?；瑥亩种妻D(zhuǎn)錄[19]。

2.2.3 HPV-E6相關(guān)途徑。HPV-E6可以通過組蛋白的乙酰化與二甲基化改變構(gòu)象，并且可以在轉(zhuǎn)錄后水平上上調(diào)MYC，從而調(diào)節(jié)TERT表達。同時E6也可以與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作用影響轉(zhuǎn)錄。Maz和Foxc1為新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄抑制因子。Maz可以結(jié)合到TERT的啟動子上，從而抑制轉(zhuǎn)錄過程。并且兩者均可通過組蛋白的乙酰化及染色體構(gòu)型的改變來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程。E6的表達可以阻礙Maz與啟動子的結(jié)合，同時增加Sp1與啟動子的結(jié)合，提高轉(zhuǎn)錄效率[20]。研究表明，敲除Maz可以進一步增加H3K9、H4K16的乙?；?，并在E6存在而情況下增加hTERT的表達。NFX1-91是另一種新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄抑制因子。NFX1-91可以通過與HDAC發(fā)生作用，從而維持基因的抑制狀態(tài)。而E6與E6AP相互作用可以促進NFX1-91的降解，從而解除組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的作用，促進hTERT的轉(zhuǎn)錄[20]。因此，E6通過與轉(zhuǎn)錄因子的作用，降解轉(zhuǎn)錄因子，改變?nèi)旧w構(gòu)象等方式促進端粒酶的轉(zhuǎn)錄過程。

3 DNA損傷修復(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)

細胞DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response,DDR)系統(tǒng)對穩(wěn)定端粒結(jié)構(gòu)和功能有重要作用。Metcalfe等發(fā)現(xiàn)ATM遺傳性突變的AT患者體細胞端粒長度縮短加速，并且染色體末端融合頻率升高。更有研究發(fā)現(xiàn)在cdc9-1細胞中激活DNA損傷信號會導(dǎo)致端粒的增長。DDR可以通過抑制端粒酶活性的方式影響端粒長度，也可以直接作用于端粒。由于端粒酶不僅能在端粒末端延長，也能在非端粒末端延長，如BSR[21]。為了防止端粒酶的錯誤延長，在DNA損傷細胞中，Pif1通過發(fā)生磷酸化抑制端粒酶的活性。ATM和ATB是DDR中兩種重要激酶，而兩者與端粒均有生理性結(jié)合，抑制ATM和ATB都能導(dǎo)致端粒長度的變化和染色體末端的融合。另外，多種參與DDR的蛋白因子對端粒的穩(wěn)定性也有重要影響，如Ku[22]、MRN蛋白復(fù)合體等。雙鏈損傷修復(fù)(double-strand break repair，BSR)主要有兩種方式，一是同源重組，一是誘導(dǎo)損傷復(fù)制(break induced replication ，BIR)，兩種途徑均會導(dǎo)致端粒延長。BIR需要功能性端粒酶，核心DNA損傷信號途徑Mec1-Rad9-Rad53，BIR 修復(fù)途徑成分Rad51、Rad52、Pol32和Pif1。Mec1-Rad53介導(dǎo)Pif1的磷酸化，此過程對于雙鏈損傷中端粒酶的抑制，BIR中Pif1功能的發(fā)揮，以及cdc9-1 細胞中端粒的延長均有著重要作用[23]。

4 結(jié)束語

端粒的延長是一個涉及多因子多水平的復(fù)雜過程。多種調(diào)節(jié)因子相互關(guān)聯(lián)，相互影響形成一個復(fù)雜而龐大的調(diào)控體系。無論是端粒自身結(jié)構(gòu)的影響，還是端粒酶相關(guān)的調(diào)節(jié)都對體內(nèi)端粒DNA長度的維持有著重要意義。端粒調(diào)節(jié)系統(tǒng)的失衡是導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生的根本原因。尤其在DNA損傷與修復(fù)中，端粒的作用越來越受到重視。因此，對此過程中調(diào)節(jié)因子及調(diào)節(jié)因子間的相互作用的深入研究，不僅有助于我們更加徹底的了解端粒、端粒酶，更能為端粒相關(guān)疾病提供更多的診斷方法和治療策略。

[1]Novo C L, Londono-Vallejo J A. Telomeres and the nucleus[J]. Semin Cancer Biol, 2013, 23(2): 116-124.

[2]Ray S, Qureshi M H, Malcolm D W, et al. RPA-mediated unfolding of systematically varying G-quadruplex structures[J]. Biophys J, 2013, 104(10): 2235-2245.

[3]Latrick C M, Cech T R. POT1-TPP1 enhances telomerase processivity by slowing primer dissociation and aiding translocation[J]. EMBO J, 2010, 29(5): 924-933.

[4]Chen L Y, Majerska J, Lingner J. Molecular basis of telomere syndrome caused by CTC1 mutations[J]. Genes Dev, 2013, 27(19): 2099-2108.

[5]Nandakumar J, Bell C F, Weidenfeld I, et al. The TEL patch of telomere protein TPP1 mediates telomerase recruitment and processivity[J]. Nature, 2012, 492(7428): 285-289.

[6]Cusanelli E, Chartrand P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology[J]. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2014, 5(3): 407-419.

[7]Redon S, Zemp I, Lingner J. A three-state model for the regulation of telomerase by TERRA and hnRNPA1[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(19): 9117-9128.

[8]Porro A, Feuerhahn S, Lingner J. TERRA-reinforced association of LSD1 with MRE11 promotes processing of uncapped telomeres[J]. Cell Rep, 2014, 6(4): 765-776.

[9]Martinez P, Blasco M A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(3): 161-176.

[10]Gupta S K, Kolet L, Doniger T, et al. The trypanosoma brucei telomerase RNA (TER) homologue binds core proteins of the C/D snoRNA family[J]. FEBS Lett, 2013, 587(9): 1399-1404.

[11]Her J, Chung I K. The AAA-ATPase NVL2 is a telomerase component essential for holoenzyme assembly[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 417(3): 1086-1092.

[12]Kim N K, Zhang Q, Feigon J. Structure and sequence elements of the CR4/5 domain of medaka telomerase RNA important for telomerase function[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(5): 3395-3408.

[13]Laterreur N, Eschbach S H, Lafontaine D A, et al. A new telomerase RNA element that is critical for telomere elongation[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(16): 7713-7724.

[14]Arita H, Narita Y, Fukushima S, et al. Upregulating mutations in the TERT promoter commonly occur in adult malignant gliomas and are strongly associated with total 1p19q loss[J]. Acta Neuropathol, 2013, 126(2): 267-276.

[15]Huang F W, Hodis E, Xu M J, et al. Highly recurrent TERT promoter mutations in human melanoma[J]. Science, 2013, 339(6122): 957-959.

[16]Nault J C, Mallet M, Pilati C, et al. High frequency of telomerase reverse-transcriptase promoter somatic mutations in hepatocellular carcinoma and preneoplastic lesions[J]. Nat Commun, 2013(4): 2218.

[17]De Wilde J, Kooter J M, Overmeer R M, et al. hTERT promoter activity and CpG methylation in HPV-induced carcinogenesis[J]. BMC Cancer, 2010, 10: 271.

[18]Yao Y, Bellon M, Shelton S N, et al. Tumor suppressors p53, p63TAalpha, p63TAy, p73alpha, and p73beta use distinct pathways to repress telomerase expression[J]. J Biol Chem, 2012, 287(24): 20737-20747.

[19]Wahlstrom T, Belikov S, Arsenian H M. Chromatin dynamics at the hTERT promoter during transcriptional activation and repression by c-Myc and Mnt in Xenopus leavis oocytes[J]. Exp Cell Res, 2013, 319(20): 3160-3169.

[20]Xu M, Katzenellenbogen R A, Grandori C, et al. An unbiased in vivo screen reveals multiple transcription factors that control HPV E6-regulated hTERT in keratinocytes[J]. Virology, 2013, 446(1/2): 17-24.

[21]Doksani Y, de Lange T. The role of double-strand break repair pathways at functional and dysfunctional telomeres[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2014, 6(12): a16576.

[22]de Sena-Tomas C, Yu E Y, Calzada A, et al. Fungal Ku prevents permanent cell cycle arrest by suppressing DNA damage signaling at telomeres[J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43(4): 2138-2151.

[23]Vasianovich Y, Harrington L A, Makovets S. Break-induced replication requires DNA damage-induced phosphorylation of Pif1 and leads to telomere lengthening[J]. PLoS Genet, 2014, 10(10): e1004679.

Progress in effecting factors on telomere elongated process

ZHAO Dan-dan, XU Hui, PENG Jian-xiong

(Department of Clinical Laboratory Medicine, Xiangya Medical College, Central South University, Changsha 410013, China)

As the protection of the chromosome structure, telomere plays an important role in maintaining the stability and structural integrity of chromosomes. The telomerase is one of the important enzymes maintaining telomere length, and telomere elongated process is a complicated process involving a variety of factors, mainly related to telomere structure and telomerase regulation. The telomerase related regulation is the most important part of the control system, including the influence of TR structure, regulation on TERT promoter etc.

telomere; telomerase; GQ; TPP1/POT1; TERRA; hTR; hTERT

2015-01-16；

2015-02-13

湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目(CY14277)

趙丹丹，碩士研究生，研究方向為臨床生物化學(xué)和分子診斷；

彭劍雄，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為臨床生物化學(xué)和分子診斷，E-mail: jxpeng@csu.edu.cn。

R394.8

A

2095-1736(2015)05-0089-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.089