類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血B細胞FcγR IIb表達

黃林芳，梁　迪，莫文秀，周　晨，李　菁，張　烜，廖湘平，鄭文潔

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點實驗室，北京 100730)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種原因不明的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、進行性多關(guān)節(jié)炎，影響關(guān)節(jié)滑膜功能，導(dǎo)致關(guān)節(jié)進展性的破壞、疼痛及功能障礙。其致病機制涉及多種免疫細胞，越來越多的研究證明，B細胞在RA發(fā)病機制中起著重要作用[1]。研究顯示，RA外周循環(huán)及滑膜等組織中定位的B細胞可通過參與RA自身抗體的產(chǎn)生[2]、作為抗原呈遞細胞活化T細胞[3-4]、分泌炎性細胞因子[5]等參與RA的炎性反應(yīng)和骨破壞。抑制性受體FcγR IIb(Fc gamma receptor IIb)是在B細胞表面表達的抑制性受體，能反饋性抑制B細胞受體(B cell receptor，BCR)識別抗原產(chǎn)生的活化信號，在防止B細胞過度激活、維持體液免疫耐受中起重要作用[6-7]。其在單核巨噬細胞及中性粒細胞的活化方面也起著重要作用[8]。國外研究表明，F(xiàn)cγR IIb表達異常和基因多肽性與自身免疫性疾病發(fā)病、易感性和炎性反應(yīng)的強度密切相關(guān)[7]。目前，國內(nèi)針對FcγR IIb的研究較少，相關(guān)研究主要針對原發(fā)性干燥綜合征[9]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[10-11]等。本研究探討RA患者外周血B細胞表面FcγR IIb的表達及臨床意義。

對象和方法

病例選擇

2014年10月至2015年8月北京協(xié)和醫(yī)院就診的RA患者，診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會分類標準診斷或歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟與美國風(fēng)濕病學(xué)會聯(lián)合制定的2010年成人RA分類標準。入組前6個月未用激素及免疫抑制劑治療。排除感染、腫瘤及其他自身免疫性疾病。健康對照來自年齡、性別匹配的健康志愿者，無風(fēng)濕病史和風(fēng)濕病家族史，并排除惡性腫瘤或其他慢性、活動性病毒感染等。本研究得到北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的批準，患者及健康對照者均簽署了知情同意書。

資料收集和指標判斷

收集患者的病程、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗cyclic citrullinated peptide抗體，抗CCP抗體)、血清IgG、IgM、IgA水平等臨床信息。疾病活動度采用病情活動度評分(disease activity score 28，DAS28)系統(tǒng)進行評估，DAS28≤2.6定義為低度活動期，3.25.1為高度活動期[12]。

主要試劑與儀器

流式細胞儀檢測所用單克隆抗體；異藻藍蛋白(APC)-CD19、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCP-Cy5.5)-CD27、藻紅蛋白(PE)-CD32，皆購于美國BD公司；人全血細胞裂紅液購自美國BD公司；FACSAriaⅡ流式細胞儀購自美國BD公司。

實驗方法

標本處理：采集肝素鈉抗凝外周血1 ml，加入裂紅液室溫裂解10 min，1 200 r/min，離心6 min，棄上清，加入磷酸鹽緩沖液，再離心1次終止裂紅反應(yīng)，磷酸鹽緩沖液重懸細胞并計數(shù)。

B細胞亞群表面FcγR IIb檢測：磷酸鹽緩沖液調(diào)整細胞濃度為4×105/100 μl，加入CD19-APC、CD27-PerCP-Cy5.5、CD32-PE，對照管加入相應(yīng)的同型對照。4℃冰箱避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌，加1%甲醛固定液固定細胞，流式上機檢測。根據(jù)前向角FSC(forward scatter)和側(cè)向角SSC(side scatter)參數(shù)在全血細胞中圈定淋巴細胞門，后根據(jù)CD19+圈選B細胞，再用CD19、CD27將B細胞分成以下3個亞群，初始B細胞(naive B cell，CD19+CD27-)，記憶B細胞(memory B cell，CD19+CD27+)，漿母細胞(plasmablasts，CD19+CD27high)。檢測B細胞各亞群表面FcγR IIb的陽性細胞百分比和平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)。

統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。流式細胞儀分析應(yīng)用flowjo 7.6軟件進行數(shù)據(jù)處理。經(jīng)過Kolmogorov-Smirnov檢驗為正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值±標準差表示；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)表示。所有正態(tài)分布、方差齊數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

人口統(tǒng)計學(xué)及臨床特點

本研究共納入初治RA患者20例，其中男3例，女17例，平均(45.75±11.34)歲；病程為2個月～20年，中位數(shù)為5年；入組時DAS28為1.46～7.47分，平均為(5.25±1.95)分，其中低度活動者4例，中度活動者4例，高度活動者12例。健康志愿者共15名，其中男3名，女12名；平均年齡(40.47±11.87)歲。各組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

外周血B細胞亞群

20例RA患者CD19+CD27-初始B細胞占CD19+B細胞的百分率為(78.11±9.00)%，顯著高于健康對照組(64.24±13.24)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.691，P<0.05)。RA患者CD19+CD27+記憶性B細胞占CD19+B細胞的(18.30±8.94)%，顯著低于健康對照組的(32.31±13.67)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.665，P=0.001)。RA患者與健康對照組漿母細胞占B細胞的百分率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

B細胞亞群FcγR IIb表達差異

20例RA患者外周血CD19+CD27+記憶性B細胞表面FcγR IIb的MFI[(7 571.95±4 494.53)%]顯著低于健康對照組[(13 304.87±6 568.19)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.068，P=0.004)；初始B細胞CD19+CD27-、漿母細胞CD19+CD27high表面FcγR IIb的MFI與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖1類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組與健康對照組外周血B細胞亞群比較

Fig1Comparison of peripheral B cell subgroup between the rheumatoid arthritis and healthy controls

A：根據(jù)CD19、CD27將B細胞分成3個亞群，即初始B細胞(CD19+CD27-)、記憶性B細胞(CD19+CD27+)、漿母細胞(CD19+CD27high)；B：初始B細胞比較；C：記憶性B細胞比較；D：漿母細胞的比較；APC：異藻藍蛋白；PreCP-Cy 5.5：葉綠素蛋白偶聯(lián)物；HC：健康對照組；RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組；**P<0.01

圖2類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康對照者記憶性B細胞表面FcγR IIb表達比較

Fig2Comparison of expression of FcγR IIb on surface of memory B cell between the rheumatoid arthritis and healthy controls

FcγR IIb比較采用平均熒光強度；A：初始B細胞；B：記憶B細胞；C：漿母細胞；MFI：平均熒光強度；HC：健康對照組；RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組；**P<0.01

外周血記憶性B細胞FcγRIIb表達與疾病活動相關(guān)性分析

RA患者IgG分泌水平與CD19+CD27+記憶性B細胞表面FcγR IIb的MFI呈負相關(guān)(r=-0.732，P=0.007)，而與IgM、IgA的分泌無明顯相關(guān)性。RA患者ESR、CRP、DAS28、類風(fēng)濕因子、抗CCP的水平與CD19+CD27+記憶B細胞表面FcγR IIb的MFI無明顯相關(guān)性(圖3)。

討　　論

FcγR IIb是一類位于染色體1q23上、相對分子質(zhì)量約為40 000的跨膜糖蛋白[13]，是唯一的抑制性受體，主要表達于B細胞，單核巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜堿性粒細胞和中性粒細胞中也有表達，而在T細胞和自然殺傷細胞中沒有發(fā)現(xiàn)表達[6]。FcγR IIb可介導(dǎo)對多種免疫細胞的負反饋調(diào)節(jié)反應(yīng)，其可通過依賴或不依賴胞漿區(qū)免疫受體酪氨酸抑制基序的方式起到抑制細胞激活的作用，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、抗體的分泌、淋巴因子的釋放等多種生物學(xué)效應(yīng)[5]。FcγR IIb表達異常與多種自身免疫病發(fā)病、易感性和炎性反應(yīng)的強度密切相關(guān)，如FcγR IIb敲除的C57BL/6小鼠會產(chǎn)生自身抗體及出現(xiàn)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的狼瘡樣自身免疫病的表型[14]；系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE和PSS患者記憶性B細胞和漿細胞表面FcγR IIb的表達下降，并與病情活動相關(guān)[8-13]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者純合子FcγR IIb-I232T突變體的原代B細胞，不能阻止BCR與CD19的突觸共定位，導(dǎo)致下游信號傳導(dǎo)分子對PI3K的異常調(diào)節(jié)，促使了B淋巴細胞的異?；罨痆15]。

對RA的研究顯示，F(xiàn)cγR IIb表達缺失的小鼠更容易誘導(dǎo)出膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型[16]。且日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)在一種129種系來源的位于sle16位點遠端攜帶FcγR IIb基因無效突變的C57BL/6小鼠將自發(fā)產(chǎn)生RA的一些臨床關(guān)節(jié)炎癥狀，如滑膜的增生及嚴重的多發(fā)關(guān)節(jié)的骨及軟骨的破壞[17]。臨床研究報道FcγR IIb啟動子及跨膜區(qū)的等位基因變異與RA存在一定關(guān)系，并且與RA患者抗CCP抗體水平及血清IL-6等細胞因子水平相關(guān)[18]。RA患者B細胞表面該受體表達較健康對照顯著下降[19]。另有研究顯示，F(xiàn)cγR IIb在RA記憶性B細胞及漿細胞均顯著下降，且與高滴度抗MCV抗體具有相關(guān)性[20]。本研究首次在國內(nèi)研究了初治RA患者外周血B細胞分布及其FcγR IIb的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者外周血記憶性B細胞占總B細胞的百分率低于健康對照，且進一步發(fā)現(xiàn)RA患者外周血記憶性B細胞FcγR IIb的表達亦顯著下降，與國外報道一致。

圖3類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者記憶性B細胞表面FcγR IIb表達與臨床指標的相關(guān)性

Fig3Relationship of expression of FcγR IIb on surface of memory B cell in the patients with rheumatoid arthritis and clinical index

當免疫復(fù)合物與BCR共交聯(lián)，通過BCR下游Lyn激酶對免疫受體酪氨酸抑制基序的磷酸化，促使FcγR IIb受體活化并募集磷酸酶SHIP1及SHIP2，進而對BCR的下游信號通路產(chǎn)生抑制作用，阻斷鈣信號通路，防止B細胞產(chǎn)生過量的自身抗體[21-22]。FcγR IIb還可通過抑制B細胞類別轉(zhuǎn)換及分化為漿細胞而抑制抗體分泌[23]。本結(jié)果顯示，RA患者外周血中記憶性B細胞表面的FcγR IIb表達水平顯著下降，并與血清IgG水平呈負相關(guān)，提示FcγR IIb可能在RA的體液免疫中發(fā)揮了一定的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，XmAb5871是針對FcγR IIb的靶向治療藥物，通過交聯(lián)B細胞表面BCR及FcγR IIb，以達到抑制B細胞異常活化及功能的作用，通過利用RA患者外周血單個核細胞進行XmAb5871刺激體內(nèi)及體外試驗，發(fā)現(xiàn)可以抑制B細胞產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)，提示其可能成為抑制RA自身反應(yīng)性B細胞活性的新治療策略[24]。

綜上所述，RA患者外周血記憶性B細胞占總B細胞的百分率顯著下降且其FcγR IIb表達水平顯著下降，并與血清IgG水平呈負相關(guān)，提示FcγR IIb可能在RA的體液免疫中發(fā)揮了一定的作用。進一步對其功能的研究有助于更好地揭示RA發(fā)病機制，同時為尋找治療新靶點提供新線索。

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