紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜葉狀體防御性物質(zhì)含量及保護(hù)性酶類活性的影響?

張曉南, 孫佩佩, 茅云翔??, 鄒丹丹, 唐祥海, 莫照蘭

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003； 2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

?

紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜葉狀體防御性物質(zhì)含量及保護(hù)性酶類活性的影響?

張曉南1,2, 孫佩佩1,2, 茅云翔1,2??, 鄒丹丹1,2, 唐祥海1,2, 莫照蘭3

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003； 2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

研究了紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜葉狀體防御性物質(zhì)脯氨酸(Pro)，保護(hù)性酶類苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)，防御信號(hào)活性氧(ROS)和細(xì)胞損傷指示性物質(zhì)丙二醛(MDA)，在不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、3、5、7、9 d)的含量和活性影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：紫菜腐霉侵染能夠打破細(xì)胞ROS的動(dòng)態(tài)平衡，引起ROS含量極顯著增加(P<0.01)，進(jìn)而影響細(xì)胞滲透壓平衡，表現(xiàn)為Pro含量極顯著增加(P<0.01)，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶類PAL和PPO活性極顯著增加(P<0.01)，并且ROS積累引起細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，MDA含量發(fā)生極顯著變化(P<0.01)。由此推測(cè)條斑紫菜葉狀體對(duì)紫菜腐霉侵染的生理響應(yīng)過(guò)程為：紫菜腐霉侵染引起藻體ROS含量積累上升，積累的ROS激活機(jī)體防御系統(tǒng)，Pro含量增加以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡；同時(shí)積累的ROS激活細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶類，PAL和PPO的活性增強(qiáng)。迅速積累的ROS引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，產(chǎn)生并積累MDA。本實(shí)驗(yàn)為全面了解條斑紫菜防御紫菜腐霉侵染的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為后續(xù)條斑紫菜赤腐病抗性品系的選育提供了理論指導(dǎo)。

條斑紫菜；紫菜腐霉；侵染；防御性物質(zhì)；保護(hù)酶類；丙二醛

條斑紫菜(Pyropiayezoensis)是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)海藻，在中國(guó)北方地區(qū)被廣泛栽培。條斑紫菜在其進(jìn)化過(guò)程中不斷適應(yīng)潮間帶重復(fù)性干露和復(fù)水的環(huán)境，因此具有很強(qiáng)的抗逆能力，能夠適應(yīng)潮間帶溫度、光強(qiáng)、滲透壓等的急劇變化，成為潮間帶海藻的典型代表，具有重要的科研價(jià)值[1]。近年來(lái)，隨著紫菜栽培面積的不斷擴(kuò)大，海區(qū)環(huán)境不斷惡化，病原菌的侵染以及種質(zhì)退化問(wèn)題，導(dǎo)致紫菜病害時(shí)有發(fā)生[2-3]。紫菜病害的發(fā)生，不僅降低了紫菜品質(zhì)，而且導(dǎo)致大面積減產(chǎn)，甚至絕收，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大損失[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于高等植物的抗病性相關(guān)的生理生化變化已做了大量研究，并取得相應(yīng)的研究成果。防御性物質(zhì)Pro可以通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓來(lái)保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性，周寶利等[5]研究了嫁接茄子抗病性與電導(dǎo)率和游離脯氨酸含量變化的關(guān)系。保護(hù)性酶類PAL和PPO在植物抗病反應(yīng)中有重要的生理意義，楊家書等[6]研究了小麥白粉病的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性的關(guān)系，F(xiàn)riend等[7]研究了馬鈴薯晚疫病發(fā)病過(guò)程中機(jī)體內(nèi)苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性的變化，并指出PAL和PPO 2種酶與植物的抗病性呈正相關(guān)。近年來(lái)，活性氧ROS因廣泛存在并具有重要生理功能而受到廣泛研究[8-9]。氧爆發(fā)不僅對(duì)入侵的病原菌有細(xì)胞毒害作用，還可以作為一種信號(hào)激活寄主植物進(jìn)一步的防御反應(yīng)，比如過(guò)敏性細(xì)胞死亡[10]。盡管高濃度的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害作用，但其在植物-病原菌互作反應(yīng)中的防御信號(hào)作用不容忽視[11]。如Doke等[12]研究發(fā)現(xiàn)了煙草花葉病毒(TMV)侵染煙草后引起感染葉片活性氧爆發(fā)，Sekizawa等[13]在研究水稻稻瘟病時(shí)也發(fā)現(xiàn)了在菌株侵染水稻時(shí)有大量活性氧釋放，他們認(rèn)為ROS在植物抗病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。細(xì)胞損傷指示物質(zhì)MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可以反應(yīng)細(xì)胞受損傷程度。Radwana等[14]在黃色花葉病毒感染南瓜葉子的過(guò)程中，將MDA作為細(xì)胞受到破壞的直接相關(guān)物質(zhì)。藻類對(duì)病原菌的生理生化響應(yīng)雖然也有一些報(bào)道。在墨角藻的研究中發(fā)現(xiàn)脯氨酸可以抑制細(xì)菌的附著[15]；Bouara等[16]在內(nèi)生病原菌對(duì)角叉菜配子體侵染的研究中觀察到PAL活性的升高；在對(duì)海帶病爛研究中也發(fā)現(xiàn)了PAL和PPO活性的動(dòng)態(tài)變化[17]。在藻類中也發(fā)現(xiàn)了病原菌侵染時(shí)的ROS積累，Weinberger等[18-19]在對(duì)江蘺屬紅藻(Gracilariasp.)的研究中發(fā)現(xiàn)，其在受到瓊膠寡糖刺激時(shí)，可迅速檢測(cè)到H2O2的積累。彭金良等[20]研究了非生物脅迫對(duì)小球藻的影響，發(fā)現(xiàn)α-萘酚會(huì)引起細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的過(guò)氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的形成。但迄今為止，未見(jiàn)有關(guān)條斑紫菜應(yīng)對(duì)病原菌侵染響應(yīng)機(jī)制的報(bào)道。

條斑紫菜赤腐病(red rot disease)是由紫菜腐霉(Pythiumporphyrae)引起的一種嚴(yán)重危害條斑紫菜生長(zhǎng)的卵菌病害。該病首先由Arasaki[21-22]報(bào)道，由Takahasi[23]定名；馬家海等首次報(bào)道了中國(guó)條斑紫菜赤腐病的發(fā)生，并分離純化出紫菜腐霉[24]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于紫菜腐霉的生長(zhǎng)發(fā)育[25-26]、對(duì)紫菜的侵染過(guò)程[27]、對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別與附著機(jī)理[28]已有研究，但研究主要集中于病害的預(yù)防監(jiān)測(cè)[29-30]，對(duì)藻體抗病相關(guān)研究較少。Uppalapati等[31]、Park等[32]利用紫菜腐霉侵染產(chǎn)生的病斑個(gè)數(shù)、病斑面積等指標(biāo)對(duì)幾種紫菜做了抗病性評(píng)價(jià)，而對(duì)抗病生理生化方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，研究紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜葉狀體生理生化指標(biāo)的影響，探討條斑紫菜葉狀體對(duì)紫菜腐霉侵染的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)條斑紫菜赤腐病抗性品系的選育有重要價(jià)值。

為此，本研究以條斑紫菜葉狀體和紫菜腐霉為實(shí)驗(yàn)材料，研究了在紫菜腐霉侵染條件下條斑紫菜葉狀體防御性物質(zhì)脯氨酸(Pro)，保護(hù)性酶類苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)，防御信號(hào)活性氧(ROS)和細(xì)胞損傷指示性物質(zhì)丙二醛(MDA)，在不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、3、5、7、9 d)的含量和活性變化，旨在初步了解條斑紫菜葉狀體對(duì)紫菜腐霉侵染的機(jī)體響應(yīng)機(jī)制，為全面認(rèn)識(shí)條斑紫菜的抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為條斑紫菜抗病性綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系的建立提供依據(jù)，同時(shí)為后續(xù)條斑紫菜抗病品種的選育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

條斑紫菜葉狀體是2014年2—4月采自青島湛山灣(36° 03′ 07.5″ N; 120° 21′ 45.6″ E)，0～4℃低溫下12 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。葉狀體經(jīng)過(guò)無(wú)菌海水刷洗以去除表面沉淀和附著的雜藻。清洗后的紫菜在實(shí)驗(yàn)室條件(10 ℃，32 ppt，60～80 μmol photons m-2·s-1，12 D∶12 L)馴化2～3 d，每3d添加一次PES營(yíng)養(yǎng)鹽[33]。選擇生理狀態(tài)良好、長(zhǎng)度在3～4 cm的健康紫菜用于后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)。

病原菌紫菜腐霉分離自江蘇紫菜栽培海區(qū)，菌株編號(hào)為OUCPABTP005。紫菜腐霉培養(yǎng)在玉米瓊脂板上[34]。

1.2 紫菜腐霉侵染條斑紫菜葉狀體

1.2.1 紫菜腐霉孢子的誘導(dǎo) 紫菜腐霉孢子誘導(dǎo)方法參照Uppalapati和Addepalli[35-36]，0.5 g的菌絲加入到100 mL CaCl2濃度為10 mmol·L-1的半海水(海水與蒸餾水的體積比為1:1)中，15 ℃下120 r/min振蕩培養(yǎng)，期間每隔1 h換1次半海水培養(yǎng)基，進(jìn)行4～5次。15 h后用篩絹濾去菌絲得到孢子懸液，并在顯微鏡下對(duì)孢子濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 人工感染 紫菜葉片經(jīng)過(guò)0.7% 的KI溶液浸泡除菌10min后，用滅菌海水沖洗3次，置于裝有1L孢子懸液的錐形瓶中進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)(溫度15℃，其它實(shí)驗(yàn)條件與正常培養(yǎng)相同)。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組孢子濃度103ind·mL-1，對(duì)照組不加孢子。葉狀體密度為1g·L-1。每隔1d分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。每個(gè)處理組分別設(shè)置4個(gè)平行。記錄每個(gè)實(shí)驗(yàn)組發(fā)病葉片數(shù)和每一葉片的病斑面積。

1.3 病情指數(shù)和生理生化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 病情指數(shù)的測(cè)定 紫菜葉片病斑面積的計(jì)算：取不同感染時(shí)間(0、1、3、5、7、9 d)的葉片30個(gè)進(jìn)行數(shù)碼拍照，參照文獻(xiàn)[37]的方法計(jì)算病斑率：(1)將坐標(biāo)紙平鋪在白瓷盤上，作為拍照背景底板。(2)將待測(cè)葉片平展于坐標(biāo)上。(3)用適當(dāng)?shù)呐臄z分辨率、圖像存貯像素和拍攝角度對(duì)葉片進(jìn)行拍攝，拍攝結(jié)束后將圖片導(dǎo)入計(jì)算機(jī)。(4)在Photoshop圖像處理軟件中打開(kāi)葉片圖像，分別選取圖片中葉片部分及病斑區(qū)域，然后打開(kāi)菜單中“圖像”，選取“直方圖”選項(xiàng)，記錄顯示參數(shù)中的“像素”數(shù)值。(5)病斑率=病斑區(qū)域像素點(diǎn)數(shù)/葉片像素點(diǎn)數(shù)。

調(diào)查條斑紫菜赤腐病病情指數(shù)[38]。時(shí)以片為單位，根據(jù)每個(gè)葉片的病斑率進(jìn)行病情分級(jí)。0級(jí)為整個(gè)葉片完好或幾乎無(wú)病斑；1級(jí)為有少量病斑或病斑很小，病斑率≤20%；2級(jí)為葉片有較多病斑，病斑率≤40%；3級(jí)為病斑較多且病斑較大，病斑率≤60%；4級(jí)為葉片上有大量病斑，病斑率≤80%；5級(jí)為葉片上有大量病斑，僅剩基部或整片病爛，病斑率>80%。

病情指數(shù)的計(jì)算：

1.3.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 分別取0.1g的實(shí)驗(yàn)樣品用于以下指標(biāo)的測(cè)定。組織樣品的研磨破碎，用組織勻漿儀進(jìn)行(6 800r/min，2個(gè)鋼珠，勻漿30s)，然后加入不同緩沖液，分別離心，取上清液，用于后續(xù)各物質(zhì)含量及活性測(cè)定。

ROS含量的測(cè)定參考Contreras等[39]：使用2, 7-二氯熒光黃為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(0～10nmol)，單位ng/gFW。Pro含量的測(cè)定：采用茚三酮法[40]，單位μg/gFW。PAL活性測(cè)定：活性測(cè)定參照MiltonZaker的方法[41]，反應(yīng)混合液共 4mL，包括2mL200μmol/L提取緩沖液(pH=8.8，0.1mol/L)，1mL60μmol/LL-苯丙氨酸，1mL酶提取液。以不加酶液的為對(duì)照。30℃水浴20min，290nm處測(cè)吸光度A，以△A值改變 0.01為1個(gè)酶活單位。PPO活性測(cè)定∶活性測(cè)定基本參照王海河等[42]的方法，測(cè)定反應(yīng)體系含0.2mL酶液，2.8mL0.05mol/LPBS(pH=6.8)，1mL0.4mmol/L鄰苯二酚。28℃保溫10min，374nm處測(cè)吸光度A，以每min△A值改變0.01為一個(gè)酶活單位。比活單位為U/gFW(FW：鮮重，U：酶活力單位)。MDA含量測(cè)定：測(cè)定方法參考Heath等[43]硫代巴比妥酸(TBA)比色法，但根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行了修改[44]，以A532nm-1/2(A510nm-A560nm)的值來(lái)代表丙二醛與TBA反應(yīng)的吸光度值，單位nmol/gFW。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)的差值用Excel和SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用單因素方差分析(One-wayANOVA)和最小顯著差異法(LSD)分析不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 條斑紫菜赤腐病癥狀及病情表現(xiàn)

紫菜腐霉感染不同時(shí)間，條斑紫菜葉狀體的病情指數(shù)見(jiàn)表1。在感染前條斑紫菜葉狀體健康完整沒(méi)有病斑(見(jiàn)圖1A)，病情指數(shù)為0；感染第一天即出現(xiàn)病斑，但病斑面積較小，病級(jí)集中在0級(jí)和1級(jí)；隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，病斑率變大(見(jiàn)圖1A～F)，在第9天，發(fā)病最厲害，部分病爛程度達(dá)到5級(jí)(見(jiàn)圖1F)，甚至藻體顏色變?yōu)樽霞t色。顯微觀察可見(jiàn)，條斑紫菜葉狀體被紫菜腐霉菌絲穿透，細(xì)胞變形(見(jiàn)圖1G)，菌絲穿透的細(xì)胞膜被破壞，藻紅素溶出(見(jiàn)圖1H)。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)被破壞，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡(見(jiàn)圖1I)，死亡細(xì)胞脫落形成葉狀體上的空洞。

表1 不同感染時(shí)間各級(jí)病葉數(shù)及其病情指數(shù)

(A～F. 0～5級(jí)病爛的紫菜葉片；G. 紫菜細(xì)胞被穿透變形；H. 細(xì)胞被菌絲穿透，藻紅蛋白融出(箭頭所示)；I. 菌絲穿透的細(xì)胞大部分死亡。A～F. From 0 to 5 grade of the rot thallus; G. Distorted thallus cells, penetrated by hypha; H. Pigments of phycoerythrin released (arrow); I. Most of cells were death.)

圖1 紫菜腐霉感染后的病斑及顯微照片
Fig.1 The observation of the thallus infected byP.porphyrae

2.2 紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜葉狀體ROS與Pro含量的影響

當(dāng)條斑紫菜葉狀體受到紫菜腐霉侵染時(shí)，總體來(lái)看ROS含量變化量表現(xiàn)為極顯著上升(P<0.01)(見(jiàn)圖2)。第1天即表現(xiàn)出顯著變化，在第3、5天時(shí)變化不顯著，在第7、9天出現(xiàn)極顯著上升(P<0.01)。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，感染葉狀體持續(xù)積累大量ROS，增加幅度越大。感染第9天ROS含量最高，達(dá)到第1天的2.43倍。

圖2 紫菜腐霉感染對(duì)條斑紫菜葉狀體ROS含量的影響

在紫菜腐霉侵染條件下，條斑紫菜葉狀體中Pro含量第1天時(shí)變量上升不顯著(見(jiàn)圖3)，在第3天變化量出現(xiàn)極顯著(P<0.01)上升，第5、7天時(shí)上升不顯著，第9天出現(xiàn)極顯著上升，并且含量達(dá)到最高值，是第1天的7.43倍。

圖3 紫菜腐霉感染對(duì)條斑紫菜葉狀體Pro含量的影響

2.3 紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜保護(hù)性酶類PAL與PPO活性的影響

紫菜腐霉侵染條件下，條斑紫菜葉狀體PAL活性變化量表現(xiàn)為極顯著提高(P<0.01)(見(jiàn)圖4)。在第1天時(shí)有極顯著增加，第3、5天時(shí)變化不顯著，第7、9天時(shí)有顯著增加。且隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，提高幅度越大，在1～7d的活性提高較慢，表現(xiàn)為緩慢上升，第9天時(shí)活性急劇上升，并在第9天酶活性達(dá)到最高值，酶活性達(dá)到19.67 U/g FW。

圖4 紫菜腐霉感染對(duì)條斑紫菜葉狀體PAL活性的影響

在紫菜腐霉感染條件下，條斑紫菜葉狀體PPO活性變化表現(xiàn)為極顯著升高(P<0.01)(見(jiàn)圖5)。在第1天時(shí)有極顯著增加，第3、5天是增加不顯著。第7、9天時(shí)有極顯著增加。且在感染初期，酶活性變化較緩慢，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，活性逐漸增加，在第9天達(dá)到最高值，其峰值為35.10U/g FW。

圖5 紫菜腐霉感染對(duì)條斑紫菜葉狀體PPO活性的影響

2.4 紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜葉狀體MDA含量的影響

總體來(lái)看，MDA含量變化量隨感染時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)極顯著(P<0.01)增加的趨勢(shì)。見(jiàn)圖6，在感染第1天，條斑紫菜葉狀體MDA含量變化表現(xiàn)為極顯著上升(P<0.01)，第3、5天時(shí)變化不顯著，在感染第7天時(shí)達(dá)到最大值，隨后第9天MDA含量又開(kāi)始極顯著下降(P<0.01)。

圖6 紫菜腐霉感染對(duì)條斑紫菜葉狀體MDA含量的影響

3 討論

3.1 紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜脯氨酸的影響

Pro在植物體內(nèi)是一種重要的滲透調(diào)節(jié)有機(jī)物質(zhì)。正常狀態(tài)下Pro含量低，但當(dāng)受到逆境脅迫(干旱、高溫、光強(qiáng)、病原菌)時(shí)，其含量可迅速增多，通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓保持細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡，或與其他化合物形成親水聚合物，以保持膜系統(tǒng)的完整性，使其免受外界因子的傷害[45]。另外研究表明，外源脯氨酸具有清除活性氧自由基的作用[46]。隨著細(xì)胞中ROS含量的持續(xù)積累，膜系統(tǒng)嚴(yán)重受損，細(xì)胞中的滲透壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)和防御酶系也迅速響應(yīng)。本研究中，隨著紫菜腐霉感染時(shí)間的延長(zhǎng)，條斑紫菜葉狀體中Pro含量顯著上升(見(jiàn)圖3)，不斷調(diào)節(jié)滲透壓保持細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡，以保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)完整，這與感染前期MDA含量的變化趨勢(shì)一致，均表現(xiàn)為迅速上升。在感染后期，MDA含量降低。但Pro含量仍持續(xù)上升，可能是由于細(xì)胞膜的其他損傷導(dǎo)致Pro含量持續(xù)上升。這與歐秀玲等關(guān)于棉花黃萎病病原菌引起的轉(zhuǎn)基因抗病棉花游離脯氨酸含量升高，而感病品種Pro相對(duì)較低與結(jié)果相一致[47]。

3.2 紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜保護(hù)性酶類的影響

隨著細(xì)胞中ROS含量不斷積累，其作為第二信使可以激發(fā)植物調(diào)控防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[48]。苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，在高等植物中苯丙烷類代謝途徑中可以產(chǎn)生植保素、木質(zhì)素、酚類化合物等次生產(chǎn)物。植保素是一種低分子量抗微生物化合物；木質(zhì)素可以使細(xì)胞壁木栓化，阻止病原菌的侵染和發(fā)生[49]。大量研究表明，多酚氧化酶(PPO)是植物體內(nèi)普遍存在的末端氧化酶，可以通過(guò)參與次生代謝，將酚類物質(zhì)氧化成毒性更強(qiáng)的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)聚合成痂，形成病斑封閉感染組織，阻止病原菌的擴(kuò)散[50]。本研究中，條斑紫菜葉狀體中PAL和PPO活性在紫菜腐霉感染初期增加不明顯，與ROS的增加趨勢(shì)一致；在感染后期，隨著ROS大幅度升高，PAL和PPO活性也大幅度提高。對(duì)照感染過(guò)程的病情指數(shù)，可以看出，在感染初期，病原菌的侵染只局限在病斑周圍，(見(jiàn)圖1A～E)，這時(shí)候的ROS含量增長(zhǎng)較少，對(duì)PAL和PPO這兩種酶活性的刺激有限，在感染后期，紫菜腐霉的侵染遍及整個(gè)藻體，藻體不但出現(xiàn)病斑還表現(xiàn)為藻體顏色變成紫紅色(見(jiàn)圖1F)，此時(shí)瞬間爆發(fā)的大量ROS 徹底激活PAL和PPO活性，PAL和PPO活性表現(xiàn)為大幅度上升。這種先緩慢上升然后急劇上升的趨勢(shì)與水稻感染稻瘟病[51]、玉米感染大、小斑病[52]的研究結(jié)果一致，故認(rèn)為PAL、PPO活性可以作為條斑紫菜應(yīng)對(duì)紫菜腐霉侵染的一種生理指標(biāo)。

3.3 紫菜腐霉侵染對(duì)條斑紫菜膜系統(tǒng)的影響

正常狀態(tài)下，植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)植物遭受病原菌侵染時(shí)，平衡狀態(tài)被打破，導(dǎo)致ROS的積累[53]。在高等植物的免疫系統(tǒng)中，宿主識(shí)別外界入侵者的第一反應(yīng)是產(chǎn)生并積累ROS。一方面ROS因其強(qiáng)氧化活性可以對(duì)病原菌產(chǎn)生毒害作用，直接殺死病原菌[54]；另一方面可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)植保素的合成，而植保素可產(chǎn)生對(duì)病原菌的拮抗作用[55]。另外，ROS還可以作為第二信使激發(fā)植物調(diào)控防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[56-57]。但是，瞬間大量的ROS積累會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)ROS產(chǎn)生和清除系統(tǒng)失去平衡，積累的ROS對(duì)細(xì)胞膜有強(qiáng)氧化性，會(huì)導(dǎo)致膜系統(tǒng)的損傷[58]。MDA作為植物膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物之一，可與細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)引起膜系統(tǒng)的損傷，其含量是衡量細(xì)胞膜脂損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)[59]。膜脂過(guò)氧化的加劇，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，因此MDA含量與植物的抗病性有負(fù)相關(guān)關(guān)系[60]。本研究中，條斑紫菜葉狀體應(yīng)對(duì)紫菜腐霉侵染的第一反應(yīng)是瞬間產(chǎn)生大量的ROS，含量極顯著上升(見(jiàn)圖2)，結(jié)果與Küpper等[61]關(guān)于褐藻酸降解物引起海帶孢子體的氧爆發(fā)結(jié)果一致。在紫菜腐霉侵染的1～7 d，隨著ROS含量上升，MDA含量也顯著上升，與二者的趨勢(shì)一致(見(jiàn)圖6)，也與Radwan等[62]在ZYMV病毒侵染南瓜時(shí)，MDA和ROS顯著增加的結(jié)果一致。本研究表明藻類應(yīng)對(duì)病原侵染的生理與生化反應(yīng)機(jī)制很可能與高等植物存在廣泛的一致性。

4 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：紫菜腐霉感染引起條斑紫菜葉狀體防御物質(zhì)、保護(hù)酶類、防御信號(hào)和細(xì)胞損傷指示物質(zhì)的改變，表現(xiàn)為ROS、Pro、PAL、PPO極顯著上升，MDA先上升后下降?；钚匝鮎OS含量上升表明，紫菜腐霉的侵染打破了活性氧的產(chǎn)生和消除平衡，導(dǎo)致活性氧ROS積累，打破細(xì)胞膜滲透壓平衡，表現(xiàn)為Pro含量極其顯著增加(P<0.01)。細(xì)胞膜滲透壓平衡受到破壞，導(dǎo)致Pro含量迅速增多，以保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)； PAL和PPO是重要的保護(hù)酶，二者含量的增多，說(shuō)明病原菌侵染導(dǎo)致條斑紫菜組織啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)，通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑制病原菌侵染。隨著ROS積累量不斷增加，細(xì)胞膜受到破壞，膜脂過(guò)氧化程度加深，MDA含量增多。ROS積累引起細(xì)胞損傷的濃度還需要進(jìn)一步研究。本研究提供了條斑紫菜受紫菜腐霉感染后ROS、Pro MDA含量變化，以及PAL、PPO活性變化，為建立條斑紫菜抗赤腐病評(píng)價(jià)體系及篩選抗病品系提供了重要數(shù)據(jù)。

[1] Behura S, Sahoo S, Srivastava V K.Porphyra: the economic seaweed as a new experimental system[J]. Curr Sci, 2002, 83(11): 1313-1316.

[2] 曾呈奎, 王素娟, 劉思儉, 等. 海藻栽培學(xué)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1985: 204-206.

[3] Klochkova T A, Shim J B, Hwang M S, et al. Host-parasite interactions and host species susceptibility of the marine oomycete parasite,Olpidiopsissp., from Korea that infects red algae[J]. J Appl Phycol, 2012, 24(1): 135-144.

[4] Kim G H, Moon K H, Kim J Y, et al. A revaluation of algal diseases inKoreanpyropia(Porphyra) sea farms and their economic impact[J]. Algae, 2014, 29(4): 249-265.

[5] 周寶利, 高艷新. 嫁接茄子抗病性與電導(dǎo)率、脯氨酸含量及苯丙氨酸解氨酶活性的關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報(bào), 1998, 25(3): 300-302.

[6] 楊家書, 吳畏, 吳友三, 等. 植物苯丙酸類代謝與小麥對(duì)白粉病抗性的關(guān)系[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 1986, 16(3): 169-173.

[7] Friend J, Reynolds S B, Aveyard M A. Phenylalanine ammonia lyase, chlorogenic acid and lignin in potato tuber tissue inoculated withPhytophthorainfestans[J]. Physiol Plant Pathol, 1973, 3(4): 495-507.

[8] Nürnberger T, Brunner F, Kemmerling B, et al. Innate immunity in plants and animals: striking similarities and obvious differences[J]. Immunol Rev, 2004, 198(1): 249-266.

[9] Delledonne M, Zeier J, Marocco A, et al. Signal interactions between nitric oxide and reactive oxygen intermediates in the plant hypersensitive disease resistance response[J]. P Nati Acad Sci, 2001, 98(23): 13454-13459.

[10] Torres M A, Dangl J L. Functions of the respiratory burst oxidase in biotic interactions, abiotic stress and development[J]. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8(4): 397-403.

[11] Grant J J, Loake G J. Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling in disease resistance[J]. Plant Physiol, 2000, 124(1): 21-30.

[12] Doke N, Ohashi Y. Involvement of O2-generation system in the induction of necrotic lesions on tobacco leaves infected with TMV[J]. Physiol Mol Plant P, 1988, 32(1): 163-175.

[13] Sekizawa Y, Haga M, Hirabayashi E, et al. Dynamic behavior of superoxide generation in rice leaf tissue infected with blast fungus and its regulation by some substances (Pesticide Chemistry)[J]. Agr Biol Chem Tokyo, 1987, 51(3): 763-770.

[14] Radwan D E M, Fayez K A, Mahmoud S Y, et al. Salicylic acid alleviates growth inhibition and oxidative stress caused by zucchini yellow mosaic virus infection inCucurbitapepoleaves[J]. Physiol Mol Plant P, 2006, 69(4): 172-181.

[15] Saha M, Rempt M, Gebser B, et al. Dimethylsulphopropionate (DMSP) and proline from the surface of the brown algaFucusvesiculosusinhibit bacterial attachment[J]. Biofouling, 2012, 28(6): 593-604.

[16] Bouarab K, Adas F, Gaquerel E, et al. The innate immunity of a marine red alga involves oxylipins from both the eicosanoid and octadecanoid pathways[J]. Plant Physiol, 2004, 135(3): 1838-1848.

[17] 王麗麗, 唐學(xué)璽, 王蒙, 等. 海帶病爛發(fā)生過(guò)程中的生理生化變化研究(Ⅱ)——PAL, PPO 和多酚的變化[J]. 海洋科學(xué)進(jìn)展, 2004, 22(1): 73-76.

[18] Weinberger F, Friedlander M, Hoppe H G. Oligoagars elicit a physiological response inGracilariaconferta(Rhodophyta)[J]. J Phycol, 1999, 35(4): 747-755.

[19] Weinberger F, Leonardi P, Miravalles A, et al. Dissection of two distinct defense-related responses to agar oligosaccharides inGracilariachilensis(Rhodophyta) andGracilariaconferta(Rhodophyta)[J]. J Phycol, 2005, 41(4): 863-873.

[20] 彭金良, 嚴(yán)國(guó)安. α-萘酚脅迫對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版), 2001, 47(4): 449-452.

[21] Arasaki S. Studies on the rot ofPorphyrateneraby a Pythium[J]. Bull Jpn Soc Sci Fish, 1947, 13(3): 74-90.

[22] Arasaki S, Akino K, Tomiyama T. A comparison of some physiological aspects in marine pythium on the host and on the artificial medium[J]. Bull Misaki Mar Biol Inst Kyoto Univ, 1968, 12: 203-206.

[23] Takahashi M. Identification of genus pythium[J]. Plant Prot, 1970, 24(8): 339-346.

[24] 馬家海. 條斑紫菜赤腐病的初步研究[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 5(1): 1-7.

[25] Correa J A. Infectious diseases of marine algae: current knowledge and approaches[J]. Prog Phycolo Res, 1997, 12: 149-180.

[26] 劉一萌, 馬家海, 文茜. 壇紫菜赤腐病與擬油壺菌病并發(fā)病的初步研究[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 27(6): 546-550.

[27] 丁懷宇. 紫菜腐霉侵染條斑紫菜葉狀體過(guò)程研究[J]. 淮陰師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 5(1): 69-73.

[28] Uppalapati S R, Kerwin J L, Fujita Y. Epifluorescence and scanning electron microcopy of host-pathogen interactions betweenPythiumporphyrae(Peronosporales Oomycota) andPorphyrayezoensis(Bangiales, Rhodophyta)[J]. Bot Mar, 2001, 44(2): 139-145.

[29] Park C S, Kakinuma M, Amano H. Forecasting infections of the red rot disease onPorphyrayezoensisUeda (Rhodophyta) cultivation farms[J]. J Appl Phycol, 2006, 18(3-5): 295-299.

[30] Schroeder K L, Martin F N, de Cock A W A M, et al. Molecular detection and quantification ofPythiumspecies: evolving taxonomy, new tools, and challenges[J]. Plant Dis, 2013, 97(1): 4-20.

[31] Uppalapati S R, Fujita Y. The relative resistances ofPorphyraspecies (Bangiales, Rhodophyta) to infection byPythiumporphyrae(Peronosporales, Oomycota)[J]. Bot Mar, 2001, 44(1): 1-7.

[32] Park C S, Hwang E K. Isolation and evaluation of a strain ofPyropiayezoensis(Bangiales, Rhodophyta) resistant to red rot disease[J]. J Appl Phycol, 2014, 26(2): 811-817.

[33] West J A, McBride D L. Long-term and diurnal carpospore discharge patterns in the Ceramiaceae, Rhodomelaceae and Delesseriaceae (Rhodophyta)[J]. Hydrobiologia, 1999, 398: 101-114.

[34] Park C S, Sakaguchik E, Kakinuma M A, et al. Comparison of the morphological and physiological features of the red rot disease fungusPythiumsp. isolated fromPorphyrayezoensisfrom Korea and Japan[J]. Fisheries Sci, 2000, 66(2): 261-269.

[35] Uppalapati S R, Fujita Y. Carbohydrate regulation of attachment, encystment, and appressorium formation byPythiumporphyrae(Oomycota) zoospores onPorphyrayezoensis(Rhodophyta)[J]. J Phycol, 2000, 36(2): 359-366.

[36] Addepalli M K, Fujita Y. Regulatory role of external calcium onPythiumporphyrae(Oomycota) zoospore release, development and infection in causing red rot disease ofPorphyrayezoensis(Rhodophyta)[J]. FEMS microbial Lett, 2002, 211(2): 253-257.

[37] Chen J M, Black T A, Adams R S. Evaluation of hemispherical photography for determining plant area index and geometry of a forest stand[J]. Agr Forest Meteorol, 1991, 56(1): 129-143.

[38] 李社增, 馬平, C H H, 等. 相對(duì)病情指數(shù)劃分棉花品種抗病性的統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)[J]. 棉花學(xué)報(bào), 2003, 15(6): 344-347.

[39] Contreras L, Moenne A, Correa J A. Antioxidant responses inScytosiphonlomentaria(Phaeophyceae) inhabiting copper enriched coastal environments[J]. J Phycol, 2005, 41(6), 1184-1195.

[40] Milton Z. Induction of phenylalanine deaminase by light and its relation to chlorogenic acid synthesis in potato tuber tissue[J]. Plant Physiol, 1965, 40(5): 779-784.

[41] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京: 高等教育出版社. 2000: 161-169.

[42] 王海河, 林奇英, 謝聯(lián)輝, 等. 黃瓜花葉病毒三個(gè)毒株對(duì)煙草細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)及細(xì)胞膜通透性的影響[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2001, 31(1): 43-49.

[43] Heath R L, Packer L. Photoperoxidation in isolation chloroplast kinetics and stoichimetry of fatty acid peroxidation[J]. Arch Biochem Biophys, 1968, 125(1): 189-198.

[44] 周巍巍, 謝潮添, 陳昌生, 等. 低氮, 磷脅迫對(duì)壇紫菜葉狀體生理生化特征的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(4): 543-550.

[45] 湯章城. 逆境條件下植物脯氨酸的累積及其可能的意義[J]. 植物生理學(xué)通訊, 1984, 1: 15-21.

[46] Voetberg G S, Sharp R E. Growth of the maize primary root at low water potentials III. Role of increased proline deposition in osmotic adjustment[J]. Plant Physiol, 1991, 96(4): 1125-1130.

[47] 歐秀玲, 耿雅文, 李鳳, 等. 棉花黃萎病病原菌誘導(dǎo)侵染對(duì)轉(zhuǎn)基因抗病棉花生理性狀的影響[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2013, 6: 94-98.

[48] Apostol I, Heinstein P. F, Low P. S. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells[J]. Plant Physiol, 1989, 90(1): 109-116.

[49] 馮潔, 陳其煐. 棉株體內(nèi)幾種生化物質(zhì)與抗枯萎病之間關(guān)系的初步研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 1991, 21(4): 291-29.

[50] Moerschbacher B M, Noll U, Ocampo C A, et al. Hypersensitive lignification response as the mechanism of non-host resistance of wheat against oat crown rust[J]. Physiol Plant, 1990, 78(4): 609-615.

[51] 歐陽(yáng)光察, 應(yīng)初衍, 朱明華, 等. 稻瘟病菌孢子和毒素對(duì)水稻抗病性的誘導(dǎo)與苯丙烷類代謝途徑的關(guān)系[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 1987, 13(4): 40-42.

[52] 王敬文, 薛應(yīng)龍. 植物苯丙氨酸解氨酶的研究. Ⅲ. 玉米小斑病菌HelminthosporiummaydisT.h小種和大斑病菌Helninthospiriumtureium毒素對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)的刺激作用[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 1982, 8(3): 237-243.

[53] Wu G, Shortt B J, Lawrence E B. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato[J]. Plant Cell, 1995, 7(9): 1357-1368.

[54] 李合生. 現(xiàn)代植物生理學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2002: 4l5-419.

[55] Peng M, Kuc J. Peroxidase-generated hydrogen peroxide as a source of antifungal activity in vitro and on tobacco leaf discs[J]. Phytopathology, 1992, 82(6): 696-703.

[56] 林忠平. 植物對(duì)病害的防御系統(tǒng)[J]. 植物學(xué)通報(bào), 1993, 10(3): 1-3.

[57] Foyer C H, Descourvieres P, Kunert K J. Protection against oxygen radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants[J]. Plant Cell Environ, 1994, 17(5): 507-523.

[58] Shao H B, Jiang S Y, Li F M, et al. Some advances in plant stress physiology and their implications in the systems biology era[J]. Colloid Surface B, 2007, 54(1): 33-36.

[59] 余叔文, 湯章城. 植物生理與分子生物學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1998, 770-783.

[60] 李俊蘭, 李妙, 翟學(xué)軍, 等. 棉花感染黃萎病后葉片組分內(nèi)生化特性分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 1995, 10: 134-138.

[61] Küpper F C, Kloareg B, Guern J, et al. Oligoguluronates elicit an oxidative burst in the brown algal kelpLaminariadigitata[J]. physiol. Plant, 2001, 125(1): 278-291.

[62] Radwan D E M, Fayez K A, Mahmoud S Y, et al. Salicylic acid alleviates growth inhibition and oxidative stress caused by zucchini yellow mosaic virus infection inCucurbitapepoleaves[J]. Physiol Mol Plant P, 2006, 69(4): 172-181.

責(zé)任編輯 高 蓓

The Variation of Defensive Compounds Content and Protective Enzymes Activity of
PyropiayezoensisGametophyte Infected by OomycetePythiumporphyrae

ZHANG Xiao-Nan1,2, SUN Pei-Pei1,2, MAO Yun-Xiang1,2, ZOU Dan-Dan1,2,
TANG Xiang-Hai1,2, MO Zhao-Lan3

(1.The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3. Yellow Sea Fisheries Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

In this study, the content of defensive compounds (ROS, Pro), the activity of the protective enzymes (PAL, PPO) and MDA inPyropiayezoensisgametophyte during the course of infection byPythiumporphyraeat different times (0, 1, 3, 5, 7, 9 days) were measured. The result indicated that the infection ofPyt.Porphyraecould break the dynamic balance of ROS in cells that leads to its significant increase(P<0.01), and the osmotic balance was broken. Pro content was raised markedly(P<0.01), and the activity of protective enzymes such as PAL, PPO was found to be enhanced appreciably(P<0.01), as a result the cells membrane was damaged, and MDA content was changed. Based on these data, we inferred an outline that defensive compounds and protective enzymes ofPyr.yeozensisrespond toPyt.porphyraeinfection as follows: the content of ROS in cells ofPyr.yeozensiswould increase while induced by the infection of the pathogen. When the host cells received much ROS, the content of Pro was increased and the activity of PAL and PPO was enhanced indicating that the defensive system and the activity of the protective enzymes were activated. At last the cell membrane of the host were damaged by the excess ROS, leading to the lipid peroxidation of the cells membrane and high MDA levels. The results provided the fundamental data for understanding the mechanism of red rot disease resistance inP.yezoensis.

Pyropiayezoensis;Pythiumporphyrae; infection;defensive compounds; protective enzymes; malondialdehyde

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372517)；國(guó)家高技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A406)；山東省自主創(chuàng)新專項(xiàng)(2013CXC80202)；國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)—水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)項(xiàng)目資助

2014-12-31；

2015-03-26

張曉南(1989-)，女，碩士生。E-mail:zhangxiaonan1215@163.com

??通訊作者： E-mail: yxmao@ouc.edu.cn

Q946.5

A

1672-5174(2015)12-057-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20140442