葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙潔，夏亞丹，劉艷艷(菏澤市牡丹人民醫(yī)院，山東菏澤74000;泰安市中心醫(yī)院;菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校)

葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙潔1，夏亞丹2，劉艷艷3
(1菏澤市牡丹人民醫(yī)院，山東菏澤274000;2泰安市中心醫(yī)院;3菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校)

摘要:葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒具有主動(dòng)靶向性和靶向范圍廣等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。筆者收集整理了葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的相關(guān)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，現(xiàn)對(duì)其作為靶向藥物載體的制備方法、靶向性、載藥方式及其應(yīng)用作一綜述。

關(guān)鍵詞:葉酸;白蛋白納米粒;葉酸受體;藥物載體;腫瘤;主動(dòng)靶向性

傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物缺乏靶向性，不良反應(yīng)多［1］。近年來腫瘤的靶向給藥體系為研究熱點(diǎn)［2］。自2005年美國(guó)FDA批準(zhǔn)白蛋白結(jié)合紫杉醇納米粒注射混懸液上市以后，白蛋白納米粒作為靶向藥物載體引起臨床關(guān)注。白蛋白納米粒載藥系統(tǒng)具有靶向、緩釋，生物利用度高，減少用藥過程中的不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，其在體內(nèi)主要輸送到單核巨噬系統(tǒng)(RES系統(tǒng))，具有器官被動(dòng)靶向性，這對(duì)局限于RES系統(tǒng)的惡性腫瘤(如肝癌、骨髓瘤)的化療具有重要意義［3］。但由于多數(shù)疾病不在RES系統(tǒng)中，提高白蛋白納米粒在體內(nèi)的靶向性，成為研究人員面臨的重要問題［4］。葉酸是一種低分子量維生素，葉酸受體常在人癌細(xì)胞過表達(dá)，而在大多數(shù)正常組織中的表達(dá)高度限制［5］。葉酸受體作為一種腫瘤標(biāo)記物，可用來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物的靶向輸送［6］。針對(duì)葉酸受體的特性以及白蛋白納米技術(shù)在藥物載體上的應(yīng)用，研究人員設(shè)計(jì)出葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒作為主動(dòng)靶向于腫瘤細(xì)胞的藥物載體。本文綜述了近年來葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的研究概況，包括制備方法、靶向性、載藥方式及其應(yīng)用。

1　葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的制備方法

白蛋白表面活性氨基(暴露于白蛋白納米粒表面的賴氨酸—氨基及末端氨基)是進(jìn)行化學(xué)修飾的有效連接部位，可與葉酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道的葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的制備方法主要是首先制備出白蛋白納米粒(采用去溶劑化等方法制備)和葉酸活性酯(利用二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、碳二亞胺與葉酸反應(yīng)制備)，然后于堿性緩沖液中用葉酸活性酯與白蛋白表面氨基偶聯(lián)制備葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白納米粒(葉酸-BSANPs)。產(chǎn)物可利用葡聚糖凝膠柱或超速離心等方法進(jìn)行分離。葉酸偶聯(lián)率常用2，4，6-三硝基苯磺酸顯色法測(cè)定。白蛋白納米粒徑及其表面殘余氨基的量是影響葉酸偶聯(lián)的重要因素。Zu等［7］采用響應(yīng)面分析法研究牛血清白蛋白(BSA)濃度、乙醇滴加速率、乙醇與水的比例以及交聯(lián)度對(duì)牛血清白蛋白納米粒(BSANPs)粒徑大小及其表面殘余氨基的數(shù)量的影響。結(jié)果表明，影響納米粒徑的主要因素為BSA濃度和乙醇的滴加速率，影響表面殘余氨基的數(shù)量的因素主要為BSA濃度、乙醇的滴加速率與交聯(lián)度。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的與葉酸偶聯(lián)的白蛋白納米粒主要是牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)。如張良坷等［8］在pH=9.0的碳酸鹽緩沖液中，使BSANPs表明氨基與葉酸活性酯偶聯(lián)，首次制備葉酸-BSANPs，直徑約70 nm，葉酸偶聯(lián)率為28.3%。陳道楨等［9］報(bào)道了葉酸偶聯(lián)人血清白蛋白納米粒(葉酸-HSANPs)的制備方法:將葉酸溶于pH=9.0 的PBS，加入EDC活化，加入含人血清白蛋白納米粒(HASNPs)的PBS，攪拌使其反應(yīng)。采用葡聚糖凝膠柱對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離，收集淡黃色有乳光部分，葉酸偶聯(lián)率為27.26%。

2　葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒載體的靶向性

葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒具有白蛋白納米粒的被動(dòng)靶向性及葉酸—葉酸受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向性的雙重優(yōu)勢(shì)，使葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的靶向性增強(qiáng)。另外，研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、子宮頸癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌和腎細(xì)胞癌等多種腫瘤細(xì)胞膜表面上的葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細(xì)胞，因此葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的腫瘤靶向應(yīng)用范圍較為廣泛［10］。雖然葉酸受體將葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)癌細(xì)胞的具體機(jī)制尚不清楚，但葉酸偶聯(lián)物可以通過葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而被癌細(xì)胞攝?。?1］。而近年來對(duì)于葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的研究也表明該納米粒子可以經(jīng)過葉酸受體葉酸介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入葉酸受體表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞。

2.1葉酸受體葉酸介導(dǎo)的內(nèi)吞作用張良坷等［8］研究了葉酸-BSANP對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的靶向性。體外實(shí)驗(yàn)表明，SKOV3細(xì)胞對(duì)葉酸-BSANPs的攝入量高于無葉酸修飾的BSANPs，攝入量隨葉酸-BSANPs濃度的增大和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并對(duì)時(shí)間和濃度的增加呈現(xiàn)出飽和性。此外葉酸-BSANPs的攝入會(huì)受到游離葉酸的抑制，而表面未修飾葉酸的BSANPs的攝入并不受到葉酸的抑制。該研究結(jié)果顯示葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒可通過葉酸受體介導(dǎo)進(jìn)入SKOV3細(xì)胞。

2.2主動(dòng)靶向于多種腫瘤細(xì)胞Kreuter等［12］研究顯示葉酸-HSANPs可顯著提高人神經(jīng)母細(xì)胞瘤和鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)納米粒的結(jié)合和攝取能力，而對(duì)正常人包皮成纖維細(xì)胞的攝取能力無影響。這表明葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有主動(dòng)靶向性。

3　葉酸偶聯(lián)白蛋白載體的載藥方式

葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒作為藥物的主動(dòng)靶向性載體，主要以物理結(jié)合和化學(xué)偶聯(lián)兩種方式進(jìn)行載藥。

3.1物理結(jié)合載藥物理結(jié)合載藥主要有兩種方式:一種是依賴白蛋白與藥物的相互作用將藥物包埋于葉酸偶聯(lián)白蛋白納米顆粒中。文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)葉酸偶聯(lián)白蛋白載藥體系采用該方法進(jìn)行載藥。Zhang等［13］制備的葉酸偶聯(lián)白蛋白包載米托蒽醌納米粒(MTO-BSA-葉酸) :將葉酸-BSANPs分散在pH=9碳酸鹽緩沖液或PBS中，加入MTO室溫?cái)嚢?，獲得MTO-BSA-葉酸;其粒徑為68 nm，載藥量為9.7%±0.1%，包封率為96.6%±1.0%。另一種方法是先將藥物包埋于白蛋白納米粒中，然后在堿性環(huán)境中再與葉酸活性酯偶聯(lián)。例如葉酸修飾的白蛋白包載多西紫杉醇(DT)納米粒(葉酸-DT-BSANPs)的制備［14］:首先用去溶劑化法制備DTBSANPs，然后在pH=9碳酸鹽緩沖液中與葉酸活性酯偶聯(lián)制備葉酸-DT-BSA-NPs。粒徑小于220 nm，藥物包封率為45%±8%，載藥量為14%±0.6%。

葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒不僅可以包載單一藥物，還可以同時(shí)包載多種藥物，例如同時(shí)包載卡鉑和紫杉醇的葉酸—卡鉑—紫杉醇白蛋白納米靶向制劑［15］。制備方法:在含有BSA和卡鉑的緩沖溶液中滴加紫杉醇乙醇溶液，制備出卡鉑—紫杉醇—白蛋白納米粒，然后與葉酸活性酯反應(yīng)制備產(chǎn)物。粒徑為199.4 nm，卡鉑和紫杉醇包封率分別為91.4% 和56.1%，總載藥量為21.0%。體外釋放結(jié)果表明該納米粒中紫杉醇溶出速率增加，卡鉑具有緩釋效果。

3.2化學(xué)偶聯(lián)載藥利用藥物與白蛋白載體之間產(chǎn)生分子間化學(xué)連接形成葉酸偶聯(lián)白蛋白藥物。例如葉酸偶聯(lián)白蛋白負(fù)載阿霉素(葉酸-BSA-DOX)的制備［16］。首先將DOX的羥基氧化為醛基，通過Schiff堿反應(yīng)使其與BSA上氨基連接制備出BSADOX，然后于pH為9.5的緩沖溶液中與葉酸活性酯偶聯(lián)制備葉酸-BSA-DOX。

4　葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的應(yīng)用

葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒不僅具有白蛋白納米粒的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，還具有主動(dòng)靶向性優(yōu)勢(shì)，因此其作為一種新型理想的藥物載體，其應(yīng)用前景廣闊。目前葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒最引人注目的應(yīng)用還是將其作為抗腫瘤藥物的載體。

4.1作為抗腫瘤藥物的載體文獻(xiàn)報(bào)道的用葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒包封研究的抗腫瘤藥已有紫杉醇、多西紫杉醇、卡鉑、米托蒽醌、表沒食子兒茶素、5-氟尿嘧啶、硫酸長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春堿、10-羥基喜樹堿、多柔比星(阿霉素)、2-甲氧基雌二醇、順鉑等［17～23］。用葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒包封的上述抗腫瘤藥物的體外釋放試驗(yàn)、體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明:①這些葉酸偶聯(lián)白蛋白—抗腫瘤藥物具有穩(wěn)定性高和藥物緩釋的特點(diǎn)。②由于葉酸受體葉酸僅在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，在正常組織無表達(dá)或很少表達(dá)，腫瘤組織特異性高。因此相較于白蛋白納米粒載藥體系，葉酸偶聯(lián)白蛋白載藥體系可通過腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體葉酸的介導(dǎo)而將其所攜載的抗腫瘤藥物主動(dòng)靶向于葉酸受體葉酸表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞(如人卵巢癌細(xì)胞SKOV3、前列腺癌細(xì)胞PC-3、宮頸癌細(xì)胞HeLa、胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞、肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人鼻咽癌細(xì)胞KB等)，從而有效減少抗腫瘤藥物對(duì)正常組織和細(xì)胞的毒副作用。例如，Zhang等［23］構(gòu)建的葉酸偶聯(lián)的2-甲氧基雌二醇(2-ME )白蛋白納米粒(2-ME-葉酸-BSANPs)靶向給藥系統(tǒng)，相比于對(duì)照組2-ME和2-ME-BSANPs來說，具有更強(qiáng)的靶向性，可有效快速的被肝癌細(xì)胞SMMC-7721攝入細(xì)胞內(nèi)。體外實(shí)驗(yàn)表明2-ME-葉酸-BSANPs對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用也顯著大于2-ME。

4.2作為化療、熱療、放療三合一的靶向載體對(duì)葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒載藥系統(tǒng)進(jìn)行磁性修飾和放射性元素標(biāo)記還可以使該載藥系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞呈現(xiàn)出靶向性的放療、化療、熱療三重殺傷作用。Chen等［24］對(duì)葉酸偶聯(lián)人血清白蛋白包封Fe3O4磁性材料及順鉑的納米粒(葉酸-CDDP/HASMNPs)進(jìn)行放射性核素標(biāo)記制備出188Re-葉酸-CDDP/HASMNPs［25］。放射化學(xué)純度超過95%。該遞送系統(tǒng)將化療、磁感應(yīng)溫度上升的理療及放射療法相結(jié)合。體外實(shí)驗(yàn)表明在交變磁場(chǎng)下，其對(duì)癌細(xì)胞SKOV3具有靶向性的放療、化療、熱療三重殺傷作用。

4.3作為腫瘤診斷與檢測(cè)的載體水溶性熒光量子點(diǎn)CdTe具有高熒光強(qiáng)度和良好抗光漂白性能，適合腫瘤細(xì)胞的靶向識(shí)別與熒光標(biāo)記及示蹤［26］。因此，包裹量子點(diǎn)或熒光素的葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒在葉酸受體表達(dá)陽性的腫瘤檢測(cè)及診斷方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。Meng等［27］利用CdTe/ZnS量子點(diǎn)獲得葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白量子點(diǎn)納米粒(葉酸-BSA-QDs)。熒光顯微鏡下觀察到相較于葉酸受體表達(dá)陰性的人類胚胎腎細(xì)胞(293T)，葉酸受體表達(dá)陽性的人鼻咽癌細(xì)胞KB對(duì)葉酸-BSA-QDs的攝取顯著增強(qiáng)，并受到葉酸抑制。表明葉酸-BSA-QDs在葉酸受體表達(dá)陽性的癌癥的診斷方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

此外，Rollett等［28］研究顯示，葉酸受體表達(dá)陽性的巨噬細(xì)胞與葉酸-HSANPs的結(jié)合明顯增強(qiáng)，而活化的滑膜巨噬細(xì)胞在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，說明葉酸-HASNPs也可成為治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物的潛在載體。

5　結(jié)語

葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒是一個(gè)穩(wěn)定的藥物遞送系統(tǒng)，可以改善藥物靶向于癌細(xì)胞，可作為靶向遞送抗癌藥物的載體。葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒具備白蛋白納米粒的安全無毒、生物相容性良好、無抗原性等多種優(yōu)點(diǎn)，其作為一種新型理想的藥物載體還具有緩釋、生物利用度高、靶向、可減輕抗癌藥物的不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。與白蛋白納米粒相比其獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)于葉酸受體表達(dá)陽性的多種腫瘤細(xì)胞，葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒具有主動(dòng)靶向性。因此，葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒在腫瘤治療及腫瘤在位檢測(cè)方面均具有非常重要的科學(xué)價(jià)值及應(yīng)用價(jià)值。最近研究表明其還可以作為治療關(guān)節(jié)炎藥物的潛在載體。雖然葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒靶向藥物投遞系統(tǒng)的研究剛剛起步，尚處于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，但由于其以白蛋白為載體，生物降解性高、無毒、有主動(dòng)靶向性特點(diǎn)，其應(yīng)用前景廣闊。

參考文獻(xiàn):

［1］Ling M，Liu Y，Zhao XG，et al.Targeted delivery of chemotherapy agents using a liver cancer-specific aptamer［J］.PLoS One，2012，7(4) : 33434-33441.

［2］陸麗，彭芳.靶向抗腫瘤藥物的研究現(xiàn)狀［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(13) : 1964-1966.

［3］Brannon-Peppas L，Blanchette JO.Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(11) : 1649-1659.

［4］Byrne JD，Betancourt T，Brannon-Peppas L.Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics［J］.Adv Drug Deliv Rev，2008，60(15) : 1615-1626.

［5］Kamen BA，Smith AK.A review of folate receptor alpha cycling and 5-methyltetrahydrofolate accumulation with an emphasis on cell models in vitro［J］.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(3) : 1085-1097.

［6］Low PS，Antony AC.Folate receptor-targeted dugs for cancer and inflammatory diseases［J］.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(3) : 1055-1058.

［7］Zu Y，Zhang Y，Zhao X，et al.Optimization of the preparation process of vinblastine (VBLS) -loaded folateconjugated bovine serum albumin (BSA) nanoparticles for tumor-targeted drug delivery using response methodology (RSM)［J］.Int J Nanomed，2009，4(期) : 321-333.

［8］Zhang L，Hou S，Mao S，et al.Uptake of folate-conjugated albumin nanoparticles to the SKOV3 cells［J］.Int J Pharm，2004，287(期) : 155-162.

［9］項(xiàng)靜英，薛文群，肖建平，等.葉酸偶聯(lián)人血清清蛋白(folate-HSA)的制備［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6(28) : 15-16.

［10］Hunter RJ，Preedy VR.Nanomedicine in health and disease［M］.Enfield: Science Publishers，2011: 81-89.

［11］Lu Y，Sega E，Low CP.Folate receptor-targeted immunotherapy of cancer: mechanism and therapeutic potential［J］.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(8) : 1161-1176.

［12］Ulbrich K，Michaelis M，Rothweiler F，et al.Interaction of folateconjugated human serum albumin (HSA ) nanoparticles with tumour cells［J］.Int J Pharm，2011，406(8) : 128-134.

［13］Zhang L，Hou S，Zhang J，et al.Preparation，characterization，and in vivo evaluation of mitoxantrone-ioaded，folate-conjugated albumin nanoparticles［J］.Arch Pharm Res，2010，33(8) : 1193-1198.

［14］張智舟，姜守剛，祖元?jiǎng)?，?多西紫杉醇白蛋白微球的制備及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究［J］.植物研究，2011，31(3) : 381-384.

［15］單常，祖元?jiǎng)?，趙修華，等.葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白負(fù)載卡鉑和紫杉醇腫瘤靶向納米粒制備、表征及體外釋放性能評(píng)價(jià)［J］.植物研究，2013，33(4) : 484-489.

［16］瞿小蘭.葉酸-白蛋白-多柔比星的制備及其抗腫瘤性質(zhì)研究［M］.武漢:華中科技大學(xué)，2009: 256-258.

［17］張良坷，侯世祥，盧贅，等.葉酸偶聯(lián)米托蒽醌白蛋白納米粒的制備及體外性質(zhì)研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40(10) : 763-765.

［18］唐秋莎，安艷麗，楊蕊.葉酸偶聯(lián)磁性白蛋白納米球的體內(nèi)外靶向性評(píng)價(jià)［J］.波譜學(xué)雜志，2013，30(4) : 499-506.

［19］祖元?jiǎng)?，袁帥，趙修華，等.葉酸介導(dǎo)表沒食子兒茶素沒食子酸白蛋白納米粒的制備及其體外靶向性與活性評(píng)價(jià)［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(5) : 525-531.

［20］Shen Z，Li Y，Kohama K，et al.Improved drug targeting of cancer cells by utilizing actively targetable folic acid-conjugated albumin nanospheres［J］.Pharm Res，2011，63(2) : 51-58.

［21］Li Q，Liu C，Zhao X，et al.Preparation，characterization and targeting of micronized 10-hydroxycamptothecin-loaded folate-conjugated human serum albumin nanoparticles to cancer cells［J］.Int J Nanomedicine，2011，6(3) : 397-405.

［22］張武雄，凌麗，何練芹，等.葉酸偶聯(lián)5-氟尿嘧啶-白蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性及靶向性研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25(4) : 405-408.

［23］Zhang N，Xia Y，Guo X，et al.Preparation，characterization，and in vitro targeted delivery of folate-conjugated 2-methoxyestradiolloaded bovine serum albumin nanoparticles［J］.J Nanopart Res，2014，16(5) : 2390.

［24］Chen D，Tang Q，Xue W，et al.The preparation and characterization of folate-conjugated human serum albumin magnetic cisplatin nanoparticles［J］.J Biomed Res，2010，24(1) : 26-32.

［25］Tang Q，Chen D，Xue W，et al.Preparation and biodistribution of 188Re-labeled folate conjugated human serum albumin magnetic cisplatin nanoparticles (188Re-folate-CDDP/HAS MNPs) in vivo ［J］.Int J Nanomed，2011，6(4) : 3077-3085.

［26］曹潔，劉飛，顧月青.葉酸-白蛋白納米粒偶聯(lián)熒光素制備工藝的研究［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(4) : 251-254.

［27］Meng H，Chen J，Mi L，et al.Conjugates of folic acids with BSA-coated quantum dots for cancer cell targeting and imaging by singlephoton and two-photon excitation［J］.J Biol Inorg Chem，2011，16(期) : 117-123.

［28］Rollett A，Reiter T，Nogueira P，et al.Folic acid-functionalized human serum albumin nanocapsules for targeted drug delivery to chronically activated macrophages［J］.Int J Pharm，2012，427 (5) : 460-466.

(收稿日期:2015-03-17)

文章編號(hào):1002-266X(2015) 22-0097-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R730.53

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.040