藻類聚合磷酸鹽的分析方法

閆 彬

(重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400045)

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藻類聚合磷酸鹽的分析方法

閆 彬

(重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400045)

對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)部聚合磷酸鹽的檢測(cè)方法進(jìn)行了總結(jié)，并從細(xì)胞染色法、化學(xué)提取分析法兩方面進(jìn)行了具體的論述，比較了不同分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)，有助于藻類聚合磷酸鹽研究的發(fā)展。

聚合磷酸鹽，藻類，染色法，化學(xué)分析法

聚合磷酸鹽(polyphosphate,polyP)是由三個(gè)以上正磷酸根殘基通過高能磷酸鍵連接而成的線性聚合體，其廣泛存在于自然界，在火山冷凝物、深海熱泉和生物(細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、植物、哺乳動(dòng)物)都有發(fā)現(xiàn)，其在地球上的出現(xiàn)時(shí)間甚至比核酸、蛋白質(zhì)更早，但由于檢測(cè)方法的限制，聚合磷酸鹽長(zhǎng)期被忽視。聚合磷酸鹽首先發(fā)現(xiàn)于迂回螺菌中，故又被稱為迂回體，Graham在1833年通過熔合磷酸二氫鈉后快速冷卻的方法最早合成了無機(jī)聚磷酸鈉鹽[1,2]。polyP在生命系統(tǒng)的主要功能有:貯存磷和能量，螯合和貯存陽(yáng)離子、構(gòu)成膜通道、參與磷轉(zhuǎn)運(yùn)、參與細(xì)胞膜形成、調(diào)控酶活性、調(diào)控脅迫響應(yīng)等[3-5]。

藻類廣泛分布于淡水和海洋生態(tài)系統(tǒng)中，為全球貢獻(xiàn)超過50%的初級(jí)生產(chǎn)力，在維持水生生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)元素(碳、氮、磷)的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演舉足輕重的角色。目前藻類水華與水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的研究集中于水體中總磷、溶解性總磷、氮磷比方面，對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的磷存儲(chǔ)機(jī)制涉及較少[6-8]。由于聚合磷酸鹽聚合度變化范圍廣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且藻類體內(nèi)含量少，缺乏準(zhǔn)確可行的測(cè)定方法，藻類體內(nèi)聚合磷酸鹽的研究發(fā)展緩慢。本文對(duì)藻類細(xì)胞內(nèi)聚合磷酸鹽的分析方法進(jìn)行總結(jié)，以期在分析方法的實(shí)際應(yīng)用選擇上提供借鑒。

1 聚合磷酸鹽的染色方法

聚合磷酸鹽在研究中，最常用、最早的研究方法是通過染色驗(yàn)證其存在性，常用的染色劑有甲苯胺藍(lán)、亞甲基藍(lán)(美蘭)、中性紅，異染粒在染色劑的作用下呈現(xiàn)不同顏色的亮光，但由于染色劑染色對(duì)象的非選擇性，胞內(nèi)的其他聚合物也會(huì)被染上顏色，會(huì)削弱甚至屏蔽聚合磷酸鹽的染色效果；另外染色法只能定性地判斷聚合磷酸鹽的存在，不能對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

亞甲基藍(lán)在pH較低時(shí)(約2.8)方可與多聚物結(jié)合，與聚合磷酸鹽結(jié)合后呈粉紫色，細(xì)胞呈藍(lán)色，由于兩種顏色的區(qū)別并不鮮明，該方法適用于胞內(nèi)儲(chǔ)存大量聚合磷酸鹽的情況，染色15 s即可。奈瑟氏染色時(shí)需要先將亞甲基藍(lán)溶解在酸性溶液中，與聚合磷酸鹽結(jié)合后顆粒呈紫黑色，細(xì)胞為棕黃色，明顯顏色反差使得奈瑟氏染色比亞甲基藍(lán)染色效果更好，染色30 s的效果較好。對(duì)奈瑟氏方法的改進(jìn)取得了良好效果，與傳統(tǒng)方法相比，使用的復(fù)染液都是乙液，改進(jìn)方法將傳統(tǒng)使用的初染液成分(亞甲基藍(lán)與結(jié)晶紫的混合液)改為僅亞甲基藍(lán)，新方法染色后的顆粒呈墨綠色，使用的試劑相對(duì)簡(jiǎn)單，也便于與細(xì)胞區(qū)分[10,11]。

作為生物研究中常用的熒光染料，4’,6—二脒基—2-苯基吲哚(4’,6—diamidino—2-phenylindole，DAPI)也可以對(duì)胞內(nèi)聚合磷酸鹽進(jìn)行染色，需使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察[12]。DAPI常用于DNA的染色，同時(shí)也可對(duì)脂類進(jìn)行染色，DAPI與DNA結(jié)合后呈藍(lán)白色熒光，與聚合磷酸鹽結(jié)合后呈黃色，與脂類染色也呈黃色，不過DAPI—脂類的熒光在幾秒就會(huì)猝滅，而DAPI—聚合磷酸鹽的黃色熒光不易猝滅[13]。DAPI染色使用的激發(fā)光為紫外光(330 nm～385 nm)，發(fā)射光波長(zhǎng)為526 nm，對(duì)于細(xì)菌的染色發(fā)現(xiàn)染料濃度為1 mg/L，染色1 h可以減輕高濃度染料(50 mg/L)所帶來的背景熒光過高的問題[14]，Allan and Miller[12]建立了對(duì)藻類胞內(nèi)聚合磷酸鹽熒光觀察的方法，并得到廣泛應(yīng)用。

2 聚合磷酸鹽的化學(xué)分析方法

聚合磷酸鹽的化學(xué)分析方法首先通過化學(xué)試劑將聚合磷酸鹽從細(xì)胞內(nèi)提取出來，然后將其分解為無機(jī)磷酸鹽并使用鉬銻抗法進(jìn)行測(cè)定。由于聚合磷酸鹽的聚合度變化范圍大，目前沒有對(duì)特定聚合度的聚合磷酸鹽直接測(cè)定的方法。

早期聚合磷酸鹽的提取方法是沿用核酸提取方法，直到1936年Mac Farlane提出了胞內(nèi)聚合磷酸鹽的提取方法，根據(jù)該方法，聚合磷酸鹽分為可溶于酸(5%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)或0.5M 高氯酸(perchloric acid，PCA))的聚合磷酸鹽和不可溶于酸的聚合磷酸鹽。對(duì)于不可溶于酸的聚合磷酸鹽，常用方法是用稀堿液(pH 8～9)進(jìn)行提?。籗chmidt and Thannhauser[15]使用1M KOH在37 ℃進(jìn)行不同時(shí)間的提取，該方法得到了廣泛應(yīng)用；也有研究使用熱酸對(duì)聚合磷酸鹽進(jìn)行提取，如使用5%TCA或10%高氯酸在80 ℃～100 ℃進(jìn)行反應(yīng)，此反應(yīng)條件下可將大部分聚合磷酸鹽分解為正磷酸鹽。

是否溶于酸是聚合磷酸鹽的一種分類標(biāo)準(zhǔn)，寬泛的分類不利于明確不同聚合磷酸鹽的功能。Lagen和Liss依次使用1%TCA(0 ℃)、飽和NaClO4溶液、NaOH溶液(pH 10)和NaOH溶液(0.05M)對(duì)聚合磷酸鹽進(jìn)行了分步提取，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同鏈長(zhǎng)聚合磷酸鹽的分離。該方法之所以被廣泛應(yīng)用，是因?yàn)椴煌滈L(zhǎng)的聚合磷酸鹽在胞內(nèi)的存在位置有所不同，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的生理學(xué)作用，比是否溶于酸的分類更細(xì)致，如低聚合度的聚合磷酸鹽在細(xì)胞中常以游離態(tài)存在，而高聚合度的聚合磷酸鹽則常與生物大分子(蛋白質(zhì)、DNA)形成復(fù)合物。Miyachi等[17-18]通過對(duì)小球藻(Chlorella ellipsoiden)的分步提取實(shí)驗(yàn)將上述分類進(jìn)一步細(xì)化，使用的試劑依次為8%TCA(0 ℃)，KOH(pH 9,0 ℃)，KOH(2M)，PCA，相應(yīng)地將提取到的聚合磷酸鹽分別稱為：polyP-A，polyP-B，polyP-C，polyP-D，其中，polyP-A是可溶于酸的聚合磷酸鹽；polyP-B雖不溶于酸，但溶于pH=9的低溫堿液；polyP-C，既不溶于酸，也不溶于pH=9的低溫堿液；polyP-D可溶于2M KOH，但可以被酸溶解。在光合作用中，polyP-A和polyP-C作為媒介將磷從無機(jī)正磷酸鹽傳遞給DNA和磷蛋白；polyP-B和polyP-D則作為細(xì)胞的磷庫(kù)，在環(huán)境中磷過量時(shí)將磷酸鹽儲(chǔ)存于體內(nèi)，外界磷缺乏時(shí)分解為正磷酸鹽以供細(xì)胞維持生命活動(dòng)。

雖然使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液可以對(duì)胞內(nèi)聚合磷酸鹽進(jìn)行較完整的提取，但不可避免的是，如此劇烈的反應(yīng)條件勢(shì)必引起聚合磷酸鹽的分解，一定程度上會(huì)高估正磷酸鹽的含量，因此研究人員嘗試了溫和反應(yīng)條件下聚合磷酸鹽的提取，以獲得盡可能完整的聚合磷酸鹽，這些提取試劑有熱水、碳酸鈉溶液、氯化鈉溶液和乙醇預(yù)處理后的冷水提取。相比較而言，最后一種提取方法的效果較好。不過，溫和反應(yīng)條件的提取都存在一個(gè)缺陷，即對(duì)胞內(nèi)聚磷的提取可能是不完全的。Eixler等[19]分別使用冷水，熱水，NaOH，NaCl，NaNO3作為提取試劑對(duì)小球藻(Chlorella vulgaris)體內(nèi)的聚合磷酸鹽進(jìn)行提取，認(rèn)為NaOH和熱水處理適于對(duì)聚合磷酸鹽的提取，提取過程中聚合物水解量較少，不過使用NaOH作為提取試劑時(shí)，測(cè)定正磷酸鹽含量前需先對(duì)溶液pH進(jìn)行調(diào)整。

3 展望

作為生物體內(nèi)重要的儲(chǔ)磷、儲(chǔ)能物質(zhì)，聚合磷酸鹽在藻類對(duì)于營(yíng)養(yǎng)吸收、存儲(chǔ)、利用過程中的功能仍有待研究，需要繼續(xù)開發(fā)更精細(xì)、更快捷的檢測(cè)方法。

[1]Graham T. Researches on the arseniates, phosphates and modifications of phosphoric scid. Phil. Trans.R.Soc.London,1833,253(123):75-77.

[2]Franklin MH. Inorganic polyphosphates in biology: structure, metabolism, and function. Bacterilolgical Reviews,1966,30(4):772-794.

[3]Kumble KD, Kornberg A. Inorganic polyphosphate in mammalian-cells and tissues.Journal of Biological Chemistry,1995,270(11):5818-5822.

[4]Achbergerová L, Nahálk J. Polyphosphate-an ancient energy source and active metabolic regulator.Microbial Cell Factories,2011,63(10):579-591.

[5]Arthur K, Narayana RN, Dana A. Inorganic polyphosphate:A molecule of many functions.Annu. Rev Biochem,1999(68):89-125.

[6]Litchman E, Klausmeier CA, Schofield OM, et al. The role of functional traits and trade-offs in structuring phytoplankton communities:scaling from cellular to ecosystem level.Ecology Letters,2007,10(12):1170-1181.

[7]張勝花，常軍軍，孫珮石.水體藻類磷代謝及藻體磷礦化研究進(jìn)展.生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2013(7):1250-1254.

[8]沈國(guó)英,朱小明.幾種浮游單細(xì)胞藻類磷代謝的初步研究.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1996(4):619-624.

[9]Kulaev IS, Vagabov VM. Polyphosphate metabolism in micro-organisms. Advances in Microbial Physiology,1983(24):83-171.

[10]錢軼超，陳英旭，樓莉萍.核磁共振技術(shù)在沉積物磷素組分及遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律研究中的應(yīng)用.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2010(7):1892-1898.

[11]任世英，肖 天.聚磷菌體內(nèi)多聚物的染色方法.海洋科學(xué),2005,29(1):59-63.

[12]Allan RA, Miller JJ. Influence of S-adenosylmethionine on DAPI-induced fluorescence of polyphosphate in the yeast vacuole-DAPI.Can.J.Microbiol,1980(26):912-920.

[13]Smolders GJF, Van der Meij J, van Loosdrecht MCM, et al. Model of the anaerobic metabolism of the biological phosphorus removal process: stoichiometry and pH influence.Biotechnol Bioeng,1994(43):461-470.

[14]Zilles JL, Hung CH, Noguera DR. Presence of Rhodocyclus in a full-scale wastewater treatment plant and their participation in enhanced biological phosphorus removal: International Water Association.Rome Italy,2001(2):75-81.

[15]Schmidt G,Thannhauser S. A method for the determination of deoxyribonucleic acid, ribonucleic and phosphoproteins in animal tissues.Biol.Chem,1945(161):83.

[16]Krishnan PS, Damle SP, Bajaj V. Studies on the role of metaphosphate in molds.Ⅱ.The formation of soluble and insoluble metaphosphate. Arch. Biochem.Biophys,1957(67):35.

[17]Miyachi S, Kanai R, Mihara S,et al. Metabolic roles of inorganic polyphosphates in Chlorella cells.Biochim.Biophys.Acta,1964,93(3):625-634.

[18]Kanai R, Miyachi S, Miyachi S. Light-induced formation and mobilization of polyphosphate “C” in Chlorella cells. Plant Cell Physiol.(Tokyo), special issue.Studies on microalgae and photosynthetic bacteria,1963(2):613-618.

[19]Eixler S, Selig U, Karsten U. Extraction and detection methods for polyphosphate storage in autotrophic planktonic organisms.Hydrobiologia，2005(533):135-143.

Detection methods of polyphosphate in algae

Yan Bin

(CollegeofCityConstruction&EnvironmentEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing400045,China)

Made a simple summary on the detection methods of polyphosphate in algae. It contained two aspects, such as staining and chemical extract methods. The advantages and disadvantages of different methods were discussed. It was useful for research development in algal polyphosphate.

polyphosphates, algae, staining, chemical analysis

1009-6825(2015)18-0204-03

2015-04-14

閆 彬(1989- )，男，在讀碩士

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