HPLC-MS/MS快速測(cè)定嬰幼兒食品中丙烯酰胺含量

楊旺火，黃永輝，陳言凱，劉飛，周鵬，柯振華，吳少明（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建福州350002）

HPLC-MS/MS快速測(cè)定嬰幼兒食品中丙烯酰胺含量

楊旺火，黃永輝，陳言凱，劉飛，周鵬，柯振華，吳少明
（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建福州350002）

摘要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定嬰幼兒食品中丙烯酰胺含量的方法。以13C3-丙烯酰胺為同位素內(nèi)標(biāo)，4%三氯乙酸水溶液作為提取液，經(jīng)NaCl鹽析，乙腈萃取凈化，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。該方法的線性范圍為12.24 ng/mL～612 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r2>0.999 9，檢出限為7 μg/kg，定量限22 μg/kg。3種嬰幼兒食品及輔助食品中丙烯酰胺的加標(biāo)回收率為96.5%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.5%。本方法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于多種嬰幼兒食品中丙烯酰胺含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：丙烯酰胺；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；嬰幼兒食品；同位素內(nèi)標(biāo)

丙烯酰胺（acrylamide）是一種神經(jīng)毒素，馬鈴薯和谷類等淀粉類食品通過美拉德反應(yīng)在高溫加工過程中生成，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其列為對(duì)人類很可能的ⅡA類致癌物質(zhì)[1]。自2002年瑞典國(guó)家食物管理局（Swedish National Food Administration）和斯德哥爾摩大學(xué)（Srockholm University）的科學(xué)家報(bào)道油炸馬鈴薯和焙烤食品中含有丙烯酰胺以及丙烯酰胺的潛在危害以來，德國(guó)、比利時(shí)、中國(guó)、日本等國(guó)的科學(xué)家相繼發(fā)現(xiàn)熱反應(yīng)加工食品會(huì)產(chǎn)生丙烯酰胺[2-5]。

目前，我國(guó)食品中丙烯酰胺的監(jiān)測(cè)種類主要集中在油炸和焙烤食品中。然而，早在2007年，歐盟就已經(jīng)開始要求各成員國(guó)每年監(jiān)控包括嬰幼兒餅干、罐裝輔食和谷類輔助食品在內(nèi)的2000種食品中的丙烯酰胺含量。我國(guó)對(duì)嬰幼兒配方食品、谷類輔助食品和罐裝輔助食品等食品中丙烯酰胺的含量尚未進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控和暴露評(píng)估，而嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，更容易遭受危害，嬰幼兒食品中丙烯酰胺更需要進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)控。

目前丙烯酰胺的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[6]、氣相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]等。國(guó)內(nèi)食品中丙烯酰胺的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要有GB/T 5009.204-2005《食品中丙烯酰胺含量的測(cè)定方法氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法》及SN/T 2096-2008《食品中丙烯酰胺的檢測(cè)方法同位素內(nèi)標(biāo)法》，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)前處理樣品均需經(jīng)過提取，過固相色譜柱，過夜衍生，再萃取，然后上機(jī)處理，所用分析儀器是氣質(zhì)聯(lián)用儀，分析時(shí)間長(zhǎng)，效率低，且操作過程復(fù)雜，容易造成被測(cè)物損失。因此，選擇簡(jiǎn)便、快速的前處理方法，建立HPLC-MS方法對(duì)嬰幼兒食品中丙烯酰胺進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控和暴露評(píng)估，為企業(yè)在生產(chǎn)中降低該物質(zhì)的產(chǎn)生，指導(dǎo)人們健康飲食有著重要的意義。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1290 Infinity超高效液相色譜串聯(lián)6490三重四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司；高速冷凍離心機(jī)（Aanti J-E）：美國(guó)Beckman Coulter公司；超純水純化系統(tǒng)（Milli-Q）：美國(guó)Millipore公司；分析天平（BT 224 S）：德國(guó)Sartorius公司；超聲波振蕩器（DS-8510 DTH）：上海生析超聲儀器有限公司；旋渦混均器（XH-B）：江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；0.22 μm尼龍濾膜：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；丙烯酰胺標(biāo)-13C3標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：美國(guó)CIL公司；乙腈（色譜純）：山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；甲酸（優(yōu)級(jí)純）：德國(guó)Merck公司；所用試劑除特別標(biāo)注外均為分析純?cè)噭辉囼?yàn)用水為超純水純化系統(tǒng)制備的超純水。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.030 9 g丙烯酰胺于25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解配制成濃度為1.224 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。吸取適量丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水配成24.48 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

吸取1.00 mL丙烯酰胺-13C3標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成濃度為39.6 μg/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。吸取適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，用水配成濃度為1.584 μg/mL內(nèi)標(biāo)中間溶液。

1.3樣品前處理

稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品，于40 mL的離心管中，加入丙烯酰胺-13C3內(nèi)標(biāo)，加入10 mL 4%三氯乙酸溶液，渦旋后超聲30 min，在15 000 r/min、10℃下離心5 min，取上清液5 mL，加入NaCl固體顆粒使之飽和，加入5 mL乙腈振蕩萃取10 min，15 000 r/min離心取出乙腈層，下層再加入5 mL乙腈重復(fù)萃取一次，合并兩次乙腈層，氮吹濃縮至近干，純水定容1 mL，過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4液相色譜條件

色譜柱：WatersBEHC18柱，1.7μm，100mm×2.1mm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5.0 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：1%的甲醇和99%的0.3%甲酸水溶液，等度洗脫3.5 min。

1.5質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；毛細(xì)管電壓：3 000 V；干燥氣溫度：160℃；干燥氣流速：16 L/min；霧化氣壓力：206.85 kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：12 L/min；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用水和甲醇為流動(dòng)相時(shí)可以獲得較大的響應(yīng)和較好的峰型。由于丙烯酰胺極性較大，在反相色譜柱上的保留較弱，所以，以1%甲醇的有機(jī)相比例作流動(dòng)相。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在水相中加入適量甲酸有助于提高質(zhì)譜響應(yīng)，優(yōu)化了0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%不同濃度的甲酸溶液的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸濃度在0.1%、0.2%時(shí)響應(yīng)值變化不大，當(dāng)濃度達(dá)到0.3%時(shí)響應(yīng)增大明顯，但隨著濃度的增加，響應(yīng)值反而下降，由于甲酸濃度高，流動(dòng)相的pH降低，容易縮短柱子的壽命。因此本研究采用甲酸濃度為0.3%的水溶液作為水相。

2.2流速的選擇

不同流速對(duì)化合物的出峰時(shí)間、峰形都有一定影響，但流速太高會(huì)增加系統(tǒng)壓力，過高的壓力會(huì)縮短柱子使用壽命，試驗(yàn)比較了0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min 4個(gè)不同流速對(duì)分析結(jié)果的影響。一方面，隨流速的提高，標(biāo)樣的保留時(shí)間相應(yīng)縮短，峰形也變得尖銳，峰寬變窄，另一方面，流速提高，保留時(shí)間的縮短，容易造成在實(shí)際樣品分析時(shí)目標(biāo)物與基質(zhì)中雜質(zhì)的分離度變差，干擾目標(biāo)物的測(cè)定，且當(dāng)流速增大，系統(tǒng)壓力也增高，因此本研究選擇流速為0.3 mL/min較為適合。

2.3質(zhì)譜條件的確定

采用電噴霧離子源（ESI）正離子掃描模式對(duì)丙烯酰胺進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液以MS2 Scan掃描模式進(jìn)行母離子全掃描，得到響應(yīng)最強(qiáng)的母離子m/z 72.1，然后以Product Ion掃描模式查找子離子，得到兩個(gè)響應(yīng)最高，最穩(wěn)定的子離子m/z 55.1、m/z 44.2，最后通過MRM模式優(yōu)化兩組離子對(duì)的碰撞能量。以同樣的方法對(duì)丙烯酰胺-13C3內(nèi)標(biāo)的母離子以及子離子進(jìn)行掃描優(yōu)化，得到其母離子質(zhì)量數(shù)為75.1，特征碎片離子為m/ z 58.1、m/z 29.1。在確定掃描參數(shù)后，對(duì)其它質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為毛細(xì)管電壓3 000 V、干燥氣溫度160℃、干燥氣流速16 L/min、霧化氣壓力206.85 kPa、鞘氣溫度350℃、鞘氣流速12 L/min，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），掃描參數(shù)見表1。

2.4樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

相關(guān)資料研究測(cè)定丙烯酰胺時(shí)用的最多的是水做為提取溶劑，另外有少部分用了乙腈、甲醇等作為提取溶劑。本試驗(yàn)比較純水、1%甲酸水溶液、5%三氯乙酸水溶液、1%氨水、乙腈和甲醇對(duì)實(shí)際樣品中的丙烯酰胺的提取效果，發(fā)現(xiàn)用純水和5%三氯乙酸水溶液提取時(shí)，響應(yīng)最大。此外三氯乙酸還能起到沉淀蛋白的作用，溶液澄清，有利于后續(xù)樣品的凈化濃縮。比較了1%、2%、3%、4%、5%5個(gè)不同三氯乙酸濃度作為提取溶劑對(duì)提取效果的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)三氯乙酸濃度≥3%時(shí)，樣品離心后上層溶液較為澄清，且當(dāng)三氯乙酸濃度為4%時(shí)目標(biāo)物的峰面積響應(yīng)值也相應(yīng)較大，考慮到高濃度酸對(duì)系統(tǒng)壽命及穩(wěn)定性的影響，最后確定三氯乙酸提取液的濃度為4%。

丙烯酰胺的極性很強(qiáng)，采用水溶液作為提取溶劑時(shí)，水中溶解的極性物質(zhì)較多，容易有共流出物對(duì)檢測(cè)造成干擾，另一方面丙烯酰胺的分子量很小，質(zhì)譜所監(jiān)測(cè)離子質(zhì)量數(shù)在80以下，而在這個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)譜測(cè)定時(shí)系統(tǒng)和流動(dòng)相的分子碎片干擾比較嚴(yán)重，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)樣液中的丙烯酰胺所產(chǎn)生的質(zhì)量數(shù)為55.1的子離子有嚴(yán)重的離子干擾，造成離子比例嚴(yán)重偏離丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的離子比例，影響定量和定性結(jié)果，因此需要減小樣品提取液的基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行凈化處理。試驗(yàn)采取了空白加標(biāo)的方法，比較了PEP串聯(lián)MCX、PEP、MCX和乙腈+NaCl液液萃取凈化共4種方法的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種方法凈化后的目標(biāo)物的離子比例均落在了偏差的允許范圍內(nèi)，而乙腈+NaCl液液萃取法和MCX柱法處理后樣品目標(biāo)物相應(yīng)明顯大于其它兩種方法，乙腈+NaCl方法的基線較MCX平穩(wěn)，同時(shí)MCX柱的價(jià)格較為昂貴，乙腈+ NaCl法價(jià)格低廉，因此選擇用乙腈+NaCl液液萃取法來對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用乙腈對(duì)提取液萃取兩次后，回收率基本達(dá)到90%以上，同時(shí)在處理過程加入同位素內(nèi)標(biāo)，進(jìn)一步校正了基質(zhì)效應(yīng)的影響，滿足試驗(yàn)要求，因此確定對(duì)提取液進(jìn)行兩次的液液萃取凈化處理，合并的乙腈層經(jīng)氮吹、濃縮定容后上機(jī)測(cè)試，進(jìn)一步提高檢測(cè)限。

2.5線性范圍及檢測(cè)限

準(zhǔn)確移取丙烯酰胺及丙烯酰胺-13C3標(biāo)準(zhǔn)工作液，逐步稀釋制得質(zhì)量濃度為12.24、24.48、61.2、122.4、244.8、612 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)濃度為15.84 ng/mL，按照本試驗(yàn)的操作條件下分析，以丙烯酰胺定量離子色譜峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：Y=0.244 3 X+0.043 1，r2>0.999 9，結(jié)果表明在12.24 ng/mL～612 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好。

依照國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的定義，檢出限以信噪比S/N>3計(jì)，定量限以S/N>10計(jì)，按稱樣1.0 g，試驗(yàn)過程稀釋倍數(shù)為2計(jì)算，得到本方法丙烯酰胺檢出限7 μg/kg，定量限為22 μg/kg，典型的加標(biāo)樣品定量離子流圖譜見圖1。

2.6準(zhǔn)確度和精密度

稱取未含丙烯酰胺的嬰幼兒奶粉和米粉樣品以及有丙烯酰胺本底的嬰幼兒餅干1.0g，分別添加3個(gè)不同含量水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各做6個(gè)平行樣，重復(fù)測(cè)試3次，計(jì)算各自回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表2所示。

平均回收率在96.5%～104.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～2.5%之間，說明該方法具有較強(qiáng)的可靠性。

2.7實(shí)際樣品檢測(cè)

采用該方法對(duì)各20個(gè)批次的奶粉、米粉和餅干3種基質(zhì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中奶粉和米粉樣品均未檢出丙烯酰胺，餅干中丙烯酰胺含量在110 μg/kg～130 μg/kg之間。由于丙烯酰胺是通過美拉德反應(yīng)經(jīng)過高溫工藝后生成丙烯酰胺，因此與產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝關(guān)系非常密切，餅干的生產(chǎn)工藝通常要經(jīng)過油炸或擠壓等高溫處理，較容易生成丙烯酰胺。

3　結(jié)論

本方法采用4%的三氯乙酸作為提取液，既可以有效提取出嬰幼兒食品中的丙烯酰胺，對(duì)蛋白質(zhì)含量高樣品還能起到沉淀蛋白、澄清溶液的作用，在樣品的凈化處理步驟采用廉價(jià)的NaCl和乙腈液液萃取的方法，大大降低了檢測(cè)成本，同時(shí)在處理過程中加入同位素內(nèi)標(biāo)，有效地校正了目標(biāo)物的損失。本方法具有操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度高、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)我國(guó)開展嬰幼兒食品中丙烯酰胺的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控和暴露評(píng)估工作具有很好的實(shí)際參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]王愛紅,夏昭林.丙烯酰胺危害健康的研究進(jìn)展[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2003,19(12):1534-1535

[2]ONO H,CHUDA Y,OHNISHI-KAMEYAMA M,et al.Analysis of acrylamide by LC-MS/MS and GC-MS in processed Japanese foods [J].Food Additives and Contaminants:Part A,2003,20(3):215-220

[3]MESTDAGH F,DE WILDE T,DELPORTE K,et al.Impact of chemical pre-treatments on the acrylamide formation and sensorial quality of potato crisps[J].Food Chemistry,2008,106(3):914-922

[4]GEREND S J,HEUSER F,SATTELMACHER B.Influence of nitrogen and potassium supply on contents of acrylamide precursors in potato tubers and on acrylamide accumulation in french fries[J]. Journal of Plant Nutrition,2007,30(9):1499-1516

[5]Zhang Yu,Zhang Genyi,Zhang Ying.Occurrence and analytical methods of acrylamide in heat-treated foods.Review and recent developments[J].Journal of chromatography A,2005,1075(1/2):1-21

[6]劉紅河,陳春曉,柳其芳,等.高效液相色譜法測(cè)定淀粉類食品中丙烯酰胺研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2004,14(6):691-693

[7]周宇,朱圣陶.氣相色譜法測(cè)定油炸、烘烤食品中丙烯酰胺-丙烯酰胺污染水平調(diào)查[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè)),2007,43(11):928-930

[8] 趙榕,邵兵,趙婕,等.液相色譜-電噴霧質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定高溫烹制的淀粉類食品中的丙烯酰胺[J].色譜,2005,23(3):289-291

[9]Yusa V,Quintas G,Pardo O,et al.Determination of acrylamide in foods by pressurized fluid extraction and liquid chromatographytandem mass spectrometry used for a survey of Spanish cerealbased foods[J].Food Addit Contam,2006,23(3):237-244

[10]仲維科,陳冬東,雍煒,等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定油炸淀粉類食品中的丙烯酰胺[J].色譜,2005,23(3):312-314

[11]Bernhard Rothweiler,Eberhardt Kuhn,Harry Prest.氣相色譜/質(zhì)譜法分析食品中的丙烯酰胺[J].中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè),2004,20(5):71-74

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.035

收稿日期：2014-07-07

基金項(xiàng)目：福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計(jì)劃項(xiàng)目（FJQI2012057）

作者簡(jiǎn)介：楊旺火（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

Rapid Determination of Acrylamide in Infant Foods by HPLC-MS/MS

YANG Wang-huo，HUANG Yong-hui，CHEN Yan-kai，LIU Fei，ZHOU Peng，KE Zhen-hua，WU Shao-ming
（National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，F(xiàn)ujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou 350002，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：A method using isotope internal standard for determination acrylamide in infant foods had been established by ultra high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The sample was extracted with 4%trichloroacetic acid solution，and then purified by liquid-liquid extraction with acetonitrile，analyzed by HPLC-MS/MS in a multi-reaction monitoring （MRM）mode，an isotope internal standard was added for quantification.The correlation coefficient（r2）of acrylamide was more than 0.999 9 in linear range of 12.24 ng/mL-612 ng/mL.The detection limit and quantification limit were was 7 μg/kg and 22 μg/kg.The average spiked recoveries were in the range of 96.5%-104.2%with the relative standard deviations（RSD）of 0.9%-2.5%.The results showed this method was simple，high sensitivity，high accuracy and repeatable for the determination of acrylamide in kinds of infant foods.

Key words：acrylamide；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；infant food；isotope internal standard