芬太尼聯(lián)合丙泊酚對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

溫文++++++郭光偉++++++黃志剛++++++孫國(guó)棟++++++李曉輝

[摘要] 目的 探討芬太尼聯(lián)合丙泊酚作用于大鼠肺缺血再灌注損傷(I／R)模型后，對(duì)核因子-κB（nuclear factor-κB）表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法 將40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組（n=8）：假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注損傷組（I/R組）、芬太尼干預(yù)組（F 組）,丙泊酚干預(yù)組（P 組），芬太尼聯(lián)合丙泊酚干預(yù)組（F+P組）。對(duì)大鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?；檢測(cè)大鼠肺組織濕/干（W/D）值；對(duì)大鼠肺組織進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)及HE染色后鏡下病理學(xué)觀察，采用免疫組化法測(cè)定大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平的變化。 結(jié)果 與I/R組比較，F(xiàn)組、P組以及F+P組大鼠肺組織核因子-κB表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；大鼠動(dòng)脈血PaO2值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；大鼠肺組織W/D值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。I/R組肺毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡間質(zhì)水腫并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞滲出。假手術(shù)組（S組）、芬太尼干預(yù)組(F 組),丙泊酚干預(yù)組（P 組），芬太尼聯(lián)合丙泊酚干預(yù)組(F+P組)在肺泡結(jié)構(gòu)較完整性，減輕肺間質(zhì)及肺泡腔滲出、水腫肺組織保護(hù)方面均較I/R組明顯減輕。 結(jié)論 芬太尼聯(lián)合丙泊酚干預(yù)可顯著減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，可能是芬太尼聯(lián)合丙泊酚能降低大鼠肺組織NF-κB水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 芬太尼；丙泊酚；核因子-κB；缺血再灌注損傷

[中圖分類號(hào)] R614[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701（2014）15-0010-04

Protective effects of fentanyl combined with propofol on pulmonary ischemia reperfusion injury in rats

WEN Wen GUO Guangwei HUANG Zhigang SUN Guodong LI Xiaohui

Department of Cardiothoracic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Objective To study the expression of nuclear factor-κB(NF-κB) in the lung and plasma separately and explore the possible mechanisms of fentanyl combine with propofol on lung ischemia-reperfusion injury of rats. Methods The 40 Wistar male rats weighing 220 ～ 270 g were divided randomly into five groups which were pretreated differently. The values of NF-κB in rats lung was detected by using immunohistochemical method, the lung tissue observed in vitro and under the microscope after HE staining， the rats arterial oxygen pressure and the lung tissue W / D ratio were measured in each group. Results Compared with the I / R group, the F group, the P group, and the F+P group all followed the same trend: the NF-κB expression levels were obviously lower (P＜0.01), the values of PaO2 were obviously higher(P＜0.01), and the W / D ratios were lower(P＜0.01). Conclusion Fentanyl combined with propofol can significantly reduce lung ischemia-reperfusion injury, it may be that fentanyl combined with propofol can reduce the level of NF-κB in rats lung.

[Key words] Fentanyl; Propofol ; Nuclear factor-κB ; Ischemia reperfusion injury缺血再灌注常發(fā)生在組織器官缺血后恢復(fù)血供，如休克時(shí)微循環(huán)的疏通、冠狀動(dòng)脈痙攣的緩解、溶栓療法等血管再通術(shù)后、心臟驟停后心腦肺復(fù)蘇、 PTCA、動(dòng)脈搭橋術(shù)、心臟外科體外循環(huán)術(shù)、器官移植及斷肢再植等，對(duì)心、腦、腸、肝的缺血再灌注損傷的研究較多，而肺缺血再灌注損傷相對(duì)較少。有報(bào)道稱，NF-κB 的激活能調(diào)節(jié)多種炎性因子基因的表達(dá)，與免疫反應(yīng)有關(guān)[1]。隨著對(duì)芬太尼及丙泊酚研究的深入發(fā)現(xiàn)，芬太尼及丙泊酚可抑制NF-κB的過(guò)度產(chǎn)生，從而起到減輕組織器官缺血/再灌注損傷的作用。然而目前關(guān)于芬太尼以及丙泊酚二者單獨(dú)使用對(duì)急性肺缺血再灌注損傷的保護(hù)效果如何以及聯(lián)合應(yīng)用在急性肺缺血再灌注損傷中是否優(yōu)于單純使用芬太尼或丙泊酚尚不清楚。本文通過(guò)檢測(cè)肺組織中NF-κB表達(dá)水平，及芬太尼聯(lián)合丙泊酚對(duì)NF-κB表達(dá)水平的影響，旨在探討芬太尼及丙泊酚在肺缺血再灌注損傷中對(duì)肺組織保護(hù)的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑

丙泊酚注射液（北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司），芬太尼注射液（宜昌人福藥業(yè)有限公司），兔 NF-κBp65抗體（武漢博士德生物工程有限公司），SA1022-兔IgG型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與模型建造

1.2.1 分組 8周齡健康雄性Wistar大鼠40只，體重220～270 g，隨機(jī)分為5組，每組8只。

1.2.2 造模 改良的Eppinger法建造在體大鼠肺缺血再灌注引起的急性肺損傷模型。25%烏拉坦按4 mL/kg腹腔注射麻醉，頸部游離右頸動(dòng)脈及氣管后氣管插管，接呼吸機(jī)，通氣頻率為75次/min，潮氣量為10 mL，吸呼比為1∶2，機(jī)械通氣10min待動(dòng)物情況穩(wěn)定后，左側(cè)第5肋間進(jìn)胸，創(chuàng)面止血徹底后固定開胸器，用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉左肺門。夾閉肺門前，應(yīng)仔細(xì)游離左肺門并將左下肺韌帶離斷，尾緣靜脈注射50 U肝素 5min。關(guān)胸30 min后開放血管夾行缺血后復(fù)流60min。缺血再灌注組(I/R組)僅阻斷左肺門30 min；芬太尼治療組（F組）阻斷左肺門前給予20 μg/kg芬太尼，之后阻斷30min；丙泊酚治療組（P組）阻斷左肺門前給予50mg/kg丙泊酚，之后阻斷肺門30 min；芬太尼聯(lián)合丙泊酚組（F+P組），給予20 μg/kg芬太尼以及50mg/kg丙泊酚后阻斷左肺門30 min。前四組阻斷肺門并執(zhí)行相關(guān)操作后關(guān)胸。假手術(shù)組（S組）僅開放胸腔一段時(shí)間（與其余四組時(shí)間相同）。再灌注完畢后，經(jīng)頸動(dòng)脈取血0.5 mL進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?，頸椎脫臼處死大鼠后取左肺下葉進(jìn)行肺濕/干（wet/dry，W/D）值檢測(cè)，取左肺上葉石蠟包埋并切片，每只大鼠切片兩張，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色病理學(xué)觀察以及免疫組化檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1肺組織濕/干（wet/dry，W/D）值的計(jì)算測(cè)定并記錄處死后大鼠的左肺下半葉肺組織濕重（W），置于60℃恒溫烘箱中烘烤 48 h至恒重，測(cè)定并記錄干重（D），求得二者比值即為濕/干重（W/D）值。

1.3.2動(dòng)脈血?dú)夥治龈鹘M大鼠處死前經(jīng)頸動(dòng)脈取動(dòng)脈血0.5 mL，測(cè)定PaO2 值。通過(guò)PaO2值變化反應(yīng)肺氣體交換情況，進(jìn)一步判斷肺缺血再灌注損傷情況，是反應(yīng)肺功能的重要指標(biāo)。

1.3.3肺組織病理形態(tài)觀察大鼠左肺上葉HE染色，取大鼠左肺上葉放入4% 甲醛中固定、石蠟包埋、每只大鼠切片兩張，分別進(jìn)行HE染色病理學(xué)分析及免疫組化檢測(cè)。將肺組織HE染色后，光鏡下觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4肺組織中核因子-κB表達(dá)水平的檢測(cè)免疫組化 SABC法測(cè)定大鼠左上葉肺組織 NF-κB表達(dá)水平的變化。按說(shuō)明書操作，取石蠟片按程序脫蠟至水，滅活內(nèi)源性酶、熱抗原修復(fù)、BSA 封閉、滴加的一抗陰性對(duì)照以PBS為一抗、滴加二抗（1∶100稀釋生物素化山羊抗兔 IgG）、滴加 SABC后，加 DAB試劑盒（AR1022試劑盒中 A、B、C 試劑各 1 滴），室溫顯色。蘇木素復(fù)染，脫水、透明、干燥、樹脂封片。以胞漿及胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，鏡下放大 400倍，隨機(jī)選取不重疊的10個(gè)視野，使用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算出每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比并取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行處理，測(cè)定結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t方法檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠肺組織濕/干質(zhì)量（wet/dry mass，W/D）值的計(jì)算

I/R組水腫較明顯，與I/R組相比，S組、F組、P組和F+P組的W/D值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01）；單藥組F組與P組W/D值比較無(wú)顯著差異 （P>0.05）；聯(lián)合用藥組F+P組與單藥組F組或P組分別比較W/D值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01）,見表1。

2.2各組大鼠PaO2的變化情況

I/R組PaO2值明顯降低，與I/R組相比，S組、F組、P組和 F+P組的PaO2值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F組與P組PaO2值比較無(wú)顯著差異（P>0.05）；F組或P組與F+P組分別比較，PaO2值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

2.3大鼠肺組織病理學(xué)觀察

S組大鼠肺組織病理學(xué)改變不明顯；與S組形成對(duì)比，I/R組大鼠肺組織間質(zhì)毛細(xì)血管出現(xiàn)淤血、擴(kuò)張現(xiàn)象，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)水腫，肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)大量的紅細(xì)胞和液體以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)滲出，呈現(xiàn)出嚴(yán)重病理改變；F組和P組大鼠肺間質(zhì)及肺泡滲出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較I/R組輕。聯(lián)合用藥組F+P組大鼠肺組織改變較單藥組情況更好。

2.4 NF-κB在肺組織免疫組化處理之后表達(dá)分布以及表達(dá)水平

S組（圖1）可見淺棕黃色染色弱陰性顆粒，極少量分布于炎性細(xì)胞及肺泡上皮的胞漿中，胞核中極少有陽(yáng)性表達(dá)；I/R組（圖2）不僅大量炎性細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的胞漿中分布有較強(qiáng)棕黃色染色顆粒，細(xì)胞核中也出現(xiàn)了較強(qiáng)棕黃色顆粒；F組（圖3）和P組（ 圖4）炎性細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞的胞漿及胞核中較多的分布有棕黃色染色顆粒；F+P組（圖5）棕黃色染色顆粒較F組及P組少的分布于炎性細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞的胞漿之中。

圖1 S組再灌注60 min NF-κB免疫組化染色（×100） 染色顆粒分布于細(xì)胞漿，與I/R組比較NF-κB的表達(dá)量很少

圖2 I/R組再灌注60min NF-κB免疫組化染色（×100） 染色顆粒分布于細(xì)胞漿，NF-κB大量表達(dá)

圖3 F組再灌注60min NF-κB免疫組化染色（×100） 染色顆粒分布于細(xì)胞漿，與I/R組比較NF-κB的表達(dá)量減少

圖4 P組再灌注60min NF-κB免疫組化染色（×100） 棕黃色染色顆粒分布于細(xì)胞漿，與I/R組比較NF-κB的表達(dá)量減少

圖5 P+F組再灌注60min NF-κB免疫組化染色（×100） 棕黃色染色顆粒分布于細(xì)胞漿，與I/R組比較NF-κB的表達(dá)量明顯減少

肺缺血再灌注后，與I/R組比較，S組、F組、P組以及F+P組NF-κB表達(dá)水平明顯下降 ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F組與P組比較，NF-κB表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）；F+P組與F組、P組分別進(jìn)行比較，NF-κB表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）,見表1。

表1 各組別肺組織W/D值、Pa02值（mmHg）、NF-κB變化

（x±s，n=8,％）

注：I/R組W/D值、PaO2值、NF-κB變化與其余各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）; F組與P組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

3 討論

核因子-κB（NF-κB）是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的、從免疫B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，活化后能夠參與許多基因表達(dá)的調(diào)控，在基因水平對(duì)多種炎癥因子的激活發(fā)揮著重要作用。典型的NF-κB是由p65和p50單體構(gòu)成的異源性二聚體。 NF-κB含有一段負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合、二聚體化和核轉(zhuǎn)位，同時(shí)也是抑制蛋白IκB（inhibitor of NF-kappa B）的結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域，由300個(gè)氨基酸構(gòu)成，稱為Rel同源區(qū)。在未受到胞外因素刺激時(shí)， NF-κB與IκB結(jié)合并以結(jié)合型NF-κB的非活性異寡聚體的狀態(tài)存在于細(xì)胞核外。組織細(xì)胞外多種損傷因素，如IL-1、TNF-α、氧自由基、內(nèi)毒素、病毒蛋白、生長(zhǎng)因子以及缺血再灌注損傷、氣壓傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷等因素的刺激可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)引起IκB降解，從而導(dǎo)致NF-κB-IκB復(fù)合物解體，活化的NF-κB進(jìn)入核內(nèi)，并與DNA鏈上特定的κB序列特異性結(jié)合，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)眾多與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[2]，加速有關(guān)基因編碼的趨化因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子、炎癥相關(guān)的凋亡抑制因子以及酶和抑制劑等的表達(dá)[3]。NF-κB通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，對(duì)細(xì)胞因子之間產(chǎn)生廣泛作用[4]，從而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生一系列正反饋級(jí)聯(lián)放大的炎癥損傷反應(yīng),從而導(dǎo)致肺缺血再灌注損傷[5]。因此，檢測(cè)大鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)水平，可能反映肺損傷炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱程度以及評(píng)價(jià)藥物使用干預(yù)的治療效果。

芬太尼作為阿片受體激動(dòng)劑，作用于邊緣系統(tǒng)與情緒有關(guān)的阿片類受體，有消除緊張和焦慮的作用。由于具有鎮(zhèn)痛效價(jià)高、降低心肌氧耗及無(wú)組胺釋放的優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于手術(shù)前誘導(dǎo)、術(shù)中維持以及術(shù)后的鎮(zhèn)靜與鎮(zhèn)痛，已基本取代嗎啡。近來(lái)發(fā)現(xiàn)芬太尼預(yù)處理缺血再灌注器官對(duì)NF-κB表達(dá)能有降低的作用。芬太尼是一種與嗎啡結(jié)構(gòu)類似的同類鎮(zhèn)痛藥，結(jié)合嗎啡對(duì)NF-κB的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)通過(guò)阿片類受體實(shí)現(xiàn)[6]，引起與缺血預(yù)適應(yīng)類似的作用[7]，因此推斷芬太尼也可能通過(guò)影響NF-κB的活性而發(fā)揮抑制缺血再灌注損傷的作用。劉志恒[8]等通過(guò)使用芬太尼處理人T 淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat 細(xì)胞，檢測(cè)出Jurkat 細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)有所降低。