三種免疫抑制劑對HBV質(zhì)粒感染小鼠HBV復(fù)制的影響*

黃順梅，王俊忠，宋志韜，王寶菊，朱珍妮，朱彬，陸蒙吉，楊東亮

三種免疫抑制劑對HBV質(zhì)粒感染小鼠HBV復(fù)制的影響*

黃順梅，王俊忠，宋志韜，王寶菊，朱珍妮，朱彬，陸蒙吉，楊東亮

作者單位：430022武漢市華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院感染病科（黃順梅，王俊忠，宋志韜，王寶菊，朱珍妮，朱彬，楊東亮）；德國埃森大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒研究所（陸蒙吉）

第一作者：黃順梅，女，30歲，博士研究生。主要從事感染與免疫研究。E-mail：hshm1982@sina.com

【摘要】目的應(yīng)用小鼠模型評(píng)價(jià)3種臨床常用的免疫抑制劑對乙型肝炎病毒（HBV）復(fù)制的影響。方法利用高壓水注射法將HBV質(zhì)粒pAAV/HBV1.2導(dǎo)入Balb/C小鼠肝內(nèi)，建立小鼠HBV復(fù)制模型；將Balb/C小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分別給予生理鹽水（Saline）、FK506、DEX和CYP處理。1w后，將供體C57BL/6小鼠皮瓣移植至上述經(jīng)免疫抑制劑或生理鹽水處理的Balb/C小鼠，皮膚移植后繼續(xù)使用上述免疫抑制劑或生理鹽水至觀察期結(jié)束。采用電化學(xué)免疫發(fā)光法檢測血清HBsAg、HBsAb和HBcAb水平，采用Real-time PCR法檢測血清病毒載量。結(jié)果FK506、地塞米松和環(huán)磷酰胺處理小鼠移植皮瓣的存活時(shí)間分別為（21.50±3.09）d、（21.50±3.09）d和（21.40± 1.52）d，分別較生理鹽水處理組（8.67±1.86）d明顯延長[P=0.037、P=0.000和P=0.000]；FK506處理組小鼠HBV復(fù)制及其抗體產(chǎn)生與對照組無顯著性差異，地塞米松處理組在藥物處理期間能維持病毒復(fù)制，但停藥后病毒DNA 和HBsAg迅速下降至檢測水平以下，至觀察終點(diǎn)仍未檢出HBsAb和HBcAb陽性，環(huán)磷酰胺能明顯延長小鼠HBV復(fù)制的持續(xù)時(shí)間，即使在停藥后16 w血清HBV DNA和HBsAg均維持在較高水平，HBcAb和HBsAb持續(xù)陰性。結(jié)論環(huán)磷酰胺而非FK506處理可在Balb/C小鼠模型中建立HBV持續(xù)復(fù)制模型。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；免疫抑制劑；高壓水注射；小鼠

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染仍然是一個(gè)重要的全球性公共衛(wèi)生問題。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，人群HBsAg攜帶率為7.18%[1]。免疫抑制藥物的使用?？蓪?dǎo)致HBV感染的再激活或?qū)е翲BV的持續(xù)感染，但不同藥物對HBV感染再激活的影響不同[2，3]。因此，有必要利用合適的動(dòng)物模型來評(píng)價(jià)不同免疫抑制藥物對HBV感染的影響，為臨床合理選擇免疫抑制藥物及預(yù)防HBV再激活提供指導(dǎo)。通過尾靜脈高壓水注射（Hydrodynamic injection，HI）將HBV質(zhì)粒pAAV-HBV1.2導(dǎo)入小鼠體內(nèi)建立的小鼠HBV復(fù)制模型是已經(jīng)得到全世界公認(rèn)且現(xiàn)今廣泛應(yīng)用的由臺(tái)灣國立大學(xué)陳培哲教授團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建的，其最初的研究成果發(fā)表在2006年P(guān)NAS[4～6]。pAAVHBV1.2導(dǎo)入Balb/C和C57BL6小鼠能分別構(gòu)建急性和持續(xù)的HBV復(fù)制模型。他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）、地塞米松（Dexamethasone，DEX）和環(huán)磷酰胺（Cyclophosph-amide，CYP）是臨床常用于治療自身免疫性疾病、腫瘤和抑制移植物排斥反應(yīng)的藥物。本研究應(yīng)用該Balb/C小鼠模型來評(píng)價(jià)上述藥物對HBV感染的影響，以期為臨床防治HBV感染提供重要參考。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑與藥物SPF級(jí)6～8周齡雌性Balb/C小鼠購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)委員會(huì)的規(guī)定。pAAV/HBV1.2為臺(tái)灣國立大學(xué)陳培哲教授饋贈(zèng)；檢測HBsAg、HBsAb和HBcAb試劑盒購自瑞士Roche公司；DnaseⅠ（RNase free）購自日本TAKARA公司；SYBRRGreen Real-time PCR Master Mix購自日本TOYOBO公司；QIAamp miniElute virus kit購自德國QIAGEN公司。DEX購自上海通用藥業(yè)股份有限公司，F(xiàn)K506和CYP購自江蘇恒瑞制藥有限公司。

1.2免疫抑制藥物處理取FK506、DEX和CYP，分別用生理鹽水稀釋后腹腔注射，每只小鼠每次注射體積為0.25ml，劑量分別為5 mg·kg-1·2d-1[7]、10 mg·kg-1· d-1[8]和25mg·kg-1·4d-1[9]。

1.3皮膚移植實(shí)驗(yàn)將Balb/C小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分別給予生理鹽水（Saline）、FK506、DEX和CYP處理。1w后，將供體C57BL/6小鼠（雄性，8～10周齡）皮瓣移植至上述經(jīng)免疫抑制劑或生理鹽水處理的Balb/C小鼠，皮膚移植后繼續(xù)使用上述免疫抑制劑或生理鹽水至觀察期結(jié)束。每日監(jiān)測移植皮瓣的存活情況，90%以上移植皮瓣未壞死則判為存活[10]。

1.4免疫抑制劑處理對HBV復(fù)制的影響將Balb/C小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。自尾靜脈高壓水注射前1w至高壓水注射后10w，分別接受不同免疫抑制劑或生理鹽水處理。Week 0，每只小鼠自尾靜脈注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒10μg，具體注射方法同前[4]。在質(zhì)粒注射后1 days post injection（dpi）、4 dpi、7 dpi、2 week post injection（wpi）、3 wpi、4 wpi、5 wpi、6 wpi、7 wpi、8 wpi、10 wpi、12 wpi、14 wpi、16 wpi、18 wpi、20 wpi、22 wpi、24 wpi、26 wpi采集小鼠眼眶靜脈血，分離血清，備檢。

1.5血清HBsAg、HBsAb和HBcAb定量檢測取小鼠血清，用通用稀釋液（Roche）1:10稀釋，采用定量測定試劑盒（Roche，電化學(xué)免疫發(fā)光法，ECLIA）檢測。HBcAb的檢測結(jié)果以抑制率表示，計(jì)算公式為：抑制率= 100×（通用稀釋液檢測值-樣本檢測值）/通用稀釋液檢測值）×100。

1.6 HBV DNA定量檢測取血清44.5μl，用DNaseⅠ消化血清中的質(zhì)粒DNA，然后用QIAamp mini Elute viral DNA kit抽提血清病毒DNA。使用SYBR

Green Real time PCR Master Mix在Roche Light Cycler定量PCR儀上進(jìn)行定量PCR檢測[11]。PCR反應(yīng)程序如下：95℃30s預(yù)變性；95℃5s變性，50℃5s退火，72℃30s延伸，連續(xù)40個(gè)循環(huán)。所用引物為：上游引物5'-CTG CAT CCT GCT GCT ATG-3' （nt408～425），下游引物5'- CAC TGA ACA AAT GGC AC-3'（nt 685～701）。用1:10倍比稀釋的HBV質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)設(shè)置已知HBV DNA拷貝數(shù)的樣本（質(zhì)粒pAAV/HBV1.2分光光度計(jì)測OD260值，計(jì)算核酸濃度及其拷貝數(shù)，拷貝數(shù)=（OD260×50×106／（324.5×660）×（6.02×1023）作為陽性對照，以陰性樣本作為陰性對照。

1.7統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1免疫抑制劑處理對小鼠移植皮瓣存活時(shí)間的影響經(jīng)FK506、DEX和CYP處理小鼠移植皮瓣的存活時(shí)間分別為（21.50±3.09）d、（21.50±3.09）d和（21.40±1.52）d，分別較生理鹽水處理組[（8.67±1.86）d，P=0.037、P=0.000和P=0.000]明顯延長（圖1），提示上述三種免疫抑制劑能明顯抑制小鼠排斥反應(yīng)，從而明顯延長移植皮瓣的存活時(shí)間。

2.2 FK506、DEX、CYP處理對HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠血清HBV DNA和HBsAg水平的影響將pAAV-HBV1.2導(dǎo)入小鼠體內(nèi)后，生理鹽水處理組小鼠血清HBsAg和HBV DNA在第4 d達(dá)峰值，但隨后迅速下降，并在第6 w和第8 w轉(zhuǎn)陰；FK506處理小鼠血清HBsAg和HBV DNA的變化與生理鹽水處理組類似；DEX處理組小鼠血清HBsAg和HBV DNA在第4 d達(dá)峰值，在用藥期間維持較高水平，但停藥后4 w檢測發(fā)現(xiàn)HBV DNA低于檢測水平，HBsAg迅速下降至臨界水平，且在60%小鼠其臨界水平持續(xù)至觀察期結(jié)束；CYP處理組小鼠血清HBsAg和HBV DNA同樣也在第4d達(dá)到高峰，且在50%小鼠維持在較高水平，直到觀察期末（停藥后16w，圖2）。

2.3 FK506、DEX、CYP處理對HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠血清HBsAb和HBcAb的影響在注射前及注射后第7w、10w和26w檢測小鼠血清HBsAb和HBcAb。注射前所有小鼠血清HBsAb和HBcAb均為陰性。在注射后7w、10w和26w，生理鹽水處理組7只小鼠分別有4只、3只和1只血清HBcAb為陽性，而血清HBsAb陽性的小鼠數(shù)量在上述時(shí)間點(diǎn)均為4只；DEX處理組上述時(shí)間點(diǎn)所有小鼠HBcAb和HBsAb均為陰性；FK506處理組小鼠HBcAb在第7w仍為陰性，但第10w有1只小鼠HBcAb接近檢測臨界值，第26w，3只小鼠檢出HBcAb陽性，而HBsAb在注射后7w、10w 和16w均有2只小鼠為陽性；CYP處理組小鼠在上述時(shí)間點(diǎn)HBcAb和HBsAb均為陰性（圖3）。

3　討論

已知免疫抑制藥物的使用?？蓪?dǎo)致HBV感染的再激活或?qū)е翲BV的持續(xù)感染，因此在2010年發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南中建議對HBV感染者在使用免疫抑制劑前可給予核苷類似物治療，而對HBcAb陽性的既往HBV感染者則需要定期監(jiān)測。然而，不同藥物對HBV感染持續(xù)或再激活的影響可能不同[2]，因此有必要利用動(dòng)物模型評(píng)價(jià)常用的免疫抑制藥物對HBV復(fù)制的影響，以指導(dǎo)HBV感染者和HBcAb陽性者選擇合適的免疫抑制藥物以及合適的臨床監(jiān)測方案。

2002年Chisari FV的研究小組通過高壓水注射的方式將HBV復(fù)制性克隆導(dǎo)入小鼠肝臟后成功建立了HBV一過性復(fù)制的小鼠模型，但在注射HBV質(zhì)粒后7 d和15 d分別從小鼠血清和肝內(nèi)被清除。2006年臺(tái)灣陳培哲研究小組在此基礎(chǔ)上通過將pAAV-HBV1.2導(dǎo)入C57BL/6小鼠成功建立HBV持續(xù)復(fù)制小鼠模型，40%小鼠HBV復(fù)制的持續(xù)時(shí)間超過6 m，將該質(zhì)粒導(dǎo)入Balb/C小鼠，2w后病毒被清除。隨后不同的研究小組應(yīng)用該方法建立小鼠HBV感染模型進(jìn)行了相關(guān)研究，包括HBV清除的機(jī)制、HBV疫苗的評(píng)價(jià)等。因該小鼠模型易于操作，本文選擇該小鼠模型來評(píng)價(jià)DEX、FK506和CYP對HBV復(fù)制的影響。

DEX、FK506和CYP是臨床常用的用于自身免疫性疾病、腫瘤和抑制移植排斥反應(yīng)的藥物。DEX識(shí)別胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體（GR）后使GR轉(zhuǎn)移定位到核內(nèi)，并與糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件GREs結(jié)合，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞的凋亡[12]。CYP是DNA烷化藥物，是一種非特異性的細(xì)胞周期抑制劑，能選擇性地減少B細(xì)胞數(shù)量，從而抑制體液免疫應(yīng)答，亦能抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[13]。FK506能與FKBP12結(jié)合抑制鈣通道活性，阻止細(xì)胞從G0期到G1期的分裂[14]。

我們發(fā)現(xiàn)FK506雖然能明顯抑制移植排斥反應(yīng)，但不能導(dǎo)致HBV復(fù)制的持續(xù)，也不會(huì)影響抗HBV相關(guān)抗原抗體的產(chǎn)生，與Robert E. Lanford的研究結(jié)果類似，后者在病毒接種前3w至接種后22w用FK506處理蜘蛛猴，并未導(dǎo)致長毛猴HBV（Wolly monkey HBV，WMHBV）的持續(xù)感染，同時(shí)對WMHBV DNA水平也未見明顯的影響[15]。DEX在用藥期間導(dǎo)致HBV高水平持續(xù)復(fù)制，停藥后病毒DNA迅速被清除，但HBsAg可維持在極低水平，與在EV71和SARS-Cov觀察到的情況不一致。EV71病毒感染小鼠和SARS-Cov病毒感染豬分別在病毒感染后2～3d或1～6d使用DEX處理，導(dǎo)致小鼠死亡率增加或臨床癥狀加重，血清病毒滴度增加，可能因?yàn)樯鲜鰞煞N病毒感染均為自限性，通常不導(dǎo)致持續(xù)感染[16，17]。CYP可在用藥期間和停藥后維持HBV的高水平復(fù)制，保持HBV持續(xù)復(fù)制時(shí)間長達(dá)26w，與在巨細(xì)胞病毒感染小鼠觀察到的結(jié)果一致，即使僅在病毒接種前7d、5d、3d使用CYP，仍可使病毒感染的持續(xù)時(shí)間從14d延長至21d[9，18]。綜上所述，上述三種藥物對HBV復(fù)制的影響明顯不同，F(xiàn)K506對HBV復(fù)制無明顯影響，而DEX 和CYP可導(dǎo)致HBV感染的持續(xù)，這將為臨床需要對HBV感染者和既往HBV感染者使用上述免疫抑制劑時(shí)監(jiān)測HBV感染提供重要的參考。

在注射HBV質(zhì)粒后10w，應(yīng)用CYP處理動(dòng)物，能使小鼠模型病毒復(fù)制的持續(xù)時(shí)間延長至26w，提示短暫的免疫抑制劑處理可能導(dǎo)致HBV感染的持續(xù)[2，3，19～21]。同時(shí)，通過短暫免疫抑制建立的HBV持續(xù)復(fù)制的Balb/C小鼠模型也有可能成為研究HBV感染的動(dòng)物模型，特別是在對免疫抑制劑處理患者評(píng)價(jià)干預(yù)HBV感染的效果時(shí)具有重要意義。

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（收稿：2014-12-23）

（本文編輯：陳從新）

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

Impact of three immunosuppressors on HBV replication in HBV plasmid transfected mice

Huang

Shunmei，Wang Junzhong，Song Zhitao，et al. Department of Infectious Diseases，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

【Abstract】Objective To evaluate the effect of three commonly used immunosuppressors on HBV replication in mouse model. Methods pAAV/HBV1.2，a HBV plasmid，was introduced into livers of Balb/C mice by hydrodynamic injection to establish HBV replication model. Animals were treated with dexamethasone（DEX），tacrolimus（FK506），cyclophosphamide（CYP）or saline from 6 days before plasmid injection to 10 weeks after injection. HBsAg，HBsAb and HBcAb were detected by electrochemiluminescence immunoassay（ECLIA），and HBV DNA by real-time PCR. Results The survival time of the transplanted skin grafts in DEX，F(xiàn)K506，and CYP treated mice were（21.50±3.09），（21.50±3.09）and（21.40±1.52）days，respectively，much longer than that of grafts in saline treated mice [（8.67±1.86）d，P=0.037，P=0.000 and P=0.000，respectively]；HBV replication and antibody generation in FK506 treated mice was similar to that in control group；HBV replication was maintained at the high level in DEX treated mice during the treatment period，however，HBV DNA and HBsAg levels dropped rapidly after the medicine withdrawal，while HBsAb and HBcAb were negative throughout the observation period；In CYP treated mice，HBV replication was prolonged and HBV DNA and HBsAg were at high levels even at week 16 after CYP withdrawal，while HBsAb and HBcAb were negative throughout the observation period. Conclusion The persistent replication of HBV in BALB/c mice can be achieved by administration of CYP rather than FK506.

【Key words】Hepatitis B virus；Immunosuppressor；Hydrodynamic injection；Mice

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.004

通訊作者：王寶菊，E-mail:bjwang73@163.com

*基金項(xiàng)目：國家傳染病防治科技重大專項(xiàng)課題（2008ZX10002011）