苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響及其機制

毛玲，汪順才，陳超，梁靚，左念，祝寅，李偉萍(句容市人民醫(yī)院，江蘇句容212400)

苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響及其機制

毛玲，汪順才，陳超，梁靚，左念，祝寅，李偉萍
(句容市人民醫(yī)院，江蘇句容212400)

摘要:目的探討不同濃度苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響及其機制。方法將對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細胞隨機均分為觀察組和對照組。觀察組分別加入1.0、2.0、3.0 mg/mL苦參堿(分別為低、中、高濃度)，對照組不予處理。采用MTT法檢測兩組細胞增殖抑制率，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，RT-PCR法檢測程序性細胞死亡因子4( PDCD4) mRNA相對表達量。結(jié)果細胞增殖抑制率:對照組為8.19%±2.35%，觀察組低、中、高濃度分別為18.02%±3.13%、30.20%±3.52%、53.32%±2.72%;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。細胞凋亡率:對照組為4.06%±1.59%，觀察組低、中、高濃度分別為10.75%±2.36%、19.08%±4.39%、25.63%±1.96%;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。細胞PDCD4 mRNA相對表達量:對照組為0.35±0.06，觀察組低、中、高濃度分別為0.52±0.06、0.67±0.04、0.82±0.07;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。結(jié)論不同濃度苦參堿均可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖、誘導其凋亡，并呈劑量依賴性;其作用機制可能與提高細胞內(nèi)PDCD4 mRNA表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞:胃癌;細胞增殖;細胞凋亡;苦參堿;程序性細胞死亡因子4

研究表明，腫瘤發(fā)生與腫瘤細胞增殖和凋亡異常有關(guān);程序性細胞死亡因子4( PDCD4)基因是阻止細胞腫瘤性轉(zhuǎn)化的抑癌基因，在不同腫瘤細胞凋亡過程中，PDCD4基因存在不同程度的表達［1，2］?？鄥A是從中藥苦參中提取的一種新型藥物，主要通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞基因表達而發(fā)揮抗腫瘤作用［3～5］。2012年8月～2014年11月，我們觀察了不同濃度苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，并探討其是否與PDCD4基因表達有關(guān)。

1　材料與方法

1.1材料人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學院細胞庫?？鄥A(粉末，純度≥98%)購自中鑫科技生物有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和FBS均購自賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司，四甲基偶氮唑藍( MTT)和二甲基亞砜( DMSO)均購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。PDCD4 mRNA引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計及合成，β-actin由艾博思生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計及合成。

1.2細胞培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% FBS及1%青霉素-鏈霉素)中，于37℃、5% CO2、100%濕度條件下傳代培養(yǎng)5～6 d傳代1次。

1.3苦參堿對細胞增殖抑制率影響的觀察采用MTT法。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，調(diào)整細胞密度為1×104/mL，接種于96孔板中，隨機分為觀察組、對照組。觀察組分別加入1.0、2.0、3.0 mg/mL的苦參堿(分別為低、中、高濃度，每濃度設(shè)6個復孔)，對照組( 6個復孔)不予處理，作用24 h同時設(shè)置加入培養(yǎng)液的細胞作為空白對照。各組每孔加入MTT( 5 mg/mL) 20 μL，培養(yǎng)箱孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。加入DMSO 150 μL，震蕩15 min 于1 h內(nèi)上酶標儀檢測其波長492 nm的吸光度，即OD492值。觀察組細胞增殖抑制率= (空白對照OD492－觀察組OD492)/空白對照OD492×100%，以同樣的方法計算對照組細胞增殖抑制率。

1.4苦參堿對細胞凋亡率影響的觀察采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，以1 ×105/孔接種于6孔板中，隨機分為觀察組、對照

組。觀察組分別加入低、中、高濃度的苦參堿(每濃度設(shè)3個復孔)，對照組( 3個復孔)不予處理，作用24 h。4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，重懸于200 μL的Binding Buffer中。加入10 μL的Annexin V-FITC后，室溫避光15 min，再加300 μL的Binding Buffer及5 μL的PI，充分混勻，于1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5苦參堿對細胞PDCD4 mRNA相對表達量影響的觀察采用RT-PCR法。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，調(diào)整細胞密度為1×104/mL，接種于50 mL細胞培養(yǎng)瓶中。觀察組分別加入低、中、高濃度的苦參堿，對照組不予處理，對照組及觀察組各濃度均設(shè)3個樣本，作用24 h。采用TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度及完整性，以O(shè)D260/OD280在1.8～2.0為純凈RNA標準。按說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。PDCD4上游引物: 5'-AAAGGCGACTAAGGAAAAACTCATC-3'，下游引物: 5'-GCCTATCCAGCAACCTTCCCT-3'，引物長度129 bp。β-actin上游引物: 5'-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3'，下游引物: 5'-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3'，引物長度130 bp。擴增條件: 94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃( PDCD4)或56℃(β-actin)退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán);最后72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，利用電腦成像分析系統(tǒng)檢測PCR產(chǎn)物與β-actin的積分光密度比值，半定量分析目的基因相對表達量。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1兩組細胞增殖抑制率和凋亡率比較細胞增殖抑制率:對照組為8.19%±2.35%，觀察組低、中、高濃度分別為18.02%±3.13%、30.20%± 3.52%、53.32%±2.72%;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。細胞凋亡率:對照組為4.06%±1.59%，觀察組低、中、高濃度分別為10.75%±2.36%、19.08%±4.39%、25.63%±1.96%;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。

2.2兩組細胞PDCD4 mRNA表達比較對照組細胞PDCD4 mRNA相對表達量為0.35±0.06，觀察組低、中、高濃度分別為0.52±0.06、0.67±0.04、0.82±0.07;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。

3　討論

苦參堿是中藥苦參的主要活性成分，具有抗炎抗過敏、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種藥理活性。研究表明，苦參堿對多種腫瘤細胞(如人神經(jīng)母細胞瘤細胞、白血病細胞、肺腺癌細胞等)均有明顯的殺傷作用［6～11］。其抗腫瘤作用機制主要有抑制腫瘤細胞增殖，誘導其分化凋亡，抗腫瘤細胞黏附與浸潤轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多重耐藥，抑制腫瘤新生血管形成以及增強化療藥物敏感性等。

目前，胃癌的發(fā)病機制尚不完全清楚。PDCD4是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有阻止細胞腫瘤性轉(zhuǎn)化、抑制腫瘤細胞增殖及侵襲促進凋亡、參與細胞周期調(diào)控、提高抗腫瘤藥物化療敏感性等作用［5］。PDCD4基因定位于10q24，cDNA 長3.5 kb，其中編碼區(qū)約1.4 kb。PDCD4存在于大多數(shù)正常組織細胞的細胞核中，當細胞周圍環(huán)境發(fā)生改變時，可通過核輸出信號轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中。因此，PDCD4在某些細胞凋亡的誘導過程中表達上升，在某些侵襲性腫瘤中則表達下降［5］。研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤(如胃癌、肝癌、腎母細胞瘤等)細胞中均可檢測到PDCD4 mRNA及蛋白表達減少甚至缺失，并與腫瘤惡性程度及患者預(yù)后密切相關(guān)［12］;胃癌組織PDCD4蛋白表達下降甚至缺失，并與胃癌低分化有關(guān)［13］。

本研究結(jié)果顯示，觀察組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率、PDCD4 mRNA表達均隨苦參堿濃度升高而升高，且觀察組各濃度上述指標均明顯高于對照組。進一步證實苦參堿可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖、誘導其凋亡，并呈劑量依賴性;其作用機制可能與提高細胞內(nèi)PDCD4 mRNA表達有關(guān)。本研究結(jié)果為苦參堿治療胃癌提供了新的理論依據(jù)。

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收稿日期:( 2015-01-29)

通信作者:汪順才，E-mail: wangshun1978@ sina.com

基金項目:江蘇大學醫(yī)學臨床科技發(fā)展基金資助項目( JLY20140074)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0023-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R329.26

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.008