基于DNA特征的藍藻分類方法研究進展

侯惠靜，王素英，*，郭斌輝

（1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

基于DNA特征的藍藻分類方法研究進展

侯惠靜1，2，王素英1，2，*，郭斌輝1，2

（1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

傳統(tǒng)的形態(tài)學分類標準較模糊以及藍藻的形態(tài)易變等問題造成了傳統(tǒng)形態(tài)分類方法難以準確地對藍藻進行分類。新的分子生物學的方法已經被用于解讀遺傳信息和完善藍藻的分類系統(tǒng)。當今，藍藻的系統(tǒng)分類研究及其基因型研究主要依靠基于DNA特征的分子分類方法，并且獲得了很好的結果。本文歸納總結了多種基因DNA特征的分子分類方法及特征性標記基因在藍藻分類中的應用，并且對藍藻的分類研究進行了展望。

藍藻；分子分類；DNA指紋識別；標記基因

以形態(tài)特征或細胞內超微結構為依據的形態(tài)學方法在藍藻的分類鑒定歷史中起了非常重要的作用。但是隨著人們對藍藻的深入研究以及新藻種的不斷出現，傳統(tǒng)的形態(tài)學分類法愈加顯示出它的局限性，主要原因如下：首先，藍藻有些屬種之間的形態(tài)特征區(qū)別并不明顯，如Synechoccous和Cyanoothece在形態(tài)上就非常接近[1]，而且藍藻的形態(tài)又受到諸多生長條件（生長的溫度、時間、光照強度、營養(yǎng)以及pH等）的影響，如節(jié)旋藻TJSD在不同培養(yǎng)溫度、光照或pH條件下，藻絲體的長度、螺旋數、螺距都有較大的變化[2]，因而形態(tài)學上界定藍藻所依據的標準非常模糊；其次，藍藻個體通常微小，普通光學顯微鏡下難以參照形態(tài)標準進行辨別，即便是富有經驗的專家借助電子顯微鏡也很難準確地對一些物種的形態(tài)特征進行完整的描述；此外，不同學者自身研究領域的局限性以及形態(tài)學分類標準優(yōu)先權的不統(tǒng)一性造成了目前多種分類系統(tǒng)并存且不一致的局面，例如：1985年Anagnostidis和Komarek依據形態(tài)學方法將藍藻分為四目：念珠藻目（Nostocales）、真枝藻目（Stigonematales）、色球藻目（Chroococcales）和顫藻目（Oscillatoriales）[3]；20世紀40年代中期，英國藻類學家Fritsch FE根據形態(tài)學又將藍藻分為五類，不僅包括前面四類，還包括寬球藻目（Pleurocapsales）[4]。因此形態(tài)學分類往往導致藍藻在屬內種水平、屬水平以及品系水平上的分類與命名混亂或爭議[5]。如2001年Gugger等[6]利用16SrRNA、16S-23SITS和rbcLX發(fā)現魚腥藻屬（Anabaena）和束絲藻屬（Aphanizomenon）不能獨立的分為兩類，他們在系統(tǒng)發(fā)育樹中互相交叉，表明藍藻在以傳統(tǒng)的形態(tài)特征為基礎的分類上存在問題[7]，2009年Valério等[8]利用16S rRNA得到了與Gugger一致的結果。這種狀況不僅制約藍藻的理論研究與學術交流，而且嚴重影響國內外微藻產業(yè)的進一步發(fā)展。

相對于形態(tài)學分類方法，基于DNA特征的分子分類能夠更好地反應物種之間的親緣關系，因此找尋那些不受環(huán)境因素影響的特殊標記分子及其分類方法，探索新的更加穩(wěn)定的種屬鑒定標準也就成為藍藻研究的熱點領域之一。

1 DNA指紋識別技術

1985年Jeffrey等建立了利用衛(wèi)星DNA作探針，探測不同生物的衛(wèi)星區(qū)，進而直接檢測DNA差異的DNA指紋圖譜技術[9]。WenTas.L等[10]及U.Nubel[11]等比較了基于PCR的指紋識別技術（RFLP，RAPD，DGGE，SSCP）的不同。2000年Casamayor等[12]的研究表明DGGE技術可以檢測到整體群落中超過1%的一個亞種群。2003年Crosby和Cridd le的研究表明基于16S rRNA的指紋技術與基于ITS區(qū)的自動核糖體間隔基因分析技術 （automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA）[13]，以及末端限制性片段長度多態(tài)性技術（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）在某些狀況下可以更好地估計種群多樣性[14]。

1.1 限制片段長度多態(tài)性技術

限制片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術是最早發(fā)展起來的分子標記技術，具有重復性好、共顯性強、多態(tài)性信息量大及不受環(huán)境和物種發(fā)育階段影響的優(yōu)點。1996年Neilan等[15]以編碼藻藍蛋白的β亞基（β-phycocyanin subunit，cpcB）和α亞基（α-phycocyanin subunit，cpcA）以及兩者之間的間隔序列（intergenic spacer region，cpcBAIGS）作為分子標記，通過RFLP技術成功地對19株藍藻（包括：6株德國卷曲魚腥藻屬藻株、6株銅綠微囊藍藻屬藻株以及7株泡沫節(jié)球藻屬藻株）進行了準確的分類與鑒定；2002年Iteman等人[16]也利用該技術，并以16S rRNA作為分子標記，對11株浮游藻株和念珠藻屬的PCC 7120進行了鑒定，并指出4株項圈藻屬（Anabaenopsis）藻株及2株藍螺菌屬（Cyanospira）藻株的親緣關系十分接近，也能與節(jié)球藻屬（Nodularia）PCC9350歸為一類，而項圈藻flos-aquae和束絲藻株（Aphanizomenon）屬于不同的分支。劉麗[17]等通過nlsrDNA（nuclear large-subunit ribosomal DNA）及nssrDNA（nuclear small-subunit ribosomal DNA）的RFLP研究發(fā)現廣東徐聞地區(qū)62個造礁石珊瑚樣本的共生藻可聚為兩類，即C1亞系群與C15亞系群。2012年劉慶等[18]用16S-23S rRNA基因間隔區(qū)ITS序列作為生物標記，通過T-RFLP技術對富營養(yǎng)化嚴重的滇池、巢湖和太湖的藍藻樣品進行分析，共得到36個不同的末端限制性酶切片段，反映出3個湖泊中的種群具有豐富的基因多樣性，且所研究的湖泊中的藍藻種群結構存在空間差異，其中滇池和巢湖的種群結構類似。

1.2 隨機擴增多態(tài)性技術

隨機擴增多態(tài)性（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）由Williams等于1990年提出，利用該方法可以簡便、靈敏地檢測出基因組DNA的多態(tài)性[19]。1997年Nishihara等[20]首次將RFLP技術應用于藍藻的分類研究中。2005年Prabina等[21]利用RAPD技術對17株藍藻進行了研究，并且發(fā)現RAPD技術可有效的檢測藍藻藻株是否為純種。2002年李晉楠等[22]首次將RAPD技術用于螺旋藻的分類，用106條隨機引物對7株鈍頂節(jié)旋藻的基因組進行了RAPD研究，經聚類分析表明：7株藻聚為兩類，且與7株藻的生理生化和分子生物學特性相一致，為螺旋藻的分類系統(tǒng)的完善奠定了解出提供了依據。

1.3 擴增片段長度多態(tài)性技術

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP）專一性強、可靠性高，還可在不知道基因組序列的情況下對物種進行研究[23]。2000年Kusumo等[24]利用AFLP技術揭示了不同采樣時間及地點的翅藻（Alariamarginata）的遺傳差異，其研究結果表明不同采樣季節(jié)所得到的翅藻屬種具有遺傳差異，各翅藻屬種的遺傳距離與其空間分布距離呈正比關系。2005年Muller等[25]采用AFLP技術結合ITS序列分析技術對比分析了小球藻藻株之間的分類差異。

1.4 變性梯度凝膠電泳技術

變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）技術操作簡便、快速，加樣量小，重復性好，還可以用來研究微生物群落的時空分布及組成，確定復雜樣品的特定DNA序列[26]。2001年Coyne等[27]利用PCR-DGGE技術鑒定分析了幾株形態(tài)學上極其相似的弒魚藻，并且對比了普哥木河和德拉維爾內海灣弒魚藻的群落結構差異。2011年邵娟等[28]利用DGGE技術有效地確定出7種常見的海洋赤潮藻類的差異，同時鑒定了赤潮樣品中4種優(yōu)勢種。這些研究的結果都表明DGGE技術可作為一種輔助方法用于藍藻的分類鑒定。

1.5 STRR和LTRR指紋技術

重復序列是藍藻基因組中重要的部分。1990年Mazel等[29]利用從眉藻PCC7601株中分離出的STRR序列（Short Tandemly Repeated Repetitive）與異型胞株的基因組DNA雜交，通過分析雜交的帶形，在種和屬的水平上鑒定了這些藻株，并對STRR在藍藻系統(tǒng)分類中的應用進行了探討。Rasmussen和Svenning[30]指出基于STRR和LTRR（Long Tandemly Repeated Repetitive）的指紋技術可用于藍藻的分類研究中。

1.6 單核苷酸多態(tài)性技術

迄今為止，單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）技術在藻類分類中的應用還較少。2003年Batley等[31]發(fā)現在500個Nodularia（Cyanobacteria）藻株的基因組中，有3個基因位點（即，16S-23S基因間隔區(qū)ITS、藻藍蛋白基因間隔區(qū)PC-IGS、編碼氣囊主要結構蛋白的基因gvpA）表現出了良好的單核苷酸多態(tài)性，其中約97%的藻株，這3個基因位點的SNP表現為同一基因型，2.4%的藻株，只有兩個基因位點表現為同一基因型，他們的研究結果說明該方法適用于含有大量個體的群體遺傳學研究。

DNA指紋技術以DNA特征結構為依據，具有快速且分類結果能夠較好反映親緣關系的特點，但這些技術也存在諸多問題。如：（1）DGGE得到的單基因序列長度為200 bp～700 bp左右，信息比較有限，難以進行精確的系統(tǒng)發(fā)生分析[32]；不同序列的DNA有可能遷移到膠的同一位置[33]；或者由于有些物種基因的不同拷貝之間存在異質性問題會出現多個條帶，過高地估計環(huán)境中微生物的多樣性；（2）RAPD技術由于擴增目標是隨機的，因此重復性較差；（3）AFLP標記需要同位素檢測，對提取的DNA純度和內切酶質量要求嚴格，成本較高；（4）RFLP技術成本較高，步驟繁瑣，檢測周期長，需要同位素標記，在一般實驗室難以操作等。另外，大部分分子分類方法都是通過提取樣品的DNA或者RNA，再利用PCR擴增技術獲得特定基因片段，繼而進行系統(tǒng)發(fā)育分析，因此，DNA樣品提取是否成功、PCR抑制物的出現、引物特異性及擴增效率等問題，也會影響到分類鑒定的結果[34]。

2 特征性標記基因的序列分析

從本質上說，生物個體的差異取決于其遺傳物質基因組DNA。因此，對生物個體進行分類和鑒定最可靠、直接而有效的手段是對生物基因組進行測序從而比較個體差異[35]。但生物基因組DNA較大，對每種生物的基因組進行測序在財力、物力、人力的消耗上將非常巨大。如gloeobacter violaceus PCC7421是一種無類囊體藍藻，它的基因組為一環(huán)狀染色體，長度為4 659 019 bp[36]；念珠藻（nostoc punctiforme）ATCC29133的基因組接近10Mb[37]。因此對于一般物種的分類研究，在傳統(tǒng)分類的基礎上選擇有代表性的基因片段作為分類標準，并用不同的分子標記技術來區(qū)分群體之間、屬種之間的遺傳差異就成為當前研究的主要方向。

2.1 16S rRNA基因及ITS區(qū)

16S rRNA基因序列保守性較高，有“生物進化分子鐘”之稱，常用于揭示屬及屬以上水平的系統(tǒng)發(fā)生關系。16S-23S rRNA轉錄單位內間隔區(qū)序列（ITS）在生物進化過程中的變異程度一般比16S rRNA基因序列高，具有長度和序列上的高度變異性，可以提供豐富的變異位點和信息位點，可用作分子標記對較低階元進行分類與親緣關系研究[38-39]。在高等植物中已經被廣泛用作研究進化系統(tǒng)的重要分子標記[40]。

Suda用16S rRNA基因序列將供試的75個藍藻株系分為6個組群[41]。茅云翔利用16SrRNA基因和16S-23S rRNA基因的ITS區(qū)對螺旋藻和節(jié)旋藻進行了系統(tǒng)發(fā)生分析，認為在這兩個基因位點上能夠將螺旋藻和節(jié)旋藻區(qū)分開，這一結果與劉金姐的研究結果相同[42-43]。

1994年Nelissen等[44]利用16S rRNA基因序列對螺旋藻和節(jié)旋藻進行分類與鑒定時發(fā)現SpirulinaPCC6313與單細胞藍藻Synechococcus PCC7002聚為一類，之后茅云翔[45]、Ballot等[46]的研究證實了這一結果。

2.2 藻藍蛋白基因

藻藍蛋白是紅藻和藍藻中一種重要的捕光色素蛋白，基因全長1 119 bp，其中β亞基基因序列長度為519 bp位于α亞基基因上游，中間有111 bp的間隔序列。2002年于平等[47]發(fā)現極大螺旋藻和其他藻類的藻藍蛋白氨基酸序列的同源性在45.9%～99%之間，藻藍蛋白α和β兩個亞基的氨基酸序列同源性為27.1%。藻藍蛋白包含許多疏水性氨基酸，這些疏水性氨基酸在藻膽蛋白的聚集過程中起著極為重要的作用。因此，藻藍蛋白基因序列及間隔區(qū)序列可以用于藍藻的分類研究。

2005年teneva等[48]使用cpcBA-IGS序列對林氏念珠藻和點狀念珠藻進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結果顯示念珠藻屬是異質性的。2010年Tan等[49]以cpcBA-IGS序列為分子標記，對中國的13株惠氏微囊藻（Microcystiswesenbergii）進行了分類研究，構建的系統(tǒng)樹顯示，惠氏微囊藻聚為一群，表明cpcBA-IGS可以把惠氏微囊藻和其它微囊藻區(qū)分開。黃家權等對四種魚腥藻的部分藻藍蛋白基因及cpcBA-IGS序列進行了全細胞PCR擴增，通過序列分析表明，cpcBA-IGS序列可作為鑒定種及種以下的分類依據[50]。

2.3 rbcL和rbcS基因

1987年，Ritlandh和Clegg等首先提出rbcL基因可用于系統(tǒng)發(fā)育研究[51]。rbcL（Rubisco largesubunit）基因編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶加氧化酶的大亞基，長約1.4 Kb。該酶催化光合作用中CO2的固定，由8個大亞基（rbcL）和8個小亞基（rbcS）組成，rbcX位于rbcL與rbcS之間，可能具有分子伴侶的功能[52]。rbcLX由rbcL基因的3’端，非編碼間隔序列，以及rbcX的5’端組成。由于rbcLX序列既有保守的編碼序列也有快速進化的片段，對近緣藍藻有較強的分辨能力。

2003年劉金姐等[53]測定了節(jié)旋藻的rbcL基因序列，并與GenBank數據庫中已經報道的部分藍藻的核苷酸序列進行了同源性分析，結果表明利用rbcL基因位點可以明確的將節(jié)旋藻和螺旋藻區(qū)分開，這與茅云翔等報道的結果一致。2005年Rajaniemi等[54]基于rbcLX基因序列對念珠藻、魚腥藻的系統(tǒng)發(fā)育關系進行了研究，發(fā)現念珠藻為單系起源。2011年王捷[55]利用rbcL基因成功將念珠藻進行了分類。

rbcL基因在不同類群中的進化速率有較大的差異，但總的來說相對保守，rbcL序列還具有一些獨特的優(yōu)點：以單拷貝形式存在，不發(fā)生基因轉變；序列較長，能提供較多的分子性狀等[56]。雖然有學者指出rbcL序列可能在不同物種間發(fā)生了水平轉移，但該序列作為系統(tǒng)進化研究的分子標記仍然在被研究者使用，并得到了很好的啟發(fā)性的研究結果[57]。

2.4 psbA基因

psbA基因是藍藻葉綠體基因組中的一個重要光調控基因，其編碼產物是32 ku的D1蛋白，是光系統(tǒng)Ⅱ反應中心的2個核心蛋白之一，在光合作用中介導電子傳遞[58]。陸生植物的psbA基因一般是無內含子的單拷貝基因，藻類的情況相對復雜，一般有內含子，且含有2個或多個拷貝，如萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，2個拷貝）和纖細裸藻（Euglenagracilis，1個拷貝）中均有4個內含子[59-60]。但也有些藻類的psbA基因與高等植物的psbA基因相似，如小球藻不含內含子，全長1 060 bp。

psbA基因編碼區(qū)序列的同源性在雙子葉植物之間超過90%，而在藻類中一般為84%～90%[61]。由于psbA基因高度保守，因此廣泛用于較高水平如屬以上水平的分子系統(tǒng)發(fā)育關系的比較[62]，如在藻類中用psbA序列探討雙鞭毛藻質體的起源等[63]。

2008年吳曉微等[64]通過研究8株小球藻的psbA基因序列發(fā)現，基因間相似性為83.3%～98.8%，除了其中2組關系極近的小球藻相似性高達98%之外，其他兩兩之間相似性為83%～93%，而其編碼的氨基酸序列間的相似性超過95%。

2.5 其他標記基因

gyrB基因編碼DNA促旋酶β亞基，進化速率比16S rRNA快，包含更多的遺傳變異信息，是細菌種屬分類的有效分子標記。

在藻膽蛋白中，與其α、β亞基同步進化的還有3種連接亞基的棒狀連接多肽基因CpcH，Cpc I和CpcD，它們均由一個祖先基因“TEA（terminalenergyacceptor）”演化而來。基于這一原理，2006年楊靈勇等[65]首次嘗試以CpcHID（由CpcH、CpcI和CpcD基因組成的操縱子序列）為分子標記，對鈍頂節(jié)旋藻品系進行親緣關系和分類學研究，發(fā)現其進化趨勢與16S rRNA和ITS的相一致，可作為節(jié)旋藻分類與鑒定的一種新的分子標記。

2013年Prashant Singh等利用nifH基因證實了念珠藻屬（Nostoc）和項圈藻屬（Anabaena）為兩個類群的分類結果[66]。2004年張曉輝等[67]首次將氫化酶大小兩個亞基 hoxH和 hoxY的基因應用到節(jié)旋藻屬（Arthrospira）和螺旋藻屬（Spirulina）的系統(tǒng)學分析中。通過比較兩個基因的核苷酸序列及其對應的氨基酸序列發(fā)現：螺旋藻屬明顯區(qū)別于節(jié)旋藻屬，并與茅云翔和劉金姐的分類結果一致。2002年Barker等[68]同時利用相鄰拷貝的結構氣泡（structural gas vesiele）基因的間隔非編碼區(qū)（gvpA-IGS）、藻藍蛋白基因內間隔區(qū)（cpcBA-IGS）和rDNA內部轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）三個位點對固氮藍藻進行了系統(tǒng)發(fā)生分析。

3 結論

綜合前人基于DNA分子對藍藻進行的分類研究，不難發(fā)現盡管研究者選用的DNA指紋圖譜技術不同，選擇的特征性標記基因不同，但對藍藻的分類結果相互彌補、彼此印證，說明DNA序列變異是客觀標準，以此為依據的分子分類可以彌補傳統(tǒng)形態(tài)分類存在的不足，能為藍藻的鑒定以及分類研究提供更準確的依據，藍藻的分類體系也日趨完善，且更接近于物種的自然親緣關系。

用于藍藻分類和鑒定的分子標記技術較多，但每種技術或每個標記基因反映的變異僅代表基因組DNA變異的一小部分，因此筆者認為在實際應用中采用單個分子標記技術或標記基因很難對藍藻的親緣關系進行準確的判斷，必須充分利用各種標記技術及標記基因的特點，采用互補的多種標記技術及標記基因來進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以獲得能夠反映生物進化過程中藍藻不同物種之間親緣關系的分類系統(tǒng)和標準。另外，用于藍藻分類的不同特征基因參與的生命過程不同，進化速率不同，其保守性也不同，在屬及屬以上水平進行分類時可以選取在進化上相對保守、與藍藻生存息息相關的基因，例如16s rRNA及與光合作用相關的基因cpcB、cpcA、psbA等；在進行屬以下的系統(tǒng)發(fā)育分析時可以利用進化速率相對較快的序列，如ITS、cpcBA-IGS等。

通過對螺旋藻（節(jié)旋藻）分類系統(tǒng)的重建研究中發(fā)現螺旋藻（節(jié)旋藻）的形態(tài)具有多變性，溫度，PH對其螺距影響較大，且大部分螺旋藻藻株很難被富集，挑取單藻絲獲得純培養(yǎng)比較困難。所以形態(tài)分類雖然具有簡單快速的特點，但在無法獲得純培養(yǎng)的情況下也很難進行分類鑒定，而分子分類方法不用，可以通過宏基因組學對環(huán)境中的螺旋藻（節(jié)旋藻）樣本DNA進行研究，可以從本質上揭示環(huán)境中螺旋藻（節(jié)旋藻）的生物多樣性，才能為螺旋藻（節(jié)旋藻）的開發(fā)利用提供可靠的信息。因此，在分類研究中需要選擇多種分子標記技術及特征性標記基因對該物種進行全方位的系統(tǒng)發(fā)育分析，并結合形態(tài)學和生理特征，如此才有可能建立一套快速、準確、適用于藍藻的分類鑒定技術和能夠反映親緣關系、指導鑒定實踐的穩(wěn)定分類系統(tǒng)。

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Reseach Advances in Cyanobacterial Taxonomy Based on DNA Character

HOU Hui-jing1，2，WANGSu-ying1，2，*，GUO Bin-hui1，2
（1.Schoolof Biotechnologyand Food Science，Tianjin UniversityofCommerce，Tianjin 300134，China；2.Tianjin Key LaboratoryofFood Biotechnology，Tianjin 300134，China）

Accurate classification of cyanobacteria using traditionalmorphological taxonomy is challenging due to theobscurity ofmorphological criteria andmorphousvariability.New approaches from molecular biology have been utilized to decode genetic information and to improve cyanobacterial taxonomy.Nowadays，use of taxonomy based on DNA character to classify cyanobacteria and further tostudy theirgenotypic relationshipsare underway，and obtained resultsare promising.The application of variousmolecular classificationmethodsand distinctive mark genes in cyanobacterial categorization have been reviewed，and also recent advances in cyanobacterial categorization.

cyanobacteria；Molecular taxonomy；DNA fingerprinting；markergene

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.035

2014-09-01

國家自然科學基金（31270050）；天津市高等學校創(chuàng)新團隊項目（TD12-5049）；國家大學生創(chuàng)新訓練計劃項目

侯惠靜（1989—），女（漢），在讀研究生，研究方向：微生物前期開發(fā)與利用。

*通信作者：王素英（1964—），女（漢），教授，博士，研究方向：微生物開發(fā)與利用。