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    地被菊‘紫妍’和‘紐9722’的再生體系建立

    2015-04-08 06:49:26劉晨旭董鳳麗周蘊(yùn)薇
    草業(yè)科學(xué) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:莖段外植體生根

    劉晨旭,馬 欣,董鳳麗,周蘊(yùn)薇

    (東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150040)

    地被菊(Chr ysanthemum morifolium)是菊科菊屬多年生草本花卉,是菊花的一個(gè)新品種群。具有植株低矮、株型緊湊、花色豐富、抗性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來,植物基因工程的發(fā)展為加快培養(yǎng)具有優(yōu)良特性的菊花品種提供了可能,特別是在分子育種方面,可以利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和方法定向修飾菊花的某些目標(biāo)性狀,使其在抗逆性、花色、花期等方面具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[1]。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗性基因轉(zhuǎn)入到菊花的研究已取得了很大成功[2-4]。但基因轉(zhuǎn)化需要建立良好的植物受體系統(tǒng),其中外植體的選擇以及能產(chǎn)生較高再生能力的培養(yǎng)體系的確立是轉(zhuǎn)化體系建立的關(guān)鍵[5]。目前,菊花的再生體系研究已經(jīng)普遍展開。通過調(diào)節(jié)不同的激素種類和濃度配比,利用莖段[6]、葉 片[7-8]、葉 柄[1]、花 瓣[9]、花 蕾[10]等 作 為 外植體,建立起高效、快捷的再生體系已經(jīng)成為了可能。但由于菊花受基因型影響較大,不同品種之間存在一定差異,所以再生體系一般不具有普遍性。呂 晉 慧 等[11]對(duì) 地 被 菊 品 種 ‘紫 妍’(C.morif olium cv.ziyan)進(jìn)行了葉片不定芽的再生研究,初步研究了‘紫妍’的最適葉片分化培養(yǎng)基。本研究以地被菊‘紫妍’和‘紐9722’(C.morif olium cv.niu 9722)為研究對(duì)象,探索葉片愈傷組織的誘導(dǎo)、芽的分化、莖的增殖以及繼代生根的最適宜條件,旨在篩選出高效、穩(wěn)定的再生體系,以期為今后的地被菊轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ),加快分子育種進(jìn)程。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    選擇東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院花卉研究所內(nèi)地被菊‘紫妍’、‘紐9722’的帶腋芽莖段為外植體。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 無菌苗的獲得及最佳消毒時(shí)間的篩選 將采集到的‘紫妍’、‘紐9722’帶腋芽莖段去除底部和中部的大葉子,用洗衣粉浸泡5 min后,洗去表面泥土,再在流水下沖泡1~2 h,徹底洗凈。放入超凈工作臺(tái),75%酒精消毒30 s,無菌水沖洗兩次后放入配好的2% NaCl O 溶液中分別浸泡2、4、6、8、10 min,期間不停搖晃,使之與莖段充分接觸,無菌水徹底沖洗4~5 次,取出后用無菌濾紙吸凈表面水分,接入MS培養(yǎng)基上。10 d 后統(tǒng)計(jì)死亡率、污染率、萌發(fā)率。

    1.2.2 葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及芽的分化 待植株正常生長后,選擇繼代20 d左右生長狀況良好的植株,將其中部及上部發(fā)育狀況基本一致的葉片剪下,切成5 mm×5 mm 的葉盤,近軸面接觸培養(yǎng)基,接種于MS培養(yǎng)基添加不同濃度6-BA(1.0、1.5、2.0 mg·L-1)和NAA(0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mg·L-1)中,誘導(dǎo)葉片愈傷組織的形成及芽的分化。每個(gè)處理接種30個(gè)葉片,3次重復(fù)。12 d更換一次培養(yǎng)基,15 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率,40 d統(tǒng)計(jì)芽的分化率和出芽數(shù)。

    1.2.3 莖段的增殖 選擇繼代20 d左右生長狀況良好的‘紐9722’無菌苗,切取帶兩個(gè)腋芽的莖段,接入到MS培養(yǎng)基添加不同濃度6-BA(0、1.0、2.0、3.0 mg·L-1)和NAA(0、0.2、0.5、1.0 mg·L-1)中,觀察‘紐9722’莖段的增殖情況。每個(gè)處理接種20個(gè)莖段,3 次重復(fù)。12 d更換一次培養(yǎng)基,觀察植株生長及增殖情況,30 d統(tǒng)計(jì)莖段增殖系數(shù)。

    1.2.4 繼代生根誘導(dǎo) 待分化出的不定芽生長健康后,切取約2 c m 不定芽接入MS培養(yǎng)基添加不同濃度NAA(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1)和1/2 MS培養(yǎng)基添加不同濃度NAA(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1)中誘導(dǎo)生根。每個(gè)處理接種10個(gè)不定芽,3次重復(fù),觀察根及植株生長情況,20 d時(shí)計(jì)生根數(shù)和生根率。

    1.2.5 煉苗和移栽 生根的組培苗約20 d時(shí),選擇根系發(fā)達(dá)且生長健壯的組培苗,將其去膜放置2 d進(jìn)行煉苗,然后拿出并洗凈根部的殘余培養(yǎng)基,將其移栽至提前高溫滅菌后的土中(土∶蛭石=1∶1),放至適當(dāng)環(huán)境下培養(yǎng),30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

    1.3 培養(yǎng)條件

    以MS為基本培養(yǎng)基,含蔗糖30 mg·L-1、瓊脂7~8 g·L-1,p H 5.8;1/2 MS 培養(yǎng)基中大量元素減半,p H 值不變。121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度是(25±2)℃,光照強(qiáng)度是2 000 l x,光照時(shí)間是12 h·d-1。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    參照汪曉沙等[12]的計(jì)算方法:

    污染率=(污染個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù))×100%;

    萌發(fā)率=(萌發(fā)個(gè)數(shù)/存活個(gè)數(shù))×100%;

    誘導(dǎo)率=(形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;

    再生頻率=(再生出不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;

    外植體平均再生芽數(shù)=外植體再生不定芽總數(shù)/接種外植體數(shù);

    莖段外植體增殖系數(shù)=外植體增殖不定芽總數(shù)/接種外植體數(shù);

    生根率=(生根幼苗數(shù)/接種幼苗數(shù))×100%;

    生根系數(shù)=生根總數(shù)/生根幼苗數(shù)。

    數(shù)據(jù)處理采用EXCEL、SPSS 17.0 軟件進(jìn)行ANOVA 顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒及出芽狀況的影響

    兩個(gè)品種的污染率均隨著消毒時(shí)間的增加而減?。ū?),表明2%的Na Cl O 溶液對(duì)莖段的消毒效果明顯。萌發(fā)率也隨著消毒時(shí)間的增加而減小,過高濃度Na Cl O 溶液可能傷害幼嫩莖段,影響其萌發(fā)。對(duì)于‘紫妍’品種,6 min及以上的消毒時(shí)間對(duì)污染率的影響差異不顯著(P>0.05),而6 min及以內(nèi)的消毒時(shí)間對(duì)萌發(fā)率影響差異不顯著,綜合兩個(gè)因素,6 min是對(duì)于品種‘紫妍’最適宜的消毒時(shí)間。品種‘紐9722’在8 min時(shí)污染率較低,雖然與10 min處理的污染率差異不顯著,但萌發(fā)率顯著高于10 min的處理(P<0.05),所以8 min是最好的消毒時(shí)間。

    2.2 不同激素濃度對(duì)葉片分化的影響

    添加不同濃度6-BA 和NAA 的培養(yǎng)基對(duì)于地被菊葉片的分化起著較大的作用(表2)。通過試驗(yàn)觀察,葉片接觸分化培養(yǎng)基7 d左右時(shí),在切口處開始形成嫩綠的愈傷組織。愈傷組織逐漸增大,15 d后出現(xiàn)大量嫩綠色芽點(diǎn),3~4周芽點(diǎn)開始長成小芽叢,并逐漸增多、長大。選擇的激素濃度配比對(duì)于兩個(gè)品種均能誘導(dǎo)出愈傷組織,誘導(dǎo)率均為100%。品種‘紫妍’總體分化率較高,6-BA 濃度不變時(shí),1.0 mg·L-1的NAA 最能促進(jìn)分化,且出芽數(shù)較高,過低和過高的NAA 都會(huì)使分化率下降;當(dāng)6-BA 濃度為1.5和2.0 mg·L-1時(shí),1.0 mg·L-1NAA 下,分化率都很高,顯著高于其他濃度(P<0.05)且二者差異不顯著(P>0.05),但6-BA 為2.0 mg·L-1時(shí)的出芽數(shù)顯著高于1.5 mg·L-1時(shí)的出芽數(shù)(P<0.05),所以品種‘紫妍’的最適葉片分化培養(yǎng)基是MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1。品種‘紐9722’的最高分化率出現(xiàn)在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1時(shí),但僅為45.59%。

    表1 不同消毒時(shí)間對(duì)兩個(gè)地被菊品種外植體污染和萌發(fā)的影響Table 1 Effects of sterilization ti me on explants’contamination and ger mination efficiency of t wo C.morif olium cultivars

    表2 不同濃度的6-BA和NAA對(duì)兩個(gè)地被菊品種葉片分化的影響Table 2 Effects of 6-BA and NAA on the differentiation capability of leaf blades of t wo C.morif olium cultivars

    表3 不同6-BA和NAA濃度對(duì)‘紐9722’莖段增殖的影響Table 3 Effects of 6-BA and NAA on the proliferation of stem segments of C.morif olium ‘niu 9722’

    2.3 不同激素濃度對(duì)‘紐9722’莖段增殖的影響

    接種3 d時(shí),莖段傷口處膨大,10 d時(shí)莖段腋芽處開始有叢生芽萌發(fā),且叢生芽生長很快??傮w而言,品種‘紐9722’的莖段增殖狀況良好(表3),當(dāng)6-BA 2.0 mg·L-1且NAA 0.5 mg·L-1時(shí),增殖數(shù)最高,達(dá)到了10.05,與其他濃度處理相比差異顯著(P<0.05),且生長狀況良好,是其莖段增殖的最適培養(yǎng)基。

    2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)生根的影響

    生根培養(yǎng)7 d時(shí),基部開始生根,14 d后大量生根,生根率均為100%。在兩種基本培養(yǎng)基中,隨著添加NAA 濃度的增加,兩個(gè)品種的生根系數(shù)均先增加后減少(表4、表5)。品種‘紫妍’在添加0.2 mg·L-1的NAA 的兩種基本培養(yǎng)基中生根系數(shù)都很高,分別為13.53(MS)和15.50(1/2 MS),且根系多、粗、密集,但后者顯著高于前者(P<0.05);品種‘紐9722’在添加0.3 mg·L-1NAA 的1/2 MS培養(yǎng)基中生根系數(shù)達(dá)到最高,為14.87,顯著高于其他處理(P <0.05),根系多、粗、密集。所以,品種‘紫妍’的最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1;品種‘紐9722’的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.3 mg·L-1。

    表4 基本培養(yǎng)基添加不同濃度NAA對(duì)兩個(gè)地被菊品種生根的影響Table 4 Effects of NAA in basic mediu m on rooting of t wo C.morif olium cultivars

    經(jīng)過煉苗和移栽30 d 后,品種‘紫妍’、‘紐9722’成活率均為100%,且長勢(shì)良好(圖1、圖2)。兩個(gè)品種經(jīng)過脫毒、葉片分化、莖段增殖、生根移栽過程,建立起完整的再生體系。

    3 討論與結(jié)論

    菊花品種的外植體選擇種類較多,多數(shù)研究以葉片和莖段為外植體,獲得了再生率較高的再生體系。相比而言,利用莖段為外植體獲取較為方便,且受強(qiáng)消毒劑影響程度較小,與葉片相比,莖段誘導(dǎo)無菌苗更快捷,周期更短。大量研究證明,0.1%升汞具有良好的消毒效果[13],但升汞對(duì)環(huán)境有一定的污染,用后必須回收處理,本研究采用2% Na Cl O 溶液進(jìn)行外植體脫毒,效果良好,和馬欣等[14]的研究結(jié)果基本符合,并且環(huán)保無污染?!襄?、‘紐9722’莖段脫毒的最適時(shí)間分別是6、8 min,不同的品種基因型存在差異,植物體本身對(duì)于消毒劑的抗性也不同,葉片的薄厚、莖段的粗細(xì)也有可能是造成最適消毒時(shí)間差異的原因。

    在誘導(dǎo)葉片分化不定芽時(shí),以往多數(shù)研究表明[10,12],6-BA 和NAA 的組合對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯。本研究中,品種‘紫妍’的葉片最適分化培養(yǎng)基 為 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1,最高分化率為92.22%,出芽數(shù)為7.60。呂晉慧等[11]的研究也表明品種‘紫妍’在這一激素配比下的分化率最高,為93%,出芽數(shù)為12.4;‘紫妍’在 MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1時(shí)分化率也很高,本研究與之存在差異,可能是試驗(yàn)季節(jié)、試驗(yàn)環(huán)境條件的不同引起的。通過觀察發(fā)現(xiàn),當(dāng)6-BA 濃 度 一 定,NAA 濃 度 較 低(0.2 mg·L-1)時(shí),愈傷組織雖然出芽率不高,但較為致密、緊實(shí)(圖3 A)。而NAA 濃度在0.5 mg·L-1時(shí),愈傷組織容易成疏松水漬狀,不定芽也容易玻璃化(圖3B)。原因可能是低濃度NAA 有利于促進(jìn)愈傷組織的形成。而對(duì)于品種‘紐9722’,葉片最高分化率僅為45.59%,沒有成功建立穩(wěn)定的再生體系,通過觀察發(fā)現(xiàn)愈傷組織體積較大,但出芽率過低,而且褐化情況較嚴(yán)重(圖3C),這一問題還需進(jìn)一步研究解決。

    圖1 ‘紫妍’再生體系建立的過程Fig.1 The establishment process of‘ziyan’regeneration system

    王麗華等[15]研究發(fā)現(xiàn),過高的6-BA 濃度和過低的NAA 濃度會(huì)使植株的長勢(shì)變?nèi)?;但吳月亮等?]的研究表明,6-BA濃度與NAA濃度之比大于10時(shí),增殖效果最好。本研究表明,‘紐9722’的最適莖段增殖培養(yǎng) 基 是MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1,增殖后的無菌苗生長良好,增殖系數(shù)為10.05,高于之前一些品種的增殖研究,表明不同品種同在最適增殖培養(yǎng)基下,增殖系數(shù)有差異。

    圖2 ‘紐9722’再生體系建立的過程Fig.2 The establishment process of‘niu 9722’regeneration system

    地被菊較容易生根,多而粗壯的根系有利于植株的移栽成活,使得建立起來的再生體系更加完整。MS培養(yǎng)基是用來繼代無菌苗的常用培養(yǎng)基,既能使幼苗地下部分生根,又能使地上部分健壯生長。但一般生根培養(yǎng)基為1/2 MS和1/2 MS添加低濃度NAA 或IBA。品種‘早小菊’的最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+I(xiàn)BA 3.0 mg·L-1[10],1/2 MS+NAA 0.1 mg·L-1最適宜品種‘神馬’和‘綠鸚哥’生根[16-17]???見,IBA 和NAA 對(duì) 于 不 同 品 種 的 生 根有著不同的影響,主要與基因型有關(guān)。有的研究表明,少量活性炭的添加能夠促進(jìn)生根,如品種‘日本紅’的最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.8 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1[18]。本研究表明,品種‘紫妍’最適生根培養(yǎng)基是1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1,生根系數(shù)為15.50;品種‘紐9722’最適生根培養(yǎng)基是1/2 MS+NAA 0.3 mg·L-1,生根系數(shù)為14.87,與大多數(shù)研究基本一致。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),高濃度的NAA 會(huì)促進(jìn)根的增粗,但同時(shí)影響了根的增多和伸長,當(dāng)NAA 濃度大于0.4 mg·L-1時(shí),能明顯觀察到無菌苗根部切口處褐化、粗大,抑制了根的生長,導(dǎo)致根發(fā)生畸形,同時(shí)觀察到地上部分生長緩慢,可能的原因是過高的NAA使根部褐化,抑制了營養(yǎng)從根部向上的運(yùn)輸。

    圖3 NAA處理的‘紫妍’和‘紐9722’的愈傷組織形態(tài)Fig.3 The callus mor phological of‘niu 9722’and‘ziyan’treated with NAA

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