齊墩果酸抗矽肺大鼠TNF-α和膠原表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

彭海兵，王建行，劉　燕，張　娜，田景瑞，肖永紅(華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山　06000)

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齊墩果酸抗矽肺大鼠TNF-α和膠原表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

彭海兵1△，王建行1，劉燕2，張娜2，田景瑞2，肖永紅3
(華北理工大學(xué)1冀唐學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063000)

［摘要］目的:觀察齊墩果酸對(duì)矽肺大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)和膠原表達(dá)的影響及其可能作用機(jī)制。方法: 80只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、齊墩果酸組和溶劑組，每組20只。除對(duì)照組外，其余組大鼠采用非暴露法氣管內(nèi)一次性注入SiO2懸液(250 mg/kg)復(fù)制動(dòng)物矽肺模型。齊墩果酸組自注射SiO2后每天給予齊墩果酸60 mg/kg灌胃，溶劑組每天用0.6%羧甲基纖維素鈉溶液(10 mL/kg)灌胃，對(duì)照組用生理鹽水(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)56 d。動(dòng)物分別在注射SiO2后第7、14、28和56天處死(每次每組5只)。處死后檢測(cè)各組大鼠肺系數(shù)，并觀察形態(tài)學(xué)變化;應(yīng)用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α的含量;試劑盒檢測(cè)肺組織中總膠原蛋白含量;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織核因子κB(NF-κB)表達(dá)。結(jié)果: (1)與對(duì)照組比較，模型組和溶劑組大鼠肺系數(shù)和總膠原蛋白含量明顯升高，結(jié)合形態(tài)學(xué)變化，矽肺模型造模成功。齊墩果酸組各時(shí)點(diǎn)肺系數(shù)和總膠原蛋白含量比模型組和溶劑組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)低，但比對(duì)照組高。(2)模型組和溶劑組大鼠血清中的TNF-α含量各時(shí)點(diǎn)明顯升高，高峰在第14天，之后稍降，但明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;模型組與溶劑組各時(shí)點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。齊墩果酸組TNF-α含量與模型組相比均降低，各時(shí)點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)模型組和溶劑組大鼠肺組織中NF-κB表達(dá)量逐漸升高，至第28天達(dá)高峰，各時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。齊墩果酸組的NF-κB陽性表達(dá)趨勢(shì)與模型組相同，但明顯低于模型組而高于對(duì)照組，各時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:齊墩果酸通過抑制TNF-α和膠原表達(dá)減緩矽肺纖維化的發(fā)生，可能與NF-κB通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］齊墩果酸;矽肺;腫瘤壞死因子α;膠原;核因子κB

［修回日期］2015-03-12

Effect of oleanolic acid on expression of TNF-α and collagen in silicotic rats in vivo

PENG Hai-bing1，WANG Jian-xing1，LIU Yan2，ZHANG Na2，TIAN Jing-rui2，XIAO Yong-hong3
(1Jitang College，2College of Basic Medical Sciences，3School of Public Health，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China.E-mail: leizi19760728@ sina.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe the effect of oleanolic acid (OA) on the expression of Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and collagen in silicotic rats in vivo and its possible mechanism.METHODS: Male Wistar rats were divided into 4 groups according to the randomized block design: control group，model group，OA group and solvent control group (20 rats in each group).Except control group，the rats in other groups were induced by intratracheal instillation of silicon dioxide (SiO2; 250 mg/kg).The rats in OA group were intragastrically administered with OA (60 mg/kg) from the second day of giving SiO2.The rats in solvent control group were gavaged daily with 0.6% sodium carboxymethyl cellulose solution (10 mL/kg).The rats in control group were given normal saline under the same condition for 56 consecutive days.All rats were killed at the 7th，14th，28th and 56th days.The lung coefficient was detected and the morphological changes were observed.The serum contents of TNF-α were detected by ELISA.The content of total collagen in the lung tissue was measured.The protein level of nuclear factor-κB (NF-κB) in the lung tissue was determined by immunohistochemical method.RESULTS: (1) According to the morphological changes，the silicosis model was successfully established.Compared with control group，the lung coefficient and total collagen increased obviously in model group and solvent control group.The lung coefficient and total collagen content in OA group at each time point reduced compared with those in model group and sol-vent group，and increased compared with those in control group at the corresponding time points.(2) The serum contents of TNF-α in model group and solvent control group significantly increased，peaking at the 14th day，slightly decreasing afterward，and showing statistically significant difference at each time point compared with those in control group.No significant difference between model group and solvent group at different time points was observed.OA had inhibitory effect on the contents of TNF-α compared with model group and solvent group at the corresponding time points.(3) NF-κB in model group and solvent control group significantly increased，peaking at the 28th day，and showing statistically significant difference at each time point compared with those in control group.The NF-κB expression in OA group was similar to model group，but significantly decreased compared with control group at each time point.CONCLUSION: OA inhibits the expression of TNF-α and collagen and attenuates the silicosis fibrosis，which may be related to the NF-κB pathway.

［KEY WORDS］Oleanolic acid; Silicosis; Tumor necrosis factor-α; Collagen; Nuclear factor-κB

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是一種齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于食物、醫(yī)學(xué)草本植物和其它植物中，以皂苷或游離形式出現(xiàn)，具有保肝解毒、調(diào)節(jié)糖脂、抗炎、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗突變、抗癌多種生物活性［1］，是一種具有開發(fā)潛力的植物先導(dǎo)化合物。矽肺病是全球分布范圍最廣、患病人數(shù)最多、不能治愈但完全可以預(yù)防和控制的職業(yè)病。有研究顯示［2］，OA具有抑制小鼠肝纖維化的作用，但在防治矽肺方面的研究國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用二氧化硅(SiO2)誘導(dǎo)大鼠建立矽肺模型，觀察OA對(duì)矽肺纖維化過程中早期炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)以及膠原表達(dá)的影響，探討OA拮抗矽肺的作用及其機(jī)制，為矽肺患者的臨床預(yù)防及治療提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠80只，體重190～210 g，合格證號(hào)為SCXK-(軍) 2009-003，經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［設(shè)施許可證編號(hào)SYXK(冀) 2010-0038］飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，溫度(22±2)℃，濕度70%～80%，晝夜交替。OA購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110742-200513，純度99.9%，臨用時(shí)將其溶于0.6%羧甲基纖維素鈉配成混懸液; SiO2粉塵購自中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所(95%以上顆粒直徑＜5 μm，游離SiO2＞97%)，180℃恒溫下烘烤6 h，用滅菌生理鹽水配成濃度為50 g/L粉塵懸液，高壓滅菌，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆? ELISA試劑盒和Masson染液試劑盒購自南京建成生物工程研究所;羥脯氨酸試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司;兔抗大鼠NF-κB抗體及羊抗兔IgG購自Santa Cruz。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組造模與標(biāo)本制備大鼠稱重，編號(hào)，隨機(jī)分為4組，即對(duì)照(control)組、模型(model，M)組、OA組和溶劑(solvent，S)組，每組20只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除對(duì)照組外，其余組大鼠采用非暴露法氣管內(nèi)一次性注入SiO2懸液(250 mg/kg)復(fù)制動(dòng)物矽肺模型。OA組自注射SiO2后每天灌胃齊墩果酸60 mg/kg，溶劑組每天灌胃0.6%羧甲基纖維素鈉溶液(10 mL/kg)，對(duì)照組灌胃生理鹽水(10 mL/kg)，連續(xù)56天。以上動(dòng)物分別在注射SiO2后第7、14、28、56天處死(每次每組5只)。各組大鼠在處死前禁食12 h，稱量體重，腹主動(dòng)脈取血，常規(guī)制備血清;肉眼觀察雙肺，稱量肺臟重量，計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)=肺濕重(mg)/體重(g) ;取右肺下葉組織做HE染色和Masson染色，左肺組織用于羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)測(cè)定，右肺上葉組織用于免疫組化檢測(cè)。

2.2 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α的含量嚴(yán)格按照試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行反應(yīng)，將抗大鼠TNF-α的單抗包被于酶標(biāo)板上，加入標(biāo)準(zhǔn)品與之結(jié)合，再加入生物素化監(jiān)測(cè)抗體，形成“抗體-TNF-α-抗體”復(fù)合物，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合。加入顯色劑后，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm吸光度(A)值，TNF-α濃度與A450值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中TNF-α濃度。

2.3 HYP試劑盒檢測(cè)肺組織中總膠原蛋白含量實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行。HYP(mg/g)=(測(cè)定管吸光度值－空白管吸光度值)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值－空白管吸光度值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×(水解液總體積/組織濕重)?？偰z原蛋白的含量(mg/g)以膠原蛋白中羥脯氨酸的質(zhì)量百分濃度為13%進(jìn)行計(jì)算。

2.4免疫組化法檢測(cè)肺組織NF-κB的表達(dá)水平應(yīng)用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP法)檢測(cè)肺組織NF-κB表達(dá)，方法步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行(NF-κB I抗以PBS緩沖液稀釋為1∶100作為工作液)，用PBS緩沖液代替I抗作陰性對(duì)照。具體操作如下: 4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟水化; 3% H2O2，去除內(nèi)源性過氧化物酶;正常血清封閉，加I抗4℃過夜;次日滴加生物素標(biāo)記II抗和鏈霉親和素過氧化物酶，DAB顯色;蘇木精復(fù)染，透明，封固。將染色后的組化切片用掃描儀進(jìn)行掃描，經(jīng)北京航空航天大學(xué)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和半定量分析，每張玻片隨機(jī)選取6個(gè)視野，取其平均吸光度值為量化指標(biāo)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1各組大鼠肺臟形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)照組大鼠雙肺呈淡粉色，表面光滑，各個(gè)時(shí)點(diǎn)無明顯異常改變。模型組和溶劑組大鼠第7天時(shí)可見肺表面充血、體積稍大，重量增加;第14天時(shí)有散在的點(diǎn)狀、灶狀出血，肺臟增大、增重，質(zhì)稍硬，肺表面及切面可見大量粟粒大小的灰白色結(jié)節(jié);第28天時(shí)雙肺蒼白，體積縮小，硬度增加，表面結(jié)節(jié)樣改變; 第56天時(shí)結(jié)節(jié)凸出于肺表面，并有融合病灶，質(zhì)地較硬。OA組大鼠第14天時(shí)肺呈淡粉色，偶見點(diǎn)狀出血，可見散在粟粒大小結(jié)節(jié)病灶;第28天時(shí)仍可見雙肺散在分布粟粒大小的灰白色結(jié)節(jié)，質(zhì)稍硬，未凸出肺表面;第56天時(shí)局部散在小結(jié)節(jié)，無硬化和實(shí)變。右肺下葉組織HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察符合實(shí)驗(yàn)性矽肺King五級(jí)分類法:模型組和溶劑組大鼠第7天時(shí)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔和肺間質(zhì)可見炎性細(xì)胞灶;第14天時(shí)仍有大量炎性細(xì)胞，肺泡間隔增寬增厚，少量散在的細(xì)胞性結(jié)節(jié);第28天時(shí)彌漫性膠原纖維增多，可見較多細(xì)胞性結(jié)節(jié)和少量的纖維性結(jié)節(jié)，以I+級(jí)結(jié)節(jié)為主，第56天時(shí)纖維性結(jié)節(jié)互相融合，以III級(jí)結(jié)節(jié)為主，表明造模成功;齊墩果酸組大鼠第28天和第56天均以I級(jí)細(xì)胞性結(jié)節(jié)為主。Masson染色結(jié)果顯示:膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維、胞質(zhì)、紅細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。對(duì)照組大鼠支氣管周圍及肺泡間隔區(qū)有少量藍(lán)色的膠原纖維分布。模型組和溶劑組大鼠第28天時(shí)膠原纖維明顯增加，肺泡間隔增厚，結(jié)節(jié)內(nèi)膠原纖維不規(guī)則排列;第56天時(shí)可見膠原沉積更加致密，且結(jié)節(jié)內(nèi)數(shù)量不等的膠原纖維呈同心圓排列，纖維化程度加重。OA組大鼠肺組織膠原沉積明顯減少，呈小片狀或小束狀，改善情況顯著，見圖1。

Figure 1.The morphological observation of lung tissus with HE staining and Masson staining.Scale bar=100 μm.圖1各組大鼠肺組織的HE染色和Masson染色觀察

2各組大鼠肺系數(shù)變化結(jié)果

由表1可見，各時(shí)點(diǎn)模型組大鼠肺系數(shù)與溶劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ; OA組肺系數(shù)比模型組和溶劑組低，比對(duì)照組高(P＜0.05)。

表1　矽肺大鼠肺系數(shù)的變化Table 1.Coefficient of lung in silicosis rats (mg/g.Mean±SD.n=5)

3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α的變化情況

對(duì)照組大鼠血清中的TNF-α含量在各時(shí)點(diǎn)表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。模型組和溶劑組大鼠血清中的TNF-α含量在各時(shí)點(diǎn)明顯升高，高峰在第14天，之后稍降，但明顯高于對(duì)照組，差異顯著(P＜ 0.05)，但模型組和溶劑組2組間各時(shí)點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。OA組的TNF-α含量比模型組均低(P＜0.05)。模型組和OA組大鼠血清中TNF-α在第14天明顯高于第28、56天，見表2。

表2　矽肺大鼠血清中TNF-α含量的變化Table 2.The serum content of TNF-α in the rats with silicosis (ng/L.Mean±SD.n=5)

4肺組織中總膠原蛋白含量

模型組和溶劑組肺組織中總膠原蛋白含量比同

期對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，但模型組和溶劑組同時(shí)點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。OA組與模型組和溶劑組相比，總膠原含量明顯下降(P＜0.05)，見表3。

表3　矽肺大鼠肺組織中總膠原蛋白含量的變化Table 3.The content of collagen in the lung of rats with silicosis (mg/g.Mean±SD.n=5)

5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織NF-κB表達(dá)

對(duì)照組大鼠肺組織中NF-κB表達(dá)量各時(shí)點(diǎn)無明顯差異(P＞0.05)。模型組和溶劑組大鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)量逐漸升高，于第28天達(dá)高峰，各時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。OA組的NF-κB陽性表達(dá)趨勢(shì)與模型組相同，但明顯低于模型組而高于對(duì)照組(P＜0.05)，見圖2、表4。

討論

矽肺是由長(zhǎng)期吸入職業(yè)性粉塵(SiO2)引起的，肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的反復(fù)破壞、修復(fù)、重建和過度沉積，引起正常肺組織結(jié)構(gòu)破壞，病理表現(xiàn)為早期的肺泡炎和后期的肺纖維化。其中，SiO2啟動(dòng)肺泡巨噬細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)過氧化自由基反應(yīng)，使巨噬細(xì)胞受損，釋放許多活性因子引起肺部纖維化是矽肺的最直接原因［3］。

TNF-α是一重要的前炎癥介質(zhì)，主要由激活的肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，具有廣泛生物活性，與肺纖維化和間質(zhì)性炎癥有關(guān)。在大鼠矽肺實(shí)驗(yàn)早期，TNF-α在血清中含量明顯增加［4］，TNF-α mRNA表達(dá)也明顯增高［5］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在矽肺模型第14天達(dá)高峰，之后稍降，但仍高于對(duì)照組，維持在較高水平，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。TNF-α在肺纖維化早期階段具有重要作用。它可增加中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的功能，并刺激其產(chǎn)生超氧化物，釋放溶酶體酶，對(duì)其周圍組織細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，它還可介導(dǎo)其它細(xì)胞因子和炎癥因子的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖并分泌大量的膠原。NF-κB是一種多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛的生物活性。在肺纖維化中，NF-κB通過調(diào)控多種細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子、炎癥介質(zhì)、蛋白質(zhì)酶等基因的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)了肺泡炎和肺纖維化。王世鑫等［6］的實(shí)驗(yàn)說明，TNF-α和NF-κB共同參與了SiO2粉塵致肺纖維化的病理過程。

Figure 2.The protein expression of NF-κB in the lung tissues with immunohistochemical staining.Scale bar=100 μm.圖2各組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)

表4　 SP法檢測(cè)肺組織NF-κB表達(dá)結(jié)果Table 4.The protein expression of NF-κB in the lung of the rats with silicosis (Mean±SD.n=5)

OA在自然界分布十分廣泛，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，以游離形式或與糖結(jié)合形式存在于約60個(gè)科190種植物中，如人參、甘草、丁香、女貞子、三七等，尤其我國是提取OA的重要原料國家［7］。OA具有消炎、增強(qiáng)免疫、抑制血小板降集、降糖等多方面的臨床藥理作用，還具有護(hù)肝、抗高血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗腫瘤等生物活性，是治療急性黃膽型肝炎和慢性病毒性肝炎比較理想的藥物，且毒性低副作用少［8］。目前國內(nèi)有齊墩果酸片、藏茵陳膠囊等產(chǎn)品應(yīng)用于臨床［9］。但OA在肺纖維方面的研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OA可以明顯抑制血清TNF-α含量和肺組織NF-κB表達(dá)。已有實(shí)驗(yàn)報(bào)道［10］鹿角草中分離得到的OA，通過抑制NF-κB的激活，下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎性細(xì)胞因子表達(dá)，抑制一氧化氮和前列腺素等炎癥介質(zhì)生成。Martín等［11］報(bào)道OA通過對(duì)Thl/Th2的調(diào)控，抑制炎性細(xì)胞因子和化學(xué)因子表達(dá)，提高抗炎細(xì)胞因子表達(dá)。OA似乎是阻斷NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)炎性細(xì)胞因子和誘生型炎癥介質(zhì)合成酶表達(dá)，抑制炎癥介質(zhì)生成。在單核細(xì)胞，齊墩果酸類似物可以作為抑制劑，抑制TNF-α、IL-1β產(chǎn)生［12］。

ECM在肺組織內(nèi)過多沉積是肺纖維化的主要特征。膠原蛋白是ECM主要蛋白，構(gòu)成了肺組織的主要骨架;羥脯氨酸是膠原分解代謝的產(chǎn)物，機(jī)體內(nèi)的羥脯氨酸主要存在膠原中，因此，羥脯氨酸測(cè)定是反映膠原含量的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過羥脯氨酸測(cè)定、肺組織形態(tài)學(xué)觀察、肺臟器系數(shù)變化說明大鼠矽肺模型造模成功，而OA可以明顯減輕這些變化，提示OA具有減緩矽肺纖維化的作用，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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通訊作者△Tel: 0315-8114064; E-mail: leizi19760728@ sina.com

*［基金項(xiàng)目］河北省中醫(yī)藥管理局課題(No.2014059) ;河北省衛(wèi)生計(jì)生委課題(No.ZD20140450)

［收稿日期］2014-11-26

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1081-06

［中圖分類號(hào)］R135.2; R363.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.020