發(fā)酵香腸中產(chǎn)生物胺的微生物及其檢測方法研究

孫　霞，楊　勇，鞏　洋，楊　敏，卿丹丹，李躍文，李　靜，何　利，李　誠，胡　濱

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

發(fā)酵香腸中產(chǎn)生物胺的微生物及其檢測方法研究

孫霞，楊勇*，鞏洋，楊敏，卿丹丹，李躍文，李靜，何利，李誠，胡濱

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

發(fā)酵香腸中過量的生物胺不僅會降低產(chǎn)品的品質(zhì)，而且會對機體健康造成不良影響，具有氨基酸脫羧酶活性的微生物會導致生物胺的大量積累，準確全面地檢測產(chǎn)生物胺的微生物對保障香腸的安全具有重要意義。本文綜述了發(fā)酵香腸中生物胺的形成途徑并重點介紹了產(chǎn)生物胺的微生物及其檢測方法，以期為研發(fā)安全的發(fā)酵劑和保障發(fā)酵香腸的品質(zhì)提供參考。

發(fā)酵香腸，生物胺，微生物，檢測方法

發(fā)酵香腸是指將絞碎的肉和動物脂肪同鹽、糖、發(fā)酵劑和香辛料等混合后灌進腸衣，經(jīng)過微生物發(fā)酵制成的具有典型發(fā)酵風味特性的肉制品。生物胺是由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的小分子量含氮化合物。根據(jù)化學結構可將生物胺分為：脂肪族（尸胺、腐胺、精胺和亞精胺等），芳香族（酪胺和苯乙胺等），雜環(huán)族（組胺和色胺等）［1］。發(fā)酵香腸中的生物胺是由微生物產(chǎn)生的蛋白酶作用于蛋白質(zhì)形成游離的氨基酸，而后經(jīng)過某些微生物分泌的氨基酸脫羧酶對氨基酸脫羧而形成，具有氨基酸脫羧酶活性的微生物對生物胺的形成具有重要作用［2］。多種氨基酸脫羧酶在乳桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬中均已有報道［3］。目前發(fā)酵劑廣泛應用于發(fā)酵香腸，發(fā)酵香腸中生物胺含量與發(fā)酵劑密切相關，接種沒有氨基酸脫羧酶活性的發(fā)酵劑對保障發(fā)酵香腸的品質(zhì)具有重要意義。目前，國內(nèi)外學者主要研究接種發(fā)酵劑對生物胺含量的影響。盧士玲等［4］發(fā)現(xiàn)接種短乳桿菌和陰溝腸桿菌的香腸中酪胺和尸胺含量有所增加。Landeta等［5］研究了從西班牙干腌香腸中分離的乳酸菌的安全性，發(fā)現(xiàn)屎腸球菌和清酒乳桿菌能產(chǎn)生酪胺，因此未經(jīng)過檢測生物胺產(chǎn)生能力的發(fā)酵劑使發(fā)酵香腸存在一定的安全隱患。本文綜述了發(fā)酵香腸中生物胺的形成途徑并重點介紹了產(chǎn)生物胺的微生物及其檢測方法，以期為研發(fā)安全的發(fā)酵劑和保障發(fā)酵香腸的品質(zhì)提供參考。

1　發(fā)酵香腸中生物胺的形成途徑

發(fā)酵香腸中生物胺的形成途徑有兩種［6］：第一種是由醛或酮的轉氨作用生成屬于脂肪族的生物胺；第二種是由氨基酸脫羧產(chǎn)生，在微生物的氨基酸脫羧酶作用下，使游離氨基酸脫羧，生成相應的生物胺，并伴隨二氧化碳的產(chǎn)生。發(fā)酵香腸中生物胺的形成以第二種途徑為主，該途徑需要三個條件：充足的生物胺前體物質(zhì)（氨基酸），具有氨基酸脫羧酶活性的微生物和適宜這些微生物生長和分泌氨基酸脫羧酶的環(huán)境條件［7］。

2　產(chǎn)生物胺的微生物

常見的生物胺產(chǎn)生菌株主要來源于乳酸菌、腸細菌、葡萄球菌及其他微生物［8-10］。發(fā)酵香腸中的生物胺呈現(xiàn)出明顯的菌株效應，張志偉等［11］研究了生物胺生成量的菌株效應，結果表明乳桿菌（Lactobacillus）和片球菌（Staphylococcus aureus）均能產(chǎn)生不等量的組胺、尸胺、腐胺、酪胺、亞精胺和精胺，但都不產(chǎn)生色胺，發(fā)酵香腸中的生物胺生成量表現(xiàn)出明顯的菌株效應。

2.1乳酸菌

乳酸菌代謝產(chǎn)生生物胺是機體應激機制在相對低酸和營養(yǎng)匱乏的條件下，乳酸菌為了維持自身生長，受脅迫機制調(diào)控而代謝產(chǎn)生堿性生物胺。劉暢等［12］發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生物胺的乳酸菌主要有片球菌（Pedicoccus sp）、酒球菌（Oenococcus oeni）和乳桿菌（Lactobacillus）等。Danilovic等［13］發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵香腸中分離出來的乳桿菌（Lactobacillus）中能檢測到組氨酸脫羧酶活性，乳球菌（Galactococcus）和明串珠菌（Leuconostoc）屬有產(chǎn)生酪胺的能力。Landeta等［5］發(fā)現(xiàn)從西班牙干腌香腸中分離的乳酸菌中的屎腸球菌（Enterococcus faecium）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）具有產(chǎn)生酪胺的能力。Dapkevicius等［14］發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌和瑞士乳桿菌也能將組氨酸轉化為組胺，這是造成組胺積累的重要原因。Masson等［15］發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵香腸中分離出來的保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）菌株中能檢測到組氨酸脫羧酶活性。

孟甜等［16］從61株益生乳酸菌中檢測出23株菌可不同程度地產(chǎn)生酪胺，在脫羧酶培養(yǎng)基中最大產(chǎn)生量為248.08mg/L，這些益生乳酸菌包括瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、雙歧乳桿菌（Bifidobacterium bifidum）等。酪胺是乳酸菌形成的主要生物胺，尤其彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）是最主要的形成酪胺的微生物，乳酸菌中的短乳桿菌（Lactobacillus brevis），消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius），彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）等被證實有產(chǎn)生物胺的能力，尤其是產(chǎn)酪胺的能力較強［9］。李超等［17］發(fā)現(xiàn)25株乳酸菌都不產(chǎn)組胺，40.91%的乳酸菌能產(chǎn)生酪胺，有些菌可使賴氨酸脫羧產(chǎn)生尸胺，有些菌株可使精氨酸脫羧產(chǎn)生精胺或亞精胺。

2.2腸細菌

腸細菌是發(fā)酵香腸中經(jīng)常被檢測出來的一類具有較強的產(chǎn)氨基酸脫羧酶能力的細菌，是發(fā)酵香腸中產(chǎn)尸胺與腐胺的主要細菌［10］。Kalac等［18］研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌中的陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）和沙雷氏菌（Serratia marcescens）具有較高的產(chǎn)尸胺和腐胺的能力，而弗氏梓檬酸菌（Citrobacter）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）則具有極強的產(chǎn)腐胺和尸胺的能力。Min等［19］在對16種細菌的產(chǎn)生物胺能力的研究中發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）的產(chǎn)腐胺能力最強，而產(chǎn)尸胺能力相對較弱。Bover-cid等［20］研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腸桿菌都具有產(chǎn)尸胺或腐胺的能力，其中陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）以及沙雷氏菌（Serratia marcescens）可大量的產(chǎn)生二元胺類。體外研究表明陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）和沙雷氏菌（Serratia marcescens）等種屬可產(chǎn)生大量的尸胺和腐胺，弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）菌株在體外分別會產(chǎn)生大量的尸胺和腐胺，許多腸桿菌也能產(chǎn)生相當數(shù)量的組胺［21］。李彬等［22］發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是發(fā)酵香腸中產(chǎn)尸胺和腐胺的主要腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）有較強的產(chǎn)尸胺能力，而陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）的產(chǎn)腐胺能力則相對較強；兩者混合接種培養(yǎng)時，在產(chǎn)尸胺方面存在明顯的協(xié)同作用，幾乎所用混合體系的尸胺產(chǎn)量都高于兩個純菌體系。Hortensia等［23］研究從西班牙發(fā)酵香腸中分離的腸桿菌發(fā)現(xiàn)36株產(chǎn)氣腸桿菌均具有賴氨酸脫羧酶活性、鳥氨酸脫羧酶活性以及組氨酸脫羧酶活；30株大腸桿菌均具有賴氨酸脫羧酶活性和鳥氨酸脫羧酶活性，70%的大腸桿菌（Escherichia Coli）還具有組氨酸大腸桿菌活性；16株沙雷氏菌（Serratia marcescens）和假單胞菌（Pseudomonadaceae）均同時具有酪氨酸脫羧酶活性、鳥氨酸脫羧酶活性和賴氨酸脫羧酶活性。

Ozkaya等［24］指出腸細菌是發(fā)酵香腸中產(chǎn)生組胺、酪胺、尸胺和腐胺最主要的細菌。Lorenzo等［25］對79株腸細菌進行了產(chǎn)生物胺能力的調(diào)查，結果發(fā)現(xiàn)75株都有鳥氨酸脫羧和賴氨酸脫羧能力，并且發(fā)現(xiàn)蜂窩哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）、沙雷氏菌（Serratia marcescens）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、克雷伯氏菌（Klebsiella）以及大腸桿菌（Escherichia Coli）都具有產(chǎn)尸胺和腐胺的能力。盧士玲等［26］建立了單層培養(yǎng)，雙層顯色分離產(chǎn)生物胺腸細菌的方法，并從傳統(tǒng)中式香腸中分離到96株產(chǎn)生物胺腸細菌，經(jīng)DNA測序，5種產(chǎn)生物胺優(yōu)勢菌分別為：屎腸球菌（Enterococcus faecium）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、大腸埃希桿菌（Escherichia coli）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）。苯乙胺主要是由腸細菌產(chǎn)生，而腸細菌主要在發(fā)酵的前期產(chǎn)生物胺［27］。

2.3葡萄球菌

Montel等［28］從西班牙香腸中分離到的76%的木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)組胺能力，肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）有高氨基酸脫羧酶活性，并且能夠產(chǎn)生尸胺、苯乙胺、腐胺和組胺。Martuscelli等［29］從香腸中分離到51種木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）菌株，發(fā)現(xiàn)其中的21種有體外氨基酸脫羧酶的活性，有7種產(chǎn)生酪胺、亞精胺和精胺的量超過100mg/kg。Masson等［15］研究發(fā)現(xiàn)凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococcus）可以作為安全的發(fā)酵劑，從香腸中分離到的23個菌株都具有弱酪胺生成能力。李蕊婷等［30］從新疆熏馬腸分離產(chǎn)胺優(yōu)勢菌株，發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）產(chǎn)苯乙胺量最高為3831.50μg/mL。

2.4其他微生物

Montel等［28］發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵香腸中分離到的德巴利氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）和念珠菌（Candida Albicans）有組氨酸脫羧酶活性，而且其活性比保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）的要高，未鑒定的酵母菌株可產(chǎn)生大量的苯乙胺和酪胺。Ganna等［31］發(fā)現(xiàn)酵母具有產(chǎn)生物胺的能力。Caruso等［32］發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有產(chǎn)色胺、苯乙胺、腐胺和組胺能力，檸檬形克勒克酵母（Kloechera apiculata）具有產(chǎn)色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺和組胺能力，美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）具有產(chǎn)苯乙胺、腐胺和尸胺能力。

3　產(chǎn)生物胺微生物的檢測方法

目前，產(chǎn)生物胺微生物的檢測方法有三種［3］：微生物培養(yǎng)顯色法、化學檢測法和分子檢測法。

3.1微生物培養(yǎng)顯色法

微生物培養(yǎng)顯色法是根據(jù)產(chǎn)生物胺菌株的生理特征及其在生長過程中所引起的周圍環(huán)境pH的變化，采用特異性添加了適當酸堿指示劑的選擇培養(yǎng)基來進行篩選鑒別，主要是利用一種低酸和營養(yǎng)貧瘠的環(huán)境，誘導氨基酸脫羧酶，使微生物在大量的底物氨基酸存在的情況下，將氨基酸脫羧成為相應的生物胺。常用溴甲酚紫作為顯色劑。

1954年Moller首次運用顏色指示的脫羧酶培養(yǎng)基檢測了腸球菌的脫羧酶活性。Bover-Cid等［20］改進了脫羧酶檢測培養(yǎng)基，加入緩沖溶液磷酸鹽和碳酸鈣來中和產(chǎn)生的酸。Maijala等［33］在此基礎上加入了肉湯，并且除去了NaCl和葡萄糖，有效阻止了培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中的pH下降，發(fā)現(xiàn)其能很好的檢測發(fā)酵香腸中產(chǎn)生物胺乳酸菌。劉暢等［12］利用添加了前體氨基酸的氨基酸脫羧酶篩選培養(yǎng)基對各菌株的產(chǎn)胺能力進行初篩，發(fā)現(xiàn)檢測的39株菌中，8株菌具有產(chǎn)酪胺的能力，7株菌具有產(chǎn)精胺的能力，1株菌具有產(chǎn)組胺的能力，1株菌具有產(chǎn)腐胺的能力。Zhihua等［34］發(fā)現(xiàn)一種快速檢測組胺產(chǎn)生菌的瓊脂培養(yǎng)基，先使用雙層膜過濾樣品后，將下層膜放置于海水瓊脂培養(yǎng)基（pH5.8）組胺（0.5%）作為碳源，溴甲酚藍為指示劑，培養(yǎng)24h后，通過顏色變化（由藍到紅）來檢測組胺產(chǎn)生菌。孟甜［35］使用氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基初步篩查61株乳酸菌產(chǎn)生物胺情況。經(jīng)此法初步檢測到2株乳酸菌有組氨酸脫羧酶活性，16株乳酸菌有酪氨酸脫羧酶活性，61株乳酸菌均沒有檢測到鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶活性。王長遠等［36］經(jīng)雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)表明植物乳桿菌菌株在倒入上層培養(yǎng)基后，很快就會發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生物胺菌的菌落變成紫色，說明植物乳桿菌能產(chǎn)生生物胺。李超［37］為了防止氧氣的影響，在Bover-cid的方法基礎上，采用了雙層培養(yǎng)方法。盧士玲等［23］建立了單層培養(yǎng)，雙層顯色分離產(chǎn)生物胺乳酸菌和腸細菌的方法，采用單層培養(yǎng)雙層顯色法，克服了產(chǎn)生物胺菌和不產(chǎn)生物胺菌之間的交互影響。

由于微生物代謝的復雜性，導致檢測存在假陽性和假陰性的結果。培養(yǎng)過程中產(chǎn)生其他堿性物質(zhì)，造成假陽性的結果，有些菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)酸造成假陰性的結果［27］。通過傳統(tǒng)的微生物學培養(yǎng)的方法檢測生物胺產(chǎn)生菌過程繁瑣而且不可靠，有周期長、低敏感性等缺點，因此此方法只能作為產(chǎn)生物胺菌株的粗篩方法。

3.2化學檢測法

將采用微生物學粗篩出來的微生物接種于添加了氨基酸前體的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用化學方法對培養(yǎng)基中生物胺含量進行測定，從而判斷該微生物菌株是否具有產(chǎn)生物胺能力的方法即為化學檢測法。該方法彌補了微生物學檢測可能引起的假陰性或假陽性結果?；瘜W方法不僅可以定性判定產(chǎn)生物胺的微生物菌株，而且可以對微生物所產(chǎn)生物胺進行準確的定量分析。較為常用的化學檢測手段包括：薄層色譜、毛細管電泳、生物傳感器和高效液相色譜法等，其中高效液相色譜法應用最為廣泛?；瘜W方法的不足是需要較為昂貴的儀器和試劑。

薄層色譜準確性和特異性與很多方法相比存在不足，但作為一種簡單快速的方法，不需要復雜的設備，常用于多胺的定量檢測。Costantini等［38］檢測133株分離自酒和葡萄汁中的乳酸菌產(chǎn)組胺、酪胺和腐胺的情況，利用薄層色譜和液相色譜驗證了PCR的結果。

毛細管電泳有靈敏度高、分離速度快、儀器簡單、成本低、無環(huán)境污染等優(yōu)點。Jastrzebska等［39］應用毛細管等速電泳，采用兩個簡單程序不經(jīng)衍生反應檢測豬肉、牛肉和家禽肉中的生物胺，兩個電解質(zhì)系統(tǒng)具有滿意的分離參數(shù)，生物胺標準品以及混合品的平均回收率在99%～100%和95%～105%。

生物傳感器檢測生物胺具有簡便、快速、成本低等優(yōu)點。在生物胺分析方法中，主要研究的是電化學生物傳感器。其原理是：生物胺在單胺氧化酶或二胺氧化酶的催化下脫去氨基生成醛、氨和過氧化氫。Calvo-Pérez等［40］研究利用含有血漿胺氧化酶的石墨電極來檢測酪胺，使用戊二醛，通過與牛血清蛋白交叉偶聯(lián)的方式，其線性范圍為2～164μmol/L，檢測限為（2.0±0.18）μmol/L。Pospiskova等［41］采用光學氧傳感器作為換能器，利用來自豌豆的二胺氧化酶并將之固定在覆蓋甲殼素的磁性微粒和鐵磁流體修飾的凈微粒上，酶催化生物胺氧化消耗氧氣，通過檢測消耗氧氣的量，對生物胺進行檢測，腐胺和尸胺的檢測限是25～30μmol/L。

高效液相色譜法具有應用的固定相顆粒極細，柱效能高，流動相流速快，分析周期短等優(yōu)點。生物胺的定性定量檢測多采用反相高效液相色譜。李志軍［42］用高效液相測定109株乳酸菌培養(yǎng)液產(chǎn)生物胺的能力，發(fā)現(xiàn)109株乳酸菌培養(yǎng)液中均檢出微量腐胺（＜20mg/L）和含量不等的酪胺（2.92～1823.17）mg/L，109株乳酸菌培養(yǎng)液中均未檢出組胺。孟甜等［16］利用脫羧酶培養(yǎng)基初步篩查61株乳酸菌產(chǎn)生物胺情況，再通過RT-HPLC法測定其在發(fā)酵液中的生物胺含量，結果表明61株乳酸菌中23株乳酸菌為酪胺產(chǎn)生菌，只有3株為組胺產(chǎn)生菌。王長遠等［36］利用高效液相色譜法對植物乳桿菌產(chǎn)生物胺量進行測定，量取5mL植物乳桿菌發(fā)酵液，經(jīng)濃度0.4mol/L高氯酸提取，結果表明植物乳桿菌產(chǎn)組胺和酪胺的濃度分別為211.03μg/mL和144.43μg/mL。

李蕊婷等［30］從新疆熏馬腸分離產(chǎn)胺優(yōu)勢菌，利用高效液相色譜檢測菌液產(chǎn)物，驗證其產(chǎn)生物胺的能力，發(fā)現(xiàn)4號菌株（沙雷氏菌）產(chǎn)生物胺總量最高為985.14μg/mL，且組胺生成量最高為7259.64μg/mL；17號菌株（陰溝腸桿菌）產(chǎn)生物胺總量次高為737.78μg/mL，且色胺生成量最高為4507.81μg/mL；11號菌株（克雷伯氏菌）產(chǎn)腐胺的量最高為2550.54μg/mL。

3.3分子檢測法

分子檢測法是根據(jù)產(chǎn)生物胺微生物的氨基酸脫羧酶的氨基酸或核酸序列的保守區(qū)設計特異性引物，通過PCR技術進行特異性擴增，然后進行凝膠電泳，分析檢測微生物是否含有氨基酸脫羧酶基因，是否具有產(chǎn)生物胺的能力。分子檢測法檢測生物胺產(chǎn)生菌更快速，更可靠，不依賴于培養(yǎng)基，而且分子檢測法可以在生物胺形成之前，檢測出潛在的危險。

目前，對產(chǎn)生物胺細菌的分子檢測方法主要集中在產(chǎn)組胺、產(chǎn)酪胺、產(chǎn)腐胺和產(chǎn)尸胺菌株。組胺是由組氨酸脫羧酶催化組氨酸脫羧形成的，Lucas等［43］采用實時定量PCR的方法對酒中產(chǎn)組胺乳酸菌進行檢測和計數(shù)，引物對組氨酸脫羧酶基因擴增出84bp的基因片段。Ruiz等［44］研究了8株酒酒球菌攜帶組氨酸脫羧酶基因的情況，結果顯示檢測的8株酒酒球菌都不攜帶組氨酸脫羧酶基因。

酪胺是由酪氨酸酸脫羧酶催化酪氨酸脫羧形成的，Costantini等［45］根據(jù)短乳桿菌和腸球菌基因序列設計了新的引物對Pt3/Pt4，檢測133株乳酸菌的酪氨酸脫酸酶基因。Coton等［46］設計了特異性引物對TD2/ TD5，其有效檢測出酪胺產(chǎn)生菌，擴增片段長度為1100bp。

腐胺是由鳥氨酸脫羧酶催化鳥氨酸脫羧產(chǎn)生的，Costantini等［47］利用引物對檢測到乳酸菌不攜帶鳥氨酸脫羧酶基因。Ruiz等［44］使用特異性引物對檢測酒酒球菌中的鳥氨酸脫羧酶基因，結果顯示檢測的酒酒球菌都不攜帶鳥氨酸脫羧酶基因。徐文娟等［48］利用聚合酶鏈式反應（PCR）技術確定菌體基因組中是否存在鳥氨基酸脫羧酶基因，結果發(fā)現(xiàn)菌株基因組攜帶有鳥氨酸脫羧酶基因，精氨酸脫羧酶基因等參與精胺和腐胺相互轉化的相關酶基因并未檢測出。

尸胺是由賴氨酸在賴氨酸脫羧酶的催化下脫羧形成的，李彬［49］采用熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣腸桿菌具有較強產(chǎn)尸胺的能力和相對較弱的產(chǎn)腐胺的能力，陰溝腸桿菌則均有較強的產(chǎn)腐胺的能力和相對較弱的產(chǎn)尸胺的能力。

還有學者研究了多種氨基酸脫羧酶基因，采用多重PCR技術同時檢測復雜樣品中的產(chǎn)酪胺、組胺、尸胺和腐胺的菌株。孟甜［34］通過比對已報道的組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶基因序列，以61株乳酸菌基因組DNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈式反應（PCR），擴增出3株乳酸菌具有組氨酸脫羧酶基因，22株乳酸菌具有酪氨酸脫羧酶基因。朱成龍等［50］利用單重PCR和多重PCR方法，采用3對特異的引物檢測40株酒酒球菌基因組中是否含有組氨酸脫羧酶基因、酪氨酸脫羧酶基因和鳥氨酸脫羧酶基因。結果顯示建立的PCR方法可作為快捷、高度特異檢測含有組氨酸脫羧酶基因、酪氨酸脫羧酶基因和鳥氨酸脫羧酶基因微生物的方法。

PCR反應可以檢測潛在的產(chǎn)生物胺菌株，檢測結果可以和微生物培養(yǎng)顯色法相比較，以確定菌株是否具有產(chǎn)生物胺的能力。PCR方法可以在生物胺產(chǎn)生之前檢測出潛在的產(chǎn)生物胺的危險，但不能預示出產(chǎn)品中最終的生物胺含量。

4　總結與展望

發(fā)酵香腸中產(chǎn)生物胺的微生物種類繁多，各個菌種間存在一定的協(xié)同或拮抗作用，不同菌種產(chǎn)生物胺的能力各不相同，在不同的環(huán)境條件下對生物胺含量有不同的影響，因此系統(tǒng)地研究產(chǎn)生物胺的微生物顯得尤為重要。此外微生物代謝機制復雜，傳統(tǒng)的微生物顯色法雖然操作簡單，但檢測結果存在假陽性和假陰性、低敏感性等缺點，它只能作為一種產(chǎn)生物胺菌株的粗篩方法；化學檢測方法可以對生物胺進行準確的定量分析，但前處理時間較長并且需要昂貴的儀器和試劑；分子檢測法可以在生物胺產(chǎn)生之前檢測出潛在的產(chǎn)生物胺的危險，但對產(chǎn)品最終的生物胺含量不能定量分析。因此，在傳統(tǒng)微生物顯色法的基礎上運用化學和分子檢測方法相結合不僅能夠檢測具有潛在產(chǎn)生物胺的菌株，而且可以對微生物所產(chǎn)生物胺進行準確的定量分析。目前已有少數(shù)學者利用雙層培養(yǎng)基顯色法初步分離產(chǎn)胺優(yōu)勢菌，再采用PCR-DGGE技術，剔除重復菌株并通過同源性比對確認產(chǎn)胺菌，最后利用高效液相色譜檢測菌液產(chǎn)物，驗證菌株產(chǎn)生物胺的能力，發(fā)現(xiàn)此三種方法結合不僅能準確判斷產(chǎn)生物胺菌株，而且可以定量分析菌株所產(chǎn)生物胺含量。因此在傳統(tǒng)微生物顯色法的基礎上采用多重PCR技術同時檢測復雜樣品中的產(chǎn)生物胺的菌株和利用高效液相驗證菌株產(chǎn)生物胺的能力，值得更深入的研究。發(fā)酵香腸中過量的生物胺會對機體產(chǎn)生不良影響，為保障發(fā)酵香腸的安全，積極加強對發(fā)酵香腸中產(chǎn)生物胺微生物的系統(tǒng)研究、快速檢測生物胺產(chǎn)生菌的方法建立，研發(fā)安全的發(fā)酵劑和建立有效的發(fā)酵香腸安全評價體系將會成為今后研究的重點。

［1］Ruiz C，Jiménez F.Biogenic amines in meat and meat products［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2004，44（2）：489-499.

［2］Silla Santos M H.Biogenic amines：their importance in foods［J］.International Journal of Food Microbiology，1996，29（2）：213-231.

［3］鄧紅梅.傳統(tǒng)中式香腸中產(chǎn)生物胺氧化酶菌對生物胺影響的研究［D］.石河子：石河子大學，2012.

［4］盧士玲，樊慶魯，李開雄，等.豬肉自然發(fā)酵香腸中細菌和乳酸菌對生物胺積累的作用［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27（2）：37-40.

［5］Landeta G，Curiel J A，Carrascosa A V，et al.Technological and safety properties of lactic acid bacteria isolated from Spanish dry-cured sausages［J］.Meat Science，2013，95（2）：272-280.

［6］Kim M K，Mah J H，Hwang H J.Biogenic amine formation and bacterial contribution in fish squid and shellfish［J］.Food Chemistry，2009，116（1）：87-95.

［7］Linares D M，Matrtin M，Ladero V，et al.Biogenic amines in dairy products［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2011，51（7）：691-703.

［8］Delasrivas B，Marcobal A，Carrascosa A，et al.PCR detection of food borne bacteria producing the biogenic amines histamine，tyramine，putrescine and cadaverine［J］.Food Protect，2006，69（10）：2509-2514.

［9］Crespo M T，Pereira C I，Romao M V S.Evidence for proteolytic activity and biogenicamminesproductioninLactobacillus curvatus and L.homohiochii［J］.International Journal of Food Microbiology，2001，68（1）：211-216.

［10］Pircher A，Bauer F，Paulsen P.Formation of cadaverine，histamine，putrescine and tyramine by bacteria isolated from meat，fermented sausages and cheeses［J］.European Food Research and Technology，2007，22（6）：225-231.

［11］張志偉，謝華，紐廣安，等.發(fā)酵香腸中生物胺生成量的菌株效應分析［J］.肉類研究，2005，1（1）：28-30.

［12］劉暢，張灼陽，郭曉奎.產(chǎn)生物胺乳酸菌的篩查與檢測［J］.中國微生態(tài)學雜志，2009，21（5）：427-429.

［13］Danilovicb，Jokovicn，Petrovicl，et al.The characterisation of lactic acid bacteria during the fermentation of an artisan Serbian sausage（Petrovská Klobása）［J］.Meat Science，2011，88（4）：668-674.

［14］Dapkevicius M，Noutm J R，RomboutsF M，et al.Biogenic amine formation and degradation by potential fish silage starter microorganisms［J］.International Journal of Food Microbiology，2000，57（1-2）：107-114.

［15］Masson F，Talon R，Montel M C.Histamine and tyramnie production by bacteria from meat products［J］.International Journal of Food Microbiology，1996，32（1）：199-207.

［16］孟甜，田豐偉，陳衛(wèi)，等.一種利用RT-HPLC分析乳酸菌產(chǎn)生物胺的方法［J］.微生物學通報，2010，37（1）：141-146.

［17］李超，董明盛.一種改進的產(chǎn)生物胺乳酸菌的檢測方法［J］.食品科學，2005，26（6）：193-196.

［18］Kalac P.Biologically active polyamines in beef，pork and meat products：A review［J］.Meat Science，2006，73（2）：1-11.

［19］Min J S，Lee S O，Jang A，et al.Production of biogenic amines by microflora inoculated in meats［J］.Asian-Australian Journal of Animal Sciences，2004，17（1）：1472-1478.

［20］Bover-Cid S，Wilhelm H H.Improved screening procedure forbiogenicamineproductionbylacticacidbacteria［J］. International Journal of Food Microbiology，1999，53（3）：33-41.

［21］Zaman M Z，Bakar F A，Selama T J，et al.Occurrence of biogenic amines and amines degrading bacteria in fish sauce［J］. Czech Journal of Food Sciences，2010，28（5）：440-449.

［22］李彬，舒蕊華，徐幸蓮，等.液體培養(yǎng)條件下產(chǎn)氣腸桿菌與陰溝腸桿菌產(chǎn)生物胺交互作用研究［J］.食品科學，2012，33（5）：160-164.

［23］Hortensia S M.Amino acid decarboxylase capability of microorganisms isolated in Spanish fermented meat products［J］. International Journal of Food Microbiology，1998，39：227-230.

［24］Ozkaya F，Ayhan K，Vural N.Biogenic amines produced by Enterobacteriaceae isolated from meat products［J］.Meat Science，2001，58（2）：163-166.

［25］Lorenzo J M，Cachaldora A，F(xiàn)onseca S，et al.Production of biogenic amines“in vitro”in relation to the growth phase by Enterobacteriaceae species isolated from traditional sausages［J］. Meat Science，2010，86（3）：684-691.

［26］盧士玲，李開雄，徐幸蓮，等.傳統(tǒng)香腸中產(chǎn)生物胺腸細菌和乳酸菌分離方法的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（8）：47-52.

［27］Roig-Sagués A X，Hernández，Herrero，et al.Microbiological events during the elaboration of“fuet”，a spanish ripened sausage. Relationship between the development of histidine and tyrosine decarboxilase containing bacteria and pH and water activity［J］. European Food Research and Technology，2009，12（2）：108-112.

［28］Montel M C，Masson F，Talon R.Comparison of biogenic amine content in traditional and industrial French dry sausages［J］.Sciences des Aliments，1999，19（2）：247-254.

［29］Martuscelli M，Crudele M A，Gardini F，et al.Biogenic amine formation and oxidation by Staphylococcus xylosus strains from artisanal fermented sausages［J］.Letters in Applied Microbiology，2000，31（3）：228-232.

［30］李蕊婷，盧士玲，李開雄，等.新疆熏馬腸中產(chǎn)氨基酸脫羧酶優(yōu)勢細菌的分離及鑒定［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，9（1）：52-65.

［31］Ganna V，Mark R Bleackley.Oxidation of organic and biogenic amines by recombinant human hephaestin expressed in pichia pastoris［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2011，514（3）：50-56.

［32］Caruso M，F(xiàn)iore C，Contursi M，et al.Formation of biogenic amines as criteria for the selection of wine yeasts［J］.World Journal of Microbiology&Biotechnology，2002，18（2）：159-163.

［33］Maijala R L.Formation of histamine and tyramine by some lactic acid bacteria in MRS broth and modified decarboxylation agar［J］.Letters in Applied Microbiology 2003，17（3）：40-43.

［34］Zhihua Tao，Minoru，Sato，et al.Simple and rapid detection of histamine forming bacteria by differential agar medium［J］.Food Control，2009，20（2）：903-906.

［35］孟甜.乳酸菌產(chǎn)生物胺的鑒定及食品中生物胺的檢測［D］.無錫：江南大學，2012.

［36］王長遠，王云光，于長青，等.產(chǎn)生物胺乳酸菌的檢測及產(chǎn)生物胺量的測定［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學刊，2010，1（1）：22-25.

［37］李超.產(chǎn)生物胺乳酸菌檢測方法的建立其應用［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2005.

［38］Costantini A，Cersosimo M，Prete V，et al.Production of biogenic amine by lactic acid bacteria，screening by PCR，thin layer chromatography，and high performance liquid chromatography of strains isolated from wine and must［J］.Journal of Food Protection，2006，69（5）：391-396.

［39］Jastrzebska A.A comparative study for determination of biogenic amines in meat samples by capillary isotachophoresis with two electrolyte systems［J］.European food research and technology，2012，235（6）：563-572.

［40］Calvo-Pérez A，Domínguez-Renedo O，Alonso-Lomillo M A，et al.Disposable amperometric biosensor for the determination of tyramine using plasma amino oxidase［J］.Microchimica Acta，2013，180（2）：253-259.

［41］Pospiskova K，Safarik I，Sebela M，et al.Magnetic particlesbased biosensor for biogenic amines using an optical oxygen sensor as a transducer［J］.Microchim Acta，2013，180（6）：311-318.

［42］李志軍.食品中生物胺及其產(chǎn)生菌株檢測方法研究［D］.青島：中國海洋大學，2007.

［43］Lucas P，Claisse O，Lonvaud-Funel A.High frequency of histamine-producing bacteria in the enological environment and instability of the histidine decarboxylase production phenotype［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（3）：811-817.

［44］Ruiz P，Izquierdo P M，Sese?a S，et al.Selection of autochthonousOenococcusoenistrainsaccordingtotheir oenological properties and vinification results［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，137（5）：230-235.

［45］Costantini A，Cersosimo M，Prete V，et al.Production of biogenic amine by lactic acid bacteria，screening by PCR，thin layer chromatography，and high performance liquid chromatography of strains isolated from wine and must［J］.Journal of Food Protection，2006，69（3）：391-396.

［46］Coton M，Coton E，Lucas P，et al.Identification of the gene encoding a putative tyrosine decarboxylase of Carnobacterium divergens 508 development of molecular tools for the detection of tyramine-producing bacteria［J］.Food Microbiology，2004，21（1）：125-130.

［47］Costantini A，Vaudano E，Petre V，et al.Biogenic amine production by contaminating bacteria found in starter preparations used in wine making［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2009，57（4）：10664-10669.

［48］徐文娟，劉芳，王道營，等.大腸桿菌YSY1產(chǎn)腐胺特性及相關基因分析［J］.食品科學，2013，34（17）：136-142.

［49］李彬.產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌產(chǎn)生物胺作用的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

［50］朱成龍，李凱，楊芮，等.聚合酶鏈式反應對酒酒球菌氨基酸脫羧酶基因的檢測［J］.食品科學，2013，6（4）：42-56.

Review on microorganism of producing biogenic amine and detecting methods in fermented sausage

SUN Xia，YANG Yong*，GONG Yang，YANG Min，QING Dan-dan，LI Yue-wen，LI Jing，HE Li，LI Cheng，HU Bin
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Excessive amount of biogenic amines in fermented sausage，not only influences quality and safety of fermented sausage，but also could cause adverse reactions on the body.Amino acid decarboxylase activity of microorganism lead to accumulate a lot of biogenic amines，accurate comprehensive detection of microorganism producing biogenic amine importance to ensure the safety of sausage.The way of formation and focus on the microorganism of producing biogenic amine and its detecting methods was introduced in the article，in order to develop safer starter cultures and guarantee for quality of fermented sausage provided some

.

fermented sausage；biogenic amine；microorganism；detection methods

TS251.65

A

1002-0306（2015）12-0379-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.072

2014－10－21

孫霞（1989-），女，碩士研究生，研究方向：肉品科學與技術。

楊勇（1969-），男，博士，教授，研究方向：肉品科學與技術。

四川省科技廳成果轉化項目（2013NC0052）。