維生素C提高體外培養(yǎng)的去分化脂肪細(xì)胞心肌分化效率*

李福海，李宗莊，蔣　智，易　韋，張陳勻△(貴州省心血管病研究所，貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，病理科，貴州貴陽　55000)

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維生素C提高體外培養(yǎng)的去分化脂肪細(xì)胞心肌分化效率*

李福海1，2，李宗莊1，2，蔣智1，2，易韋3，張陳勻1，2△
(1貴州省心血管病研究所，貴州省人民醫(yī)院2心內(nèi)科，3病理科，貴州貴陽550002)

［摘要］目的:采用維生素C處理體外培養(yǎng)的去分化脂肪(dedifferentiated fat，DFAT)細(xì)胞，以期進(jìn)一步提高DFAT細(xì)胞的心肌分化效率。方法:用天花板貼壁培養(yǎng)法使大鼠成熟脂肪細(xì)胞去分化為DFAT細(xì)胞，并體外培養(yǎng)增殖至第3代，然后在培養(yǎng)基中添加維生素C或(和)乳鼠心臟細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞心肌分化。3周后，用倒置相差顯微鏡觀察DFAT細(xì)胞的形態(tài)變化，用real-time PCR、免疫熒光和Western blot檢測DFAT細(xì)胞的心肌特異性標(biāo)志物cTnT、GATA-4及NKx2.5 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果:大鼠脂肪細(xì)胞經(jīng)天花板貼壁培養(yǎng)后形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞樣的DFAT細(xì)胞。DFAT細(xì)胞在普通培養(yǎng)條件下可自發(fā)表達(dá)少量心肌特異性標(biāo)志物。經(jīng)乳鼠心臟細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)后，DFAT細(xì)胞體積增大、變長，可見肌管樣結(jié)構(gòu)，cTnT、GATA-4及NKx2.5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較普通培養(yǎng)的DFAT細(xì)胞顯著升高。在維生素C的作用下，DFAT細(xì)胞cTnT、GATA-4及NKx2.5的表達(dá)水平進(jìn)一步升高。未觀察到自發(fā)性搏動(dòng)細(xì)胞。結(jié)論:維生素C可促進(jìn)DFAT細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞。

［關(guān)鍵詞］去分化脂肪細(xì)胞;維生素C;乳鼠心臟細(xì)胞裂解液;誘導(dǎo)分化

［修回日期］2015-02-09

Vitamin C enhanced myocardial differentiation of dedifferentiated fat cells

LI Fu-hai1，2，LI Zong-zhuang1，2，JIANG Zhi1，2，YI Wei3，ZHANG Chen-yun1，2
(1Guizhou Institute for Cardiovascular Disease，2Department of Cardiology，3Department of Pathology，Guizhou Province People＇s Hospital，Guiyang 550002，China.E-mail: cyzhang5828@163.com)

［ABSTRACT］AIM: In order to observe the myocardial differentiation capacity of the dedifferentiated fat (DFAT) cells treated with vitamin C in vitro.METHODS: DFAT cells were dedifferentiated from the mature rat adipocytes with ceiling adherent culture.The DFAT cells of passage 3 were used in the study.Vitamin C and/or neonatal rat heart tissue lysate were added into the culture medium to induce myocardial differentiation for 3 weeks.The cell morphology was observed under microscope.The myocardial-specific markers，such as cTnT，GATA-4 and NKx2.5，were examined by the methods of immunofluorescence，PCR and Western blot.RESULTS: Mature rat adipocytes dedifferentiated into fibroblastlike DFAT cells after ceiling adherent culture.The DFAT cells spontaneously differentiated into cardiomyocyte-like cells under normal culture condition with a low incidence.After treated with neonatal rat heart cell lysate，the DFAT cells became cardiomyocyte-like cells that had bigger size，longer shape and myotubule-structure.The expression of cTnT，GATA-4 and NKx2.5 was remarkably increased at both mRNA and protein levels as compared with the normal cultured DFAT cells.The expression of cTnT，GATA-4 and NKx2.5 was further increased in DFAT cells after treating with vitamin C.No spontaneous beating cell was observed.CONCLUSION: Vitamin C enhances the differentiation of DFAT cells into cardiomyocyte-like cells.

［KEY WORDS］Dedifferentiated fat cells; Vitamin C; Neonatal rat heart cell lysate; Induced differentiation

急性心肌梗死已成為嚴(yán)重危害我國人民生命健康的重要疾?。?］。雖然藥物及介入治療有了長足進(jìn)展［2］，但這些方法不能再生心肌以代償損失心肌的收縮力，限制了心功能的恢復(fù)。因此，心肌梗死患者最終難以避免的發(fā)展為充血性心力衰竭。干細(xì)胞可以分化為其它成熟細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等［3-5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植到心臟梗死區(qū)可分化為心肌細(xì)胞以代償心肌收縮力，改善心梗后心功能［6-8］，為心肌梗死的治療提供了新思路。胚胎干細(xì)胞、骨骼成肌細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等種子細(xì)胞已經(jīng)有廣泛研究，但因來源有限、取材不便、免疫排斥、分化方向難以調(diào)控、心肌分化效率低、腫瘤形成等問題，使這些種子細(xì)胞難以廣泛應(yīng)用于臨床，并且臨床療效不明確［9］。最近Matsumoto等［10］報(bào)道成熟脂肪細(xì)胞經(jīng)天花板培養(yǎng)去分化后轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂卸嘞蚍只瘽撃艿娜シ只?dedifferentiated fat，DFAT)細(xì)胞。DFAT細(xì)胞具有取材方便、增殖能力強(qiáng)［11］、免疫原性低［10］、表型穩(wěn)定［10］等特點(diǎn)，其在體外可分化為具有收縮功能的心肌細(xì)胞［12］，是自體移植的理想種子細(xì)胞，可避免上述干細(xì)胞所面臨的重重困難。如何提高細(xì)胞的心肌分化效率是今后細(xì)胞臨床應(yīng)用的重要問題之一。Behfar等［13］研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌分化能力越強(qiáng)，移植治療心肌梗死小鼠的療效越好，維生素C可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞［14］、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞［15-16］、羊水干細(xì)胞［17］向心肌分化，但對DFAT細(xì)胞的作用尚無研究。通過本實(shí)驗(yàn)，我們首次報(bào)道在乳鼠心臟細(xì)胞裂解液(neonatal rat heart cell lysate，NRHCL)體外模擬心肌微環(huán)境的誘導(dǎo)條件下，維生素C對細(xì)胞心肌分化效率的作用。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6周齡的雄性Sprague Dawley (SD)大鼠及出生24 h內(nèi)的SD乳鼠，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級標(biāo)準(zhǔn)。

2實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.1成熟脂肪細(xì)胞的分離及去分化培養(yǎng)4～6周齡SD大鼠予腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)誘導(dǎo)麻醉，在無菌條件下取出腹股溝處皮下脂肪組織，剪碎后加0.1% I型膠原酶(Sigma)，在37℃恒溫水浴箱振蕩消化45 min，加含20%胎牛血清(HyClone)的高糖DMEM(HyClone)終止消化，細(xì)胞濾篩過濾，將濾液1 000 r/min離心5 min。收集懸浮于最上層的成熟脂肪細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，用完全培養(yǎng)基(含20%胎牛血清的高糖DMEM)充滿培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行天花板培養(yǎng)(37℃、5% CO2、飽和濕度)。用倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。7 d后可見脂肪細(xì)胞牢固貼于培養(yǎng)瓶底，翻正培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)液，每2天更換4 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞吐出脂滴由圓形變?yōu)殚L梭形說明脂肪細(xì)胞已去分化為DFAT細(xì)胞。當(dāng)生長融合達(dá)70%～80%時(shí)，可傳代培養(yǎng)，取第3～6代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2乳鼠心臟細(xì)胞裂解液的制備將出生24 h內(nèi)的SD乳鼠斷頸處死，迅速取出心臟，放入預(yù)先置于冰上的PBS液中去除心房、血管及結(jié)締組織，用PBS液清洗3次后，將心室肌充分剪碎，加入含0.1%胰酶和0.1%I型膠原酶的消化液，在37℃培養(yǎng)箱振蕩消化，吸管吹打、靜置后，吸取上層細(xì)胞懸液加入完全培養(yǎng)基中吹打混勻。如此重復(fù)消化5～6次直至組織塊消化完全。將收集的細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心10 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸為2×109/L，于－70℃、4℃反復(fù)凍融3次獲得心臟細(xì)胞裂解液，最后以3 000 r/min離心10分鐘，用0.22 μm的濾器過濾后備用。

2.3體外誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞向心肌細(xì)胞方向分化3 ～6代DFAT細(xì)胞制成5×108/L單細(xì)胞懸液接種于6孔板，待48 h細(xì)胞完全貼壁后，將完全培養(yǎng)基分別換為NRHCL、含10－4mol/L維生素C(Sigma)的完全培養(yǎng)基或含10－4mol/L的維生素C的NRHCL誘導(dǎo)心肌分化，每天換液1次，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照。

2.4誘導(dǎo)后DFAT細(xì)胞的免疫熒光檢測取上述誘導(dǎo)心肌分化3周后的DFAT細(xì)胞制成細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100透膜20 min，10%封閉血清封閉30 min，用1∶200小鼠抗大鼠心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT; Santa Cruz)，4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，用1∶100 FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(博士德公司) 37℃避光孵育1 h，抗淬滅劑封片，用熒光顯微鏡觀察并采集圖像，每個(gè)爬片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野拍攝照片，計(jì)數(shù)視野內(nèi)cTnT陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算cTnT陽性細(xì)胞百分比。

2.5 Real-time PCR檢測誘導(dǎo)后DFAT細(xì)胞心肌特異性標(biāo)記物NKx2.5、GATA-4和cTnT的mRNA表達(dá)

采用RNA提取試劑盒(康為世紀(jì))提取誘導(dǎo)3周后上述4組細(xì)胞的總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR，PCR條件為: 50℃2 min，95℃10 min;95℃15 s、60℃1 min行40個(gè)循環(huán)。ABI Step One Plus型熒光定量PCR儀采集待測基因及內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號，以Applied Biosystems SDS 1.4軟件進(jìn)行熒光收集和資料分析。SDS 1.4軟件分析其ΔΔCt值及熒光相對值(relative quantity，RQ)值，RQ=2－ΔΔCt。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

2.6誘導(dǎo)后DFAT細(xì)胞心肌特異性蛋白表達(dá)水平的Western blot檢測提取試劑盒(上海生工)提取誘導(dǎo)3周后的上述4組細(xì)胞的總蛋白，BCA法行蛋白定量后，上樣、SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶至PVDF膜上，封閉液室溫封閉PVDF膜1 h，加I抗(1∶500)和II抗(1∶2 000)孵育后曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Bandscan軟件分析條帶像素灰度值。以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算各組待測目標(biāo)蛋白條帶與β-actin蛋白條帶總灰度的百分比值作為待測目標(biāo)蛋白表達(dá)的相對水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上各部分實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4次，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)行單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1成熟脂肪細(xì)胞去分化為DFAT細(xì)胞

培養(yǎng)2 d后，成熟大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)含折光性高的單個(gè)圓形脂滴，漂浮于培養(yǎng)瓶頂壁，3～4 d后可見胞質(zhì)中的單個(gè)圓形脂滴分裂成多個(gè)小脂滴，胞質(zhì)向周圍伸展，細(xì)胞由圓形變成橢圓形，胞質(zhì)外可見細(xì)小的脂滴顆粒聚集，細(xì)胞突起延長，形成類似觸角樣結(jié)構(gòu)。脂滴繼續(xù)裂解變小，5～6 d后可見細(xì)胞逐漸脫去脂滴，形態(tài)變?yōu)椴缓位騼H含少量脂滴的長梭形，并可觀察到細(xì)胞分裂增殖。10 d后細(xì)胞已完全脫去脂滴，生長融合，去分化為成纖維樣的DFAT細(xì)胞。細(xì)胞增殖第3～6代后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，見圖1。

Figure 1.The morphological transformation of the mature rat adipocytes to DFAT cells during ceiling adherent culture.圖1大鼠脂肪細(xì)胞經(jīng)天花板培養(yǎng)去分化為DFAT細(xì)胞的形態(tài)變化

2 DFAT細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后的形態(tài)變化

誘導(dǎo)1周后，細(xì)胞胞體伸展，呈長梭形，體積增大、形態(tài)變長。誘導(dǎo)2周后細(xì)胞生長旺盛，增殖明顯，細(xì)胞排列多趨于一致、平行生長，多數(shù)細(xì)胞伸出分支狀突起，并相互連接，呈聚集生長，上述現(xiàn)象在含維生素C的NRHCL組比單獨(dú)維生素C和NRHCL組更明顯。誘導(dǎo)3周后胞體更加飽滿，立體感增強(qiáng)，細(xì)胞間相互連接增多形成細(xì)胞簇，可觀察到肌管樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)近似于心肌，但均未觀察到有發(fā)跳動(dòng)的細(xì)胞，見圖2。

3誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞的cTnT免疫熒光檢測

細(xì)胞免疫熒光檢測顯示:誘導(dǎo)3周后，維生素C組、NRHCL組和含維生素C的NRHCL組均可觀察到心肌特異性標(biāo)志物cTnT陽性細(xì)胞;這些細(xì)胞輪廓清楚，cTnT定位于細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)FITC標(biāo)記后在熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光。對照組僅見非特異性著色，見圖3。

Figure 2.The morphological transformation of the DFAT cells after inducing myocardial differentiation(×300).圖2 DFAT細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后的形態(tài)變化

Figure 3.The cTnT expression (green) in DFAT cells after 3weeks of inducing myocardial differentiation (×200).圖3誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞cTnT的表達(dá)

4誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞中心肌特異性標(biāo)志物的表達(dá)

4.1誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞中cTnT mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與對照組相比，經(jīng)誘導(dǎo)處理3周后維生素C組和NRHCL組和含維生素C的NRHCL組細(xì)胞中cTnT mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(P＜0.05)，且含維生素C的NRHCL組細(xì)胞中cTnT mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于維生素C組和NRHCL組(P＜0.05)。NRHCL組cTnT mRNA表達(dá)水平高于維生素C組(P＜0.05)，但維生素C組、NRHCL組間cTnT蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

4.2誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞中GATA-4的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與對照組相比，維生素C組、NRHCL組和含維生素C的NRHCL組細(xì)胞中GATA-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(P＜0.05)，含維生素C的NRHCL組中GATA-4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于維生素C組和NRHCL組(P＜0.05)。且NRHCL組GATA-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于維生素C組(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.The expression of cTnT in DFAT cells after 3 weeks of induced myocardial differentiation.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vitamin C group;△P＜0.05 vs NRHCL group.圖4誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞中cTnT mRNA和蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平

Figure 5.The expression of GATA-4 in the DFAT cells after 3 weeks of inducing myocardial differentiation.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vitamin C group;△P＜0.05 vs NRHCL group.圖5誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞中GATA-4的mRNA和蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平

4.3誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞中NKx2.5 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與對照組相比，維生素C組、NRHCL組和含維生素C的NRHCL組細(xì)胞中NKx2.5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均升高(P＜ 0.05)，含維生素C的NRHCL組中NKx2.5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于維生素C組和NRHCL組(P＜0.05)。維生素C組、NRHCL組間NKx2.5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。

Figure 6.The expression of NKx 2.5 in the DFAT cells after 3 weeks of inducing myocardial differentiation.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vitamin C group;△P＜0.05 vs NRHCL group.圖6誘導(dǎo)3周后DFAT細(xì)胞中NKx2.5的mRNA和蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平

討論

我們分離并培養(yǎng)大鼠成熟脂肪細(xì)胞，用天花板貼壁培養(yǎng)法使其去分化為DFAT細(xì)胞，通過心臟細(xì)胞裂解液模擬心肌微環(huán)境DFAT細(xì)胞可再分化為心肌樣細(xì)胞，表達(dá)cTnT、GATA-4和NKx2.5心肌細(xì)胞特異標(biāo)志，并且維生素C可進(jìn)一步促進(jìn)DFAT細(xì)胞的心肌分化。

DFAT細(xì)胞缺乏特異性標(biāo)志物，其鑒定基于培養(yǎng)初期脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及后期心肌特異性標(biāo)志物的檢測［10，12，18］。我們參照Sugihara等［19］的天花板貼壁培養(yǎng)法，使圓形透亮的大鼠成熟脂肪細(xì)胞去分化為類似成纖維細(xì)胞形態(tài)的DFAT細(xì)胞，在維生素C或(和)心臟細(xì)胞裂解液作用下形態(tài)進(jìn)一步發(fā)生轉(zhuǎn)變，并表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持Matsumoto等［10］的研究，充分說明細(xì)胞不僅可以自我增殖，還具有心肌分化潛能。

干細(xì)胞移植治療心肌梗死的臨床實(shí)驗(yàn)均采用自體干細(xì)胞移植策略［20］，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被廣泛研究［21-22］。骨髓成分復(fù)雜，間充質(zhì)干細(xì)胞僅占所有骨髓細(xì)胞的0.01%［23］，為獲取足量骨髓常需多點(diǎn)骨髓穿刺，創(chuàng)傷較大，且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力較弱，擴(kuò)增時(shí)間較長，體外心肌分化效率不高。相比之下，細(xì)胞具有的特殊優(yōu)勢一是來源豐富，100 mg的脂肪組織至少可獲得3×106個(gè)原代細(xì)胞［24］，且脂肪組織經(jīng)微創(chuàng)抽脂技術(shù)反復(fù)取材，患者更容易接受;二是細(xì)胞純度高，原代細(xì)胞的純度高達(dá)99.9%［12］，體外培養(yǎng)時(shí)即呈現(xiàn)較強(qiáng)的心肌分化能力［25］。三是對供者年齡要求較低，據(jù)報(bào)道4～81歲供者的成熟脂肪細(xì)胞均可在體外培養(yǎng)中去分化為細(xì)胞［24］。根據(jù)細(xì)胞上述優(yōu)勢，可預(yù)先在體外定向分化為心肌前體細(xì)胞或心肌細(xì)胞，再移植修復(fù)梗死心肌，可有效克服骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在的問題。

干細(xì)胞的心肌分化由BMP、Wnt、Ras-Raf-MPAK、FGF等信號通路共同形成的復(fù)雜的三維多重生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)所調(diào)控［26］。乳鼠心臟細(xì)胞裂解液可以體外模擬心肌生長微環(huán)境［27-28］，最大限度地重現(xiàn)了心肌定向分化生長的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)環(huán)境，促使細(xì)胞心肌分化，但究竟是哪些成分有效目前尚無相關(guān)報(bào)道。心臟細(xì)胞裂解液的制備需反復(fù)凍融，我們推測可能是其中比較穩(wěn)定的小分子物質(zhì)，如microRNA。但microRNA家族龐大，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，我們尚未進(jìn)行該方向的研究。

除心臟細(xì)胞裂解液外，誘導(dǎo)干細(xì)胞心肌分化的方法還有用化學(xué)試劑、細(xì)胞因子誘導(dǎo)、物理因素誘導(dǎo)、用基因工程技術(shù)干擾基因表達(dá)等。其中化學(xué)試劑如5-氮胞苷、DMSO等誘導(dǎo)效率低，且有細(xì)胞毒性，同樣對人體有害，限制了臨床應(yīng)用;而細(xì)胞因子常需多種細(xì)胞因子組合多個(gè)時(shí)點(diǎn)聯(lián)合誘導(dǎo)［29］，且價(jià)格過于昂貴;物理因素誘導(dǎo)分化雖然效果確切，但設(shè)備技術(shù)要求高;基因工程技術(shù)存在潛在生物安全問題。維生素C是Takahashi等［14］從可應(yīng)用于人體且具有誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的880種分化誘導(dǎo)化合物中篩選而出，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞［14］、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞［15-16］、羊水干細(xì)胞［17］分化為心肌樣細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)首次證明了維生素C同樣可誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞心肌分化，維生素C的應(yīng)用避免了化學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性及基因工程技術(shù)潛在的生物安全隱患，同時(shí)，具有更好的經(jīng)濟(jì)效益，其機(jī)制可能與維生素C激活MEK-ERK1/2信號有關(guān)［15］。

我們體外誘導(dǎo)心肌分化的細(xì)胞可表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物，但均未觀察到自發(fā)的收縮活動(dòng)，我們稱這種轉(zhuǎn)分化的具有部分心肌細(xì)胞表型的細(xì)胞為心肌樣細(xì)胞，與Jumabay等［12］報(bào)道的有自發(fā)收縮的類心肌細(xì)胞不完全一致。我們推測心肌樣細(xì)胞的心肌分化程度較低，與細(xì)胞種屬來源、培養(yǎng)誘導(dǎo)分化條件等有關(guān)。

我們在國內(nèi)率先分離培養(yǎng)出DFAT細(xì)胞，盡管分化程度不高，但首次證明了維生素C可誘導(dǎo)細(xì)胞心肌分化，并且在心臟細(xì)胞裂解液體外模擬心肌微環(huán)境的條件下，可進(jìn)一步提高細(xì)胞的心肌分化效率。細(xì)胞來源廣泛、細(xì)胞純度高、增殖能力強(qiáng)、體外心肌分化效率高，是心肌再生治療中理想的自體移植的種子細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)研究為細(xì)胞的自體移植策略奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，如何進(jìn)一步提高細(xì)胞的心肌分化效率和分化程度是今后細(xì)胞臨床應(yīng)用的重要研究方向。

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通訊作者△Tel: 0851-5612525; E-mail: cyzhang5828@163.com

*［基金項(xiàng)目］貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(No.黔科合J字［2014］2112) ;貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(No.gzwkj2013-1-006)

［收稿日期］2014-10-08

［文章編號］1000-4718(2015)06-1130-07

［中圖分類號］R329.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.029